專利名稱：蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，為蚯蚓纖溶酶及其同工酶新的藥用功效—口服治療和預(yù)防腫瘤，屬于醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。
二、技術(shù)背景蚯蚓(地龍)是我國廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)的中藥材，李時珍的《本草綱目》中，蚯蚓入藥的處方就有40個。上世紀(jì)90年代以來，屢見應(yīng)用蚯蚓及蚯蚓提取物的制劑治療腫瘤并取得一定療效的報道，但是都沒有明確蚯蚓抗腫瘤的有效部位—蚯蚓纖溶酶組分與抗腫瘤的關(guān)系。
從蚯蚓提取的蚯蚓纖溶酶(亦稱蚓激酶下同)作為口服溶血栓藥10年前獲衛(wèi)生部批準(zhǔn)上市，臨床應(yīng)用證明它口服治療血栓病安全有效、無明顯毒付作用，只對出血傾向及過敏患者限制使用。蚯蚓纖溶酶是一組分子量為20-40KD、等電點為3-5的絲氨酸蛋白酶，它們同時具有激活纖維蛋白溶解酶原和直接溶解纖維蛋白的功能。蚯蚓纖溶酶是多種同工酶的混合物，多數(shù)認為赤子愛勝蚓的纖溶酶組分包含6-7種同工酶，也有報道它包含8種或更多的同工酶。蚯蚓纖溶酶的同工酶的數(shù)量，隨蚯蚓的品種、提取和分離工藝的不同而存在差異。
國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的、若干個針對心腦血管的保健食品，也以蚯蚓纖溶酶為功能性保健成分。相關(guān)的毒理試驗以及多年的臨床應(yīng)用實踐，已證明它安全、無明顯毒付作用，無致癌、致畸、致突變作用。
人類對腫瘤的徹底攻克，還有一個漫長艱巨的過程，在這一較長的時期內(nèi)、尋求安全有效的、抑制腫瘤的藥物，一直是人們努力追求的目標(biāo)。其中能有效引起腫瘤細胞凋亡、無毒付作用或者毒付作用很低的口服藥物更受歡迎，它既可以用于腫瘤的治療也可以用于腫瘤的預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，提供了一種新的、基本無毒付作用的、有效抑制腫瘤的藥物，它抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞和在體內(nèi)的腫瘤細胞。
技術(shù)方案 本發(fā)明蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，包括用蚯蚓纖溶酶或含蚯蚓纖溶酶組分的復(fù)方制劑治療、預(yù)防腫瘤；或者是將含蚯蚓纖溶酶的藥品或保健品的應(yīng)用范圍擴大至治療、預(yù)防腫瘤。其特征在于，采用蚯蚓纖溶酶組分的腸溶制劑或餐前提前0.5-1小時服用蚯蚓纖溶酶組分，劑量為1000～3000尿激酶單位/人.日，日服2-4次。所用的蚯蚓纖溶酶組分可以是經(jīng)過提取提純的蚯蚓纖溶酶及其同工酶；也可以是含蚯蚓纖溶酶的制劑。
用常規(guī)生化技術(shù)提取制備的蚯蚓纖溶酶粗制品以及提純的蚯蚓纖溶酶及同工酶，均可用于腫瘤的治療和預(yù)防，但是制劑中纖溶酶的活性含量是最重要的質(zhì)量指標(biāo)。蚯蚓抗腫瘤有效部位的提取，首先是去除蚯蚓富集的重金屬、農(nóng)藥等有害物質(zhì)以及腸道內(nèi)容物和環(huán)境污染物。在適當(dāng)?shù)膒H穩(wěn)定范圍和較低的溫度下操作、防止微生物的污染和繁殖、成品低溫干燥等，控制提取、提純工藝的每一環(huán)節(jié)以保持纖溶酶的活性，是制備本制劑的又一重要環(huán)節(jié)。進一步還可以根據(jù)需要，去除核蛋白、血紅蛋白、甲殼素、氨基酸、多肽、色素和低分子雜質(zhì)、以及其它的酶和雜蛋白，以制備不同純度的蚯蚓纖溶酶。不主張應(yīng)用蚯蚓凍干粉，因為含量很高的重金屬、農(nóng)藥、腸道內(nèi)容物以及其它環(huán)境污染物，長時期服用對人體會造成危害。用于提取蚯蚓纖溶酶的蚯蚓可以是已經(jīng)規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖的赤子愛勝蚓、大平二號蚓、北星二號蚓、美國紅蚯蚓等蚯蚓品種，也可以是尚未普遍人工養(yǎng)殖的含纖溶酶的威廉環(huán)毛蚓、湖北環(huán)毛蚓、夏威環(huán)毛蚓以及其它含蚯蚓纖溶酶的蚯蚓品種。
有益效果本發(fā)明提供了一種新的、基本無毒付作用的、有效抑制腫瘤的藥物，首次將蚯蚓纖溶酶組分應(yīng)用于治療、預(yù)防腫瘤。通過蚯蚓纖溶酶體外對下述腫瘤細胞的抑制試驗胰腺癌Eca-109、宮頸癌Hella細胞、結(jié)腸癌SW-190、胃癌SCG-901、紅白血病K562細胞、人肝癌HLE細胞系、Huh7細胞系、PLC/PRF/5細胞系、HepG2細胞系；通過蚯蚓纖溶酶體外對下述腫瘤細胞細胞繁殖周期的影響與致凋亡試驗胰腺癌Eca-109、結(jié)腸癌SW-1990、宮頸癌Hella細胞以及人肝癌HLE細胞系、Huh7細胞系；通過口服蚯蚓纖溶酶或者口服含蚯蚓纖溶酶的制劑(取自藥品蚓激酶腸溶膠囊)在荷瘤小白鼠抑制移植瘤S180、艾氏腹水瘤的試驗；通過口服蚯蚓纖溶酶在裸鼠抑制人肝癌Huh7腫瘤的試驗，得出試驗研究結(jié)果如下1、蚯蚓纖溶酶組分在體外抑制多種腫瘤細胞并存在量效依賴關(guān)系(表1-表6、圖1)。
2、蚯蚓纖溶酶組分將腫瘤細胞阻滯在G0-G1期并引起腫瘤細胞凋亡(表7、表8、圖3、圖4A-4C)。
3、蚯蚓纖溶酶組分抑制紅白血病細胞系的生長并存在量效關(guān)系，即使在低劑量也不會促進紅白血病細胞系的生長(表6)。
4、口服蚯蚓纖溶酶組分或口服含蚯蚓纖溶酶的制劑，抑制荷瘤小白鼠腫瘤的生長、延長荷瘤鼠的存活期，蚯蚓纖溶酶的劑量與抑瘤效果存在量效依賴關(guān)系。其中高劑量組的抑瘤效果與5-Fu化療組相近(表9-表11))。
5、蚯蚓纖溶酶組分在裸鼠口服抑制人肝癌細胞系的生長(表12、圖2)。
6、荷瘤小白鼠給藥后沒有明顯的毒付反應(yīng)，小鼠活躍、毛色光亮、進食與體重增重基本正常、白細胞的數(shù)量與分類無顯著變化；與5-Fu化療組小鼠的體況相比、反差十分明顯(表9-表11)。
7、荷瘤裸鼠給藥后沒有明顯毒付反應(yīng)、對免疫系統(tǒng)無不良影響，裸鼠攝食、活動、增重與對照組無明顯差異，脾臟、胸腺的重量與對照組也無明顯差異(表12、圖2)。
以上試驗證明了蚯蚓抗腫瘤的有效部位是蚯蚓的纖溶酶組分。蚯蚓的該有效部位可以用于腫瘤的治療也可以用于腫瘤的預(yù)防。蚯蚓纖溶酶組分抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞和在體的腫瘤細胞，把腫瘤細胞阻滯在G0-G1期、引起腫瘤細胞凋亡；蚯蚓纖溶酶組分的濃度與腫瘤細胞抑制率存在量效依賴關(guān)系；蚯蚓纖溶酶組分在低劑量并不會促進紅白血病細胞系的生長。蚯蚓纖溶酶組分口服有效、而且無明顯毒付作用抑制荷瘤小白鼠與荷瘤裸鼠腫瘤的生長、延長生存期，抑瘤效果與化療組相接近；但它不抑制動物的免疫系統(tǒng)，對動物的增重、活動、毛色、攝食等體況無明顯不良影響。
本發(fā)明為我國目前廣泛用作溶血栓藥與心腦血管保健食品的蚯蚓纖溶酶提供了新用途，還為這類藥品和保健品提供了新的、廣闊的應(yīng)用范圍，并且推動我國蚯蚓養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
四

圖1.不同濃度的蚯蚓纖溶酶(Earthworm Fibriolytic Enzyme，EF1E)處理72小時后人肝癌細胞的成活率蚯蚓纖溶酶可以抑制所有供試人肝癌細胞系的繁殖并存在量效依賴關(guān)系。
圖2.裸鼠口服蚯蚓纖溶酶(EF1E)對人肝癌Huh7細胞系細胞繁殖的抑制作用口服蚯蚓纖溶酶2周后，對照組、不同劑量試驗組之間腫瘤體積的差異已經(jīng)可以檢查出。
服藥4周后組間差異更加顯著。蚯蚓纖溶酶劑量與抑瘤效果存在量效依賴關(guān)系。
圖3.蚯蚓纖溶酶(EFlE)處理72小時后人肝癌HLE細胞系和Huh7細胞系的細胞周期分布、處于G0-G1期的細胞比例分別為HLE細胞系為3.5％(對照)、10.9％(5.00u/ml)、12.3％(10.00u/ml)；Huh7細胞系為5.0％(對照)、24.7％(5.00u/ml)、34.5％(10.00u/ml)。共進行3次試驗、數(shù)據(jù)完全一致。
圖4. 蚯蚓纖溶酶處理72小時引起HLE肝癌細胞凋亡，丫叮橙-溴化乙錠熒光染色
(A)早期的HLE細胞凋亡(三角指示)，顯示出現(xiàn)了斷裂、凝縮的染色質(zhì)的綠色碎片。存活的細胞出現(xiàn)不均勻的綠色(箭頭指示)。
(B)晚期HLE細胞凋亡顯示橙色熒光(箭頭指示)。隨著原生質(zhì)膜失去完整性，溴化乙錠滲入細胞并插入斷裂的DNA，細胞染成紅色。
(C)壞死細胞(三角指示)的細胞膜喪失了選擇性，溴化乙錠插入DNA、產(chǎn)生不均勻的紅色。
*在肝癌Huh7細胞系的試驗中，細胞出現(xiàn)相同的形態(tài)變化。
具體實施例方式
本發(fā)明試驗研究中，蚯蚓纖溶酶的生物活性測定方法，參照國際通用的尿激酶生物活性測定法(纖維蛋白平板法)并用尿激酶活性單位(uku)表示在含有纖維蛋白溶解酶原的纖維蛋白平板上點加供試樣品和尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品、各點加樣10μl，37℃培育18小時，以纖維蛋白溶解窩的長、短軸的乘積為溶解窩面積(mm2)作縱座標(biāo)，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品單位數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將供試樣品溶解窩的面積(mm2)代入回歸方程，計算供試品的效價單位。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用平均數(shù)□}標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。t檢驗應(yīng)用SPSS 10.0 Windows軟件。P＜0.05認為具有顯著性。
1、體外抗腫瘤試驗試驗材料(1)腫瘤細胞，由中科院上海細胞所提供，腫瘤細胞培養(yǎng)在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，貼壁細胞用0.25％胰酶消化傳代；懸浮細胞離心傳代。
(2)蚯蚓纖溶酶組分及其相近的蛋白組分鮮蚯蚓洗凈、加2倍生理鹽水、勻漿、攪拌抽提4小時，離心分離，沉渣加等量生理鹽水、攪拌抽提2小時、離心分離。合并離心上清液，攪拌、緩緩加入飽和(NH4)2SO4使終末飽和度為40％，靜置過夜，濾除沉淀、收集清液，超過濾、脫鹽、去除低分子雜質(zhì)并濃縮酶液。酶液通過DEAE-Sepharose 4B陰離子交換層析，梯度洗脫、收集纖溶酶活性峰，再通過Sephadex G75凝膠層析，分別收集3個相鄰的蛋白峰，脫鹽、濃縮、冷凍干燥。其中第II峰為蚯蚓纖溶酶組分，第I峰、第III峰無纖溶活性。蚯蚓纖溶酶活性測定參照前述的尿激酶活性測定方法(纖維蛋白平板法)并用尿激酶活性單位(uku)表示。
本研究中，進一步采用下述2種聚丙烯酰胺凝膠電泳、檢測凝膠層析第II峰的纖溶酶的同工酶①非變性PAGE，濃縮膠濃度5％、分離膠濃度10％，考馬斯亮藍染色。②纖維蛋白-PAGE，它與前者的區(qū)別在于制備分離膠時加入纖維蛋白原和適量凝血酶，迅速混勻，澆垂直板，纖維蛋白原(可凝蛋白含量≥95％)的終末濃度為0.25％。80V、3小時，電泳結(jié)束、凝膠板置37℃溫育1小時、漂洗、考馬斯亮藍顯色。檢測結(jié)果，方法①顯示5條藍色蛋白帶；方法②在相應(yīng)位置出現(xiàn)5條無色半透明帶，它們是蚯蚓纖溶酶的5個同工酶降解纖維蛋白的產(chǎn)物，凝膠板的背景為均勻的藍色。
試驗方法(1)MTT顯色實驗在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入9.00uku/ml、4.50uku/ml、2.25uku/ml的蚯蚓纖溶酶；第I峰、第III峰無纖溶活性的蛋白組與微弱纖溶活性的蛋白組，各組加入相同量的蛋白質(zhì)溶液。5％ CO2、37℃培養(yǎng)72小時，每孔加入0.5％MTT 20μl、繼續(xù)培養(yǎng)4h、吸棄上清，加入1N鹽酸-異丙醇，用吸管吹打均勻，用核酸蛋白檢測儀、波長570nm檢測，計算細胞生長抑制率抑制率(％)＝(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100％(2)流式細胞儀檢測含9.00uku/ml、4.50uku/ml蚯蚓纖溶酶的腫瘤細胞和對照組腫瘤細胞，5％CO2、37℃培養(yǎng)24小時，用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，1000r.min-1離心，加1％Triton-x-100、孵育，離心，0.005％PI染色，300目尼龍網(wǎng)過濾，15分鐘后上機檢測(TACSalibur，USA)。
(3)丫叮橙-溴化乙錠(AO/EB)熒光染色腫瘤細胞在含蚯蚓纖溶酶的細胞維持液中培養(yǎng)72小時后，按常規(guī)取樣、AO/EB熒光染色、鏡撿。
試驗結(jié)果(1)蚯蚓纖溶酶組分與相近蛋白組分對腫瘤細胞抑制作用的比較見于(表1、2、3)從蚯蚓的3種蛋白質(zhì)組分對3種腫瘤細胞系Eca-109、Hella、SW-1990的抑瘤率可以看到，只有蚯蚓纖溶酶組分具有顯著的抑瘤效果，另2種蚯蚓蛋白組分都不具有明顯的抑瘤效應(yīng)。因此可以確定蚯蚓纖溶酶組分是蚯蚓抗腫瘤的有效部位。
(2)蚯蚓纖溶酶組分對腫瘤細胞增殖的影響(表4、5、6)用不同濃度的蚯蚓纖溶酶對不同的腫瘤細胞系處理72小時，腫瘤細胞生長受到不同程度的抑制 胰腺癌Eca-109細胞系被抑制84.2％(9.0uku/ml)和49.6％(4.5uku/ml)，胃癌SCG-7901細胞系被抑制83.6％(6.0uku/ml)和61.5％(4.5uku/ml)，結(jié)腸癌SW-1990細胞系被抑制75.0％(9.0uku/ml)和74.0％(4.5uku/ml)，宮頸癌Hella細胞系被抑制89.0％(9.0uku/ml)和77.5％(4.5uku/ml)，紅白血病K562細胞系被抑制87.2％(9.0uku/ml)和72.6％(4.5uku/ml)。綜觀表1-表6，試驗結(jié)果顯示細胞培養(yǎng)液中蚯蚓纖溶酶濃度的增加與腫瘤細胞OD值的降低，兩者存在量效依賴關(guān)系。
(3)不同劑量的蚯蚓纖溶酶處理紅白血病細胞系K562 72小時(表6)，癌細胞生長受到不同程度的抑制，蚯蚓纖溶酶濃度的增加與癌細胞OD值的降低，兩者存在量效依賴關(guān)系。特別注意到細胞培養(yǎng)液中的蚯蚓纖溶酶組分即使在極低的濃度也并不促進紅白血病細胞系的生長。
(4)蚯蚓纖溶酶組分對腫瘤細胞周期分布的影響(表7)用大、中劑量的蚯蚓纖溶酶處理腫瘤細胞系Eca-109、SW-1990、Hella24小時，流式細胞儀檢測。結(jié)果表明腫瘤細胞被阻斷在G0-G1期，S合成期細胞的比例大幅度降低，進入G2-M期的細胞也明顯減少。當(dāng)蚯蚓纖溶酶在細胞維持液中的濃度為0uku/ml、4.5uku/ml、9.0uku/ml時，G0-G1期的細胞比例分別為Eca-109從68.90％升至76.73％和87.99％，SW-1990從58.93％升至73.21％(4.5uku/ml)，Hella從77.64％升至88.72％和94.68％。
(5)在檢測Hella細胞周期時，同時取樣作A0/EB熒光染色。丫叮橙滲入完整的細胞膜、插入DNA使呈綠色；溴化乙錠通過細胞膜的裂紋進入細胞，插入RNA和雙鏈DNA，使呈橙色。因此，可根據(jù)該混合染料的攝入和結(jié)合情況，判斷細胞凋亡和壞死的進程。鏡檢發(fā)現(xiàn)Hella細胞在蚯蚓纖溶酶作用下發(fā)生明顯的細胞凋亡。當(dāng)蚯蚓纖溶酶的濃度為4.50u/ml時，有7.32％的細胞發(fā)生凋亡，當(dāng)酶的濃度升高，凋亡的腫瘤細胞比率也隨之升高。
2、外抗肝癌細胞試驗試驗材料(1)蚯蚓纖溶酶組分的凍干粉，臨用前以細胞培養(yǎng)液稀釋。
(2)人肝癌細胞HCC系HLE、Huh7、PLC/PRF/5以及肝胚細胞瘤HepG2，由日本健康科學(xué)研究銀行(Okasa Japan)提供。細胞培養(yǎng)于含10％犢牛血清(FBS Sigma、USA)的、Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DEME GibcoBRL、USA)中，加青霉素100u/ml、鏈霉素0.1mg/ml，5％CO2、37℃培養(yǎng)。細胞用0.25％胰酶(Sigma USA)消化，一周傳代2次。
試驗方法(1)細胞繁殖的檢測細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板(Falcon，、Becton Dickinson、USA)，接種密度分別為HLE細胞和Huh7細胞5×104，PLC/PRF/5細胞和HepG2細胞5×105。培養(yǎng)24小時后，細胞培養(yǎng)液換成含不同濃度蚯蚓纖溶酶的維持液。纖溶酶在培養(yǎng)基中的終末濃度從1.25uku/ml到40.00uku/ml，每一濃度4孔；4孔不含纖溶酶作為對照。細胞培養(yǎng)板于5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時，細胞繁殖檢驗試劑盒(Chemicon USA)用來分析細胞生長被抑制的情況。當(dāng)WST-1/ECS溶液加到每個培養(yǎng)孔之后，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，接下來用分光光度計、波長450nm測定每孔培養(yǎng)物的光密度。
(2)流式細胞儀檢測人肝癌HCC細胞系的HLE和Huh7細胞，經(jīng)培養(yǎng)24小時傳代并貼壁后，更換含蚯蚓纖溶酶的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時，蚯蚓纖溶酶的最終濃度分別為10.00uku/ml、5.00uku/ml、對照組0uku/ml。每一濃度2只培養(yǎng)板。細胞培養(yǎng)在5％CO2、37℃、72小時后分別收集貼壁細胞和懸浮細胞，PBS洗滌細胞，用70％乙醇處理1小時。接下來再次用PBS洗滌，細胞與含RNase A和propidium iodide(PI)的染色液孵育1小時。細胞周期分析用FACS Calibur(Becton DickinsonUSA)。試驗重復(fù)3次。
(3)熒光染料染色。人肝癌HLE和Huh7細胞系，置于含蚯蚓纖溶酶10.00uku/ml、5.00uku/ml、0uku/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時；分別收集貼壁細胞和懸浮細胞并再次懸浮于200μl培養(yǎng)基。8μl含100μg/ml丫叮橙和100μl/ml溴化乙錠的混合熒光染料(AO/EB)加入細胞懸浮液中并輕輕混合。將一滴混合物置于帶蓋玻片的顯微鏡玻片上，通過藍色濾片用熒光顯微鏡觀察。每個視野至少隨機統(tǒng)計200個細胞。凋亡細胞的比例按下面公式計算凋亡率(％)＝(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/統(tǒng)計細胞數(shù)試驗結(jié)果(1)蚯蚓纖溶酶組分抑制肝癌細胞的繁殖(圖1)檢查了蚯蚓纖溶酶組分對人肝癌HLE、Huh7、PLC/PRF/5和HepG2細胞系生長的抑制效果。以不同濃度的蚯蚓纖溶酶處理肝癌細胞72小時后，上述4種人肝癌細胞系都受到不同程度的抑制。
圖1顯示，盡管不同肝癌細胞對蚯蚓纖溶酶的敏感性存在差異，但隨著纖溶酶濃度的增加、對癌細胞的抑制率也隨之升高，兩者存在量效依賴關(guān)系。4個肝癌細胞系中，2種肝癌細胞HLE、Huh7的生長受到強烈抑制，對HLE和Huh7的IC50分別為2.1luku/ml與5.87uku/ml。而另2種肝癌細胞PLC/PRF/5和HepG2受到的抑制不如前2種細胞強烈，IC50分別為25.29uku/ml與17.30uku/ml。
圖1顯示以不同濃度蚯蚓纖溶酶處理72后肝癌細胞的存活率，它表明蚯蚓纖溶酶可以抑制所有4種肝癌細胞的繁殖并存在量效依賴關(guān)系(2)蚯蚓纖溶酶組分引起人肝癌HCC細胞系的凋亡(表8、圖3)①流式細胞儀檢測 以蚯蚓纖溶酶處理肝癌細胞72小時后，用FACS檢查細胞周期狀況。結(jié)果顯示，試驗組G0-G1期細胞的比例，均大于對照組(表8、圖3)。它表明蚯蚓纖溶酶可引起肝癌HCC細胞系的凋亡，這在Huh7細胞系尤其強烈，用10.00uku/ml的蚯蚓纖溶酶處理后，G0-G1期細胞的比例由5％上升到34.5％，還可以明顯地看到多量細胞被阻滯在G1期。蚯蚓纖溶酶對HLE細胞的作用不如前者強烈，用10.00uku/ml處理后G0-G1期的比例從3.5％增加到12.3％。
②熒光染料染色 人肝癌細胞以蚯蚓纖溶酶處理72小時后用丫叮橙和溴化乙錠的混合熒光染料(AO/EB)染色，細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化在各組都能觀察到，但是蚯蚓纖溶酶處理組細胞凋亡現(xiàn)象遠比對照組強烈(表8、圖3)。根據(jù)統(tǒng)計公式，蚯蚓纖溶酶的濃度為0uku/ml、5.00uku/ml、10.00uku/ml時，HLE細胞系的凋亡率分別為3.02％、8.76％、10.54％；Huh7細胞的凋亡率分別為3.95％、18.27％、30.89％。該結(jié)果與流式細胞儀的檢測結(jié)果(圖3、表8)相吻合?？梢郧宄闯?，隨著蚯蚓纖溶酶濃度的增加、細胞凋亡的比例隨之升高，兩者存在量效依賴關(guān)系。
3、蚯蚓纖溶酶組分在荷瘤小白鼠的抑瘤試驗試驗材料和方法(1)蚯蚓纖溶酶組分的提取提純、按照前述試驗的方法。
(2)含蚯蚓纖溶酶的制劑，取自藥品蚓激酶腸溶膠囊(北京百奧藥業(yè))，每粒膠囊含蚯蚓纖溶酶30萬蚓激酶單位(相當(dāng)于300尿激酶單位)。
(3)抑制小鼠S180移植性腫瘤試驗分2批進行第一批試驗將對數(shù)生長期的S180細胞從小鼠體內(nèi)取出，用生理鹽水適當(dāng)稀釋，接種昆明小鼠皮下、2.7×107個細胞/只，共分5組，每組10只。第二天起試驗組用蚯蚓纖溶酶的水溶液灌胃，每天上下午各灌一次，劑量為400u/Kg.d、2000u/Kg.d、4000u/kg.d；陽性對照組注射5-Fu、20mg/Kg.d；陰性對照灌生理鹽水。連續(xù)灌胃7天，第8天全部處死，分離腫瘤、稱重，稱體重。腫瘤生長抑制率按下面公式計算抑制率(％)＝(1-治療組腫瘤平均重/對照組腫瘤平均重)×100％第二批試驗用藥品蚓激酶膠囊取代我們提取提純的蚯蚓纖溶酶酶組分，試驗分為4組，試驗組給荷瘤鼠灌胃劑量為2000與4000uku/kg.d，其余同第一批試驗。
(4)抑制小鼠移植性腹水瘤試驗接種了艾氏腹水瘤的昆明小鼠，8天后頸椎脫臼處死，抽腹水、過濾、生理鹽水適當(dāng)稀釋，每只昆明小鼠腹腔注射0.2ml(2×107個細胞)，共分5組，每組10只。試驗組、陽性對照組、陰性對照組的處理，同S180移植瘤試驗。觀察各組小鼠死亡時間。
試驗結(jié)果(1)對S180移植瘤的抑制率(表9、表10)第一批試驗，隨著荷瘤小鼠口服蚯蚓纖溶酶劑量的增加，對S180移植瘤的抑制率也隨之升高，分別為2.0％(400uku/kg.d)、43.1％(2000uku/kg.d)、50.3％(4000uku/kg.d)，略低于5-Fu組的67.9％。蚯蚓纖溶酶的劑量與S180移植瘤的抑制率之間存在量效依賴關(guān)系。第2批試驗，取得與上批試驗相似的結(jié)果，抑瘤率比上批試驗略高一些，口服大劑量蚓激酶(4000uku/kg.d)抑瘤率62.35％與5-Fu組的63.49％相近。
(2)移植性艾氏腹水瘤試驗(表11)隨著荷瘤小鼠口服蚯蚓纖溶酶劑量的增加，小鼠生命延長率分別為3.03％、30.3％、42.4％，存在量效依賴關(guān)系。其中口服高劑量纖溶酶組(5000u/Kg.d)的生命延長率42.4％、高于5-Fu組的33.93％。
(3)上述在體抑瘤試驗中，5-Fu治療組小鼠出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍、進食減少、體重增加減慢。3種劑量的纖溶酶口服治療組、小鼠均未出現(xiàn)毒付反應(yīng)小鼠活躍、毛色光亮、進食正常，體重增重?zé)o異常，白細胞數(shù)量與分類無異常。
(4)蚯蚓纖溶酶組分在裸鼠的抑瘤試驗試驗材料和方法(1)裸鼠 雄性裸鼠BALB/cAnNCrj-nu、5周齡。裸鼠飼養(yǎng)在無菌的專用設(shè)備中，控制光照、溫度和濕度，每籠5只鼠、共30只。
(2)蚯蚓纖溶酶的制備同荷瘤小白鼠的抑瘤試驗。
(3)體外培養(yǎng)的、人肝癌HCC細胞系的Huh7，收獲后懸浮于DMEM，稀釋至1×107細胞/0.2mlDMEM。在每只裸鼠右后肢的臀部，注射0.2ml細胞懸浮液。接種后次日起，小劑量試驗組灌服蚯蚓纖溶酶500uku/Kg.d，中劑量組每日灌服1000uku/Kg.d，每日1次，共4周；對照組每天灌服生理鹽水。每周1次測量腫瘤2個相互垂直的直徑。腫瘤體積的計算是按照下面公式體積＝1/2長×寬。
最后給藥的24小時后，即試驗第28天，全部裸鼠乙醚麻醉處死，完整地摘取腫瘤組織，稱取腫瘤、脾、胸腺的重量。
試驗結(jié)果裸鼠注射人肝癌HCC系Huh細胞后10天內(nèi)，長出可觸及的腫瘤塊，瘤塊呈卵圓形或圓形。試驗中腫瘤生長總的趨勢見于圖2?？诜球纠w溶酶2周后，試驗組腫瘤的體積已經(jīng)與對照組呈現(xiàn)差異，繼續(xù)服藥差異變得顯著?？诜球纠w溶酶4周，人肝癌HCC系腫瘤的生長受到極大的抑制(表12)試驗組腫瘤的抑制率分別為500u/Kg.d為46.08％(與對照組比較p＝0.026)；1000u/kg.d為57.52％(與對照組比較p＝0.002)。
試驗中裸鼠對蚯蚓纖溶酶無不良反應(yīng)，老鼠攝食、活動、體重的增加，各試驗組之間、試驗組與對照組之間無顯著差異。試驗結(jié)束時，裸鼠的脾臟、胸腺的重量在3組之間沒有顯著差異，表明蚯蚓纖溶酶對免疫系統(tǒng)沒有明顯的付作用。
表1 蚯蚓的不同蛋白質(zhì)組分對胰腺癌Eca-109細胞系的抑制作用

表2 蚯蚓的不同蛋白質(zhì)組分對宮頸癌Hella細胞系的抑制作用

表3 蚯蚓的不同蛋白質(zhì)組分對結(jié)腸癌SW-1990細胞系的抑制作用

表4 蚯蚓纖溶酶組分對胃癌SCG-7901細胞系生長的抑制作用

表5 蚯蚓纖溶酶組分對胰腺癌Eca-109細胞系的抑制作用

表6 蚯蚓纖溶酶組分對紅白血病K562細胞系的抑制作用

表7 蚯蚓纖溶酶組分處理腫瘤細胞24小時后對細胞周期分布的影響

表8 蚯蚓纖溶酶引起肝癌HLE、Huh7細胞系的細胞周期分布的改變

表9 蚯蚓纖溶酶組分對小鼠移植性腫瘤S180的抑制作用

表10 蚯蚓纖溶酶制劑—蚓激酶膠囊對小鼠移植性腫瘤S180的抑制作用

表11 蚯蚓纖溶酶組分對小鼠移植性艾氏腹水瘤的抑制作用

表12 蚯蚓纖溶酶組分在裸鼠對人肝癌HCC細胞系Huh7移植瘤的抑制作用

與對照組比較(a)p＝0.026；(b)p＝0.002；(c)p＝0.371；(d)p＝0.494；(e)p＝0.562；(f)p＝0.82權(quán)利要求
1.蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，包括用蚯蚓纖溶酶或含蚯蚓纖溶酶組分的復(fù)方制劑治療、預(yù)防腫瘤；或者是將含蚯蚓纖溶酶的藥品或保健品的應(yīng)用范圍擴大至治療、預(yù)防腫瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，其特征在于，采用蚯蚓纖溶酶組分的腸溶制劑或餐前提前0.5-1小時服用蚯蚓纖溶酶組分，劑量為1000～3000尿激酶單位/人.日，日服2--4次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，其特征在于，所用的蚯蚓纖溶酶組分可以是經(jīng)過提取提純的蚯蚓纖溶酶及其同工酶；也可以是含蚯蚓纖溶酶的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，其特征在于，用于提取蚯蚓纖溶酶的蚯蚓可以是已經(jīng)規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖的赤子愛勝蚓、大平二號蚓、北星二號蚓、美國紅蚯蚓等蚯蚓品種，也可以是尚未普遍人工養(yǎng)殖的含纖溶酶的威廉環(huán)毛蚓、湖北環(huán)毛蚓、夏威環(huán)毛蚓以及其它含蚯蚓纖溶酶的蚯蚓品種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述蚯蚓纖溶酶組分抗腫瘤的應(yīng)用，其特征在于，用于提取蚯蚓纖溶酶的蚯蚓可以是已經(jīng)規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖的赤子愛勝蚓、大平二號蚓、北星二號蚓、美國紅蚯蚓等蚯蚓品種，也可以是尚未普遍人工養(yǎng)殖的含纖溶酶的威廉環(huán)毛蚓、湖北環(huán)毛蚓、夏威環(huán)毛蚓以及其它含蚯蚓纖溶酶的蚯蚓品種。
全文摘要
本發(fā)明涉及蚯蚓纖溶酶(亦稱蚓激酶下同)組分抗腫瘤的應(yīng)用，為蚯蚓纖溶酶及其同工酶新的藥用功效—口服用于治療和預(yù)防腫瘤，屬于醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。包括采用蚯蚓纖溶酶的腸溶制劑或餐前提前0.5－1小時服用，治療的劑量為1000～3000尿激酶單位/人.日，日服2－4次。所用的蚯蚓纖溶酶組分可以是經(jīng)過提取提純的蚯蚓纖溶酶及其同工酶；也可以是含蚯蚓纖溶酶的制劑。本發(fā)明闡明了蚯蚓纖溶酶的另一個新功效在體外抑制多種腫瘤細胞，在體內(nèi)口服抑制腫瘤，而且療效顯著、無明顯毒副作用。蚯蚓纖溶酶可以口服用于腫瘤的治療和預(yù)防。
文檔編號A61P35/00GK1724067SQ200510040988
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者張治國, 連桂芳 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)