專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種可用于分離純化組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織型纖溶酶原激活劑是纖維蛋白溶解系統(tǒng)中與纖維蛋白溶解相關(guān)的一種重要 的絲氨酸蛋白酶類。它能將纖溶酶原激活為纖維蛋白溶解酶，即纖溶酶，被激活的纖溶酶 可催化溶解纖維蛋白，使血栓溶解。由于其特異性及內(nèi)源性使它被廣泛用于急性血栓栓塞 性疾病的臨床治療。目前，應(yīng)用基因工程的方法已可獲得組織型纖溶酶原激活劑突變體 (Val4-Cys261)，研究如何獲得低價(jià)、安全的組織型纖溶酶原激活劑有良好的應(yīng)用前景。親和層析是利用生物分子間專一的親和力進(jìn)行分離的一種層析方法。這種專一吸 附能力是由于共價(jià)偶聯(lián)在惰性載體上的物質(zhì)(配基)與待純化的物質(zhì)間專一、可逆的親和 力(包括靜電作用、氫鍵、疏水作用等)?？捎门浠怯H和層析的核心部分。用作親和層析配基分離純化組織型纖溶酶原激活劑的有苯甲脒及其衍生物，還有 基于組織型纖溶酶原激活劑與纖溶蛋白酶原結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的肽配基。一些研究通過由三、 四個(gè)氨基酸組成的小肽探索組織型纖溶酶原激活劑活性位點(diǎn)的親和性，已獲得肽配基如 QDES。此外還有根據(jù)組織型纖溶酶原激活劑與纖維蛋白的特異性結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的肽配基， 如GPRP，KKKK，KKKKGPRG ；通過組織型纖溶酶原激活劑與纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的配基，如 KCPGRVRVVGGC等。相對(duì)于仿生親和配基，肽配基具有高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，即使配基不慎脫落， 也不易造成機(jī)體中毒。我國(guó)的報(bào)道多涉及組織型纖溶酶原激活劑突變體研究，缺少分離純 化組織型纖溶酶原激活劑的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途， 可用于分離純化組織型纖溶酶原激活劑及其片段。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是該組織型纖溶酶原激活劑及其片段 的親和肽具有如下結(jié)構(gòu)X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨 酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述X5和X6之間設(shè)有一個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異 亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述X1X2X3X4X5X6X7的序列為選自SEQ ID Nos. 1至12中的任一 種。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述氨基酸殘基的序列為選自SEQ ID Nos. 13至46中的任一 種。
進(jìn)一步地，本發(fā)明用于分離純化或檢測(cè)組織型纖溶酶原激活劑或其片段。進(jìn)一步地，本發(fā)明通過將所述親和肽連接于固相支持物上以分離純化或檢測(cè)組織 型纖溶酶原激活劑或其片段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)本發(fā)明的親和肽對(duì)組織型纖溶酶原激活劑及其片段具有較強(qiáng)的親和性，因此 對(duì)組織型纖溶酶原激活劑及其片段有較好的分離純化效果。(2)本發(fā)明的親和肽包含七至八個(gè)氨基酸殘基，屬于小肽，穩(wěn)定性好，即使不慎脫 落也不易引起機(jī)體免疫反應(yīng)，有較好的安全性。(3)本發(fā)明的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的作用位點(diǎn)為其37環(huán)上帶正電的 殘基，因此本發(fā)明的親和肽也可與組織型纖溶酶原激活劑片段有特異性的相互作用，進(jìn)而 用于分離純化組織型纖溶酶原片段。


圖1為序列如SEQ ID No. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑結(jié)合示意圖；其中，1表示組織型纖溶酶原激活劑，2表示組織型纖溶酶原激活劑上與配基相吸 附的殘基，3表示序列如SEQ ID No. 1所示的親和肽。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 組織型纖溶酶原激活劑及其片段親和肽配基的設(shè)計(jì)本發(fā)明的親和肽采用分子動(dòng)力學(xué)方法，是以組織型纖溶酶原激活劑與纖溶酶原激 活物抑制劑作用位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。組織型纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活物抑制劑的三維結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (Pdb)。選取纖溶酶原激活物抑制劑的B鏈，其殘基序列如下所示=Met-Ala-Pr0-Glu-Glu-I Ie-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-His-Asn-Pro-Thr-Gly-Thr-Val-Le u-Phe-Met-Gly-Gln-Val-Met-Glu-Pro，以此三十三肽為親和肽，在常溫和水環(huán)境下對(duì)組織 型纖溶酶原激活劑進(jìn)行至少4ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，過程中讓親和肽與組織型纖溶酶原激 活劑自由吸附，計(jì)算體系接近平衡時(shí)該三十三肽與組織型纖溶酶原激活物的相互作用能大 小。其中兩個(gè)谷氨酸與天冬氨酸是該親和肽與組織型纖溶酶原激活物相互作用的主要位點(diǎn) (Lamba, D. etc.，J. Mol. Biol.，1996，258，117-135)，因此該三十三肽可簡(jiǎn)化為包含這三個(gè) 帶負(fù)電殘基的八肽片段Ala-Pro-Glu-Glu-IIe-IIe-Met-Asp作為親和肽，計(jì)算該八肽與組 織型纖溶酶原激活劑的相互作用能，比原三十三肽的親和性略高。因此以該八肽為模板，根 據(jù)親疏水性對(duì)帶負(fù)電殘基周圍的疏水基(X1X2X5X6位點(diǎn))進(jìn)行突變研究，突變的目標(biāo)氨基酸 殘基包括色氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸，從中選擇與組織型纖溶酶原相互作用較 強(qiáng)的肽作為優(yōu)選的親和肽。以上所設(shè)計(jì)的親和肽具有第一種結(jié)構(gòu)或第二種結(jié)構(gòu)，其中，第一禾中結(jié)構(gòu)為=X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨 酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。第二種結(jié)構(gòu)為在第一種結(jié)構(gòu)的X5和X6之間還設(shè)有一個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。實(shí)施例2 組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽與其相互作用能分析采用實(shí)施例1中所述方法，以蘇氨酸突變體系(即分別將X2X5X6位點(diǎn)突變?yōu)樘K氨 酸)為例，利用公式(1)計(jì)算各親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能，結(jié)果如表1 所示。Eint = Ep+l-Ep-El (1)公式⑴中，Eint表示組織型纖溶酶原激活劑與親和肽間的相互作用能，Ep+l表示 組織型纖溶酶原激活劑與親和肽的總勢(shì)能，Ep表示組織型纖溶酶原激活劑的勢(shì)能，&表示 親和肽的勢(shì)能。表1組織型纖溶酶原激活劑與不同親和肽配基結(jié)果分析
親和肽序列 相互作用能/(kcal/mol)
ATQQIIMD-389
APQQTIMD-262
Γ APQQIID-253^^
ATQQIMD-374
APQQTMD-290
ATQQTMD-293
APQQIMD-507從表1可看出，X2位點(diǎn)對(duì)親疏水性變化并不敏感，相對(duì)的，X5位點(diǎn)則對(duì)親疏水性變 化敏感，甲硫氨酸缺失的親和肽體系模擬過程中穩(wěn)定性較差，相互作用能相對(duì)較低，在其它 甲硫氨酸缺失的實(shí)驗(yàn)中也有相同的特點(diǎn)。結(jié)合上述結(jié)果再對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行突變研究，對(duì)X2位 點(diǎn)嘗試絲氨酸等各類親疏水性殘基，保留X6位的甲硫氨酸，對(duì)X5位點(diǎn)在其他甲硫氨酸缺失 的模擬實(shí)驗(yàn)中，取丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸進(jìn)行突變研究，根據(jù)相互 作用能進(jìn)行優(yōu)選。本發(fā)明具有第一種結(jié)構(gòu)的親和肽優(yōu)選如SEQ ID Nos. 1至12所示的序列。第二種結(jié)構(gòu)為在第一種結(jié)構(gòu)的X5和X6之間設(shè)有一個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘 基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。本發(fā)明具有第二種結(jié)構(gòu)的親和肽優(yōu)選如SEQ ID Nos. 13至46所示的序列。其中，本發(fā)明最優(yōu)選的是具有如SEQ ID Nos. 1所示序列的親和肽，其親和性約是 模板親和肽的2. 3倍。結(jié)構(gòu)如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑相互 作用如圖1所示，卡通模式表示組織型纖溶酶原激活劑1，表面模式表示組織型纖溶酶原激 活劑上與配基相吸附的殘基2，范德華模式表示結(jié)構(gòu)如SEQ ID No. 1所示的親和肽3。由圖 1可知，結(jié)構(gòu)如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑緊密結(jié)合，具有良好的 親和性。實(shí)施例3 組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽配基連接于固相載體聚乙烯醇水凝膠體系由六條聚乙烯醇相互交聯(lián)而成，每條鏈均由40個(gè)聚乙烯醇單體構(gòu)成，且每條鏈上連接5個(gè)結(jié)構(gòu)如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽，進(jìn)行至少4ns的分子動(dòng) 力學(xué)模擬，利用公式(1)計(jì)算固定化后該親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能， 與未固定化該親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能相當(dāng)。由此可知，固定化后的 親和肽具有良好的親和性，可用于分離純化或檢測(cè)組織型纖溶酶原激活劑或其片段。綜上，本發(fā)明的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽具有良好的親和性，可 用于組織型纖溶酶原激活劑的分離純化或檢測(cè)。本發(fā)明的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽可通過化學(xué)生物學(xué)中多肽的 常規(guī)方法合成，例如Merrifield固相合成法中常用的Fmoc方法。
權(quán)利要求
一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于具有如下結(jié)構(gòu)X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于在 所述X5和X6之間設(shè)有一個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于所 述X1X2X3X4X5X6X7的序列為選自SEQ ID Nos. 1至12中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于所 述氨基酸殘基的序列為選自SEQ ID Nos. 13至46中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的親和肽的用途，其特征在于用于分離純化或 檢測(cè)組織型纖溶酶原激活劑或其片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親和肽的用途，其特征在于通過將所述親和肽連接于固相 支持物上以分離純化或檢測(cè)組織型纖溶酶原激活劑或其片段。
全文摘要
本發(fā)明公開一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該親和肽的結(jié)構(gòu)為X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1為丙氨酸或甘氨酸，X2為脯氨酸或蘇氨酸，X3、X4均為谷氨酸，X5為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，X6為甲硫氨酸，X7為天冬氨酸。優(yōu)選在所述X5和X6之間設(shè)有一個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。本發(fā)明的親和肽通過固定于固相支持物上，可用于組織型纖溶酶原激活劑及其片段的分離純化或檢測(cè)，具有親和性強(qiáng)、安全性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/22GK101948509SQ20101029868
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者吳韜, 張錦, 王 琦 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)