專利名稱：同種異體和異基因蛋白的抗體，它們?cè)谠\斷和治療中的應(yīng)用及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)那些能識(shí)別提取于哺乳動(dòng)物器官中的且分子量約為14Kda的蛋白的天然抗體的診斷方法。該抗體在對(duì)異基因物種給藥時(shí)具有抗腫瘤活性。
本發(fā)明還涉及純化形式的該天然抗體以及它們?cè)谠\斷和治療中的應(yīng)用。
WO92/10197公開(kāi)了可通過(guò)用高氯酸和高滲鹽溶液提取哺乳動(dòng)物器官，特別是肝臟得到的蛋白物質(zhì)。
已分離出分子量約為14Kda的其中一個(gè)該物質(zhì)并進(jìn)行了部分測(cè)序(意大利專利申請(qǐng)MI 94001469)且證明它是導(dǎo)致所觀察到的生物學(xué)特性即抗腫瘤活性以及在對(duì)和它從其中提取的物種不同的動(dòng)物給藥時(shí)產(chǎn)生能夠識(shí)別腫瘤抗原的抗體的能力的主要蛋白。
該意大利專利申請(qǐng)也公開(kāi)了兩種由保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECAcc)(Porton Donn，索里斯堡，英國(guó)，保藏號(hào)為930806103和930806104)的雜交瘤分泌的單克隆抗體，該抗體能識(shí)別腫瘤抗原的以及在該雜交瘤制備中用作抗原的從羊肝臟中提取的14Kda蛋白(以下稱作UK114)的共同的抗原決定基。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)能識(shí)別從器官(特別是肝臟)中提取的同種異體和異種蛋白的天然抗體是有上述特性并在大約93％的人類實(shí)體瘤中存在且循環(huán)于哺乳動(dòng)物血清中。在健康動(dòng)物或人的血清中以低效價(jià)(＜1/100)正常存在的該抗體可通過(guò)注射相應(yīng)的抗原被刺激，引起效價(jià)以及在血清中產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞的胞毒效應(yīng)的能力的顯著提高。
跟觀察結(jié)果以及天然抗-UK114抗體存在的意義的可能解釋無(wú)關(guān)(這些解釋和本發(fā)明的合法性無(wú)關(guān))，該抗體及其檢測(cè)可用于診斷，預(yù)后和治療的目的。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種免疫檢測(cè)天然抗-UK114抗體的方法。本發(fā)明也涉及純化的抗-UK114抗體及其在診斷，治療和免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用。該檢測(cè)天然抗體的方法是常規(guī)型的且可以依靠直接的，競(jìng)爭(zhēng)的或者“三明治”型的反應(yīng)。而該方案既可以使用固體支持物也可以使用免疫沉淀技術(shù)。將在免疫測(cè)定中使用的抗體和/或者UK114-型抗原用酶(例如在ELISA技術(shù)中)或者用放射性或者熒光，化合物，染料或者色素等進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。該免疫復(fù)合物信號(hào)可以選擇性地利用生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)而增強(qiáng)。
該方法的構(gòu)成以及相應(yīng)的材料的選擇完全屬于普通技術(shù)人員的技能。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在于已用WO92/10197公開(kāi)的蛋白或者純化的UK114處理的病人的血清中的抗-UK114抗體在體內(nèi)和體外都具有抗人體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒和溶細(xì)胞的活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了包括單克隆或多克隆抗體或超免疫血清的溶細(xì)胞和細(xì)胞毒組合物，該抗體是通過(guò)用高氯酸從山羊肝臟中提取的并且被保藏于ECACC的登記號(hào)為930806103或者930806104的雜交瘤分泌的單克隆抗體所識(shí)別的蛋白免疫動(dòng)物或者人而產(chǎn)生的。
在體內(nèi)試驗(yàn)中，細(xì)胞毒活性在該抗原給藥(UK114或者UK101)后幾天即達(dá)到高峰并且在隨后的幾周緩慢降低。但是，根據(jù)ELISA法測(cè)評(píng)的IgG型的抗-UK114抗體的效價(jià)則是隨著時(shí)間而緩慢提高。因此，可以推測(cè)細(xì)胞毒性的第一個(gè)峰是由于IgM-型抗體，和/或者其它現(xiàn)在還未知的血清成分而形成的。
無(wú)論如何，用于檢測(cè)抗體和/或者細(xì)胞毒性從而使得治療可以適當(dāng)?shù)乇O(jiān)控的方法的重要性是明顯的。
按照本發(fā)明無(wú)論施用天然抗體還是單克隆抗體都可以充足劑量在胃腸外進(jìn)行以達(dá)到細(xì)胞毒效應(yīng)。這些合適的給藥方法基本上和那些已知的疫苗，抗體或者超免疫血清的給藥方法相同。本發(fā)明和下列的實(shí)施例2-4為上述抗體的治療和診斷應(yīng)用提供了進(jìn)一步的準(zhǔn)則。
下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明。
實(shí)施例1
將2.5％SDS和5％巰基乙醇加入10μl的山羊肝臟的高氯酸抽提液(W092/10197；UK101)中。將樣品加熱至100℃，5分鐘，并且取4μl用PHAST SYSTEM儀器(Pharmacia)進(jìn)行聚丙烯酰胺8/25梯度凝膠(Pharmacia)的SDS-PAGE分析。另外還可以使用高密度的均相凝膠。用Phast-轉(zhuǎn)移(Pharmacia)儀器將分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移。硝化纖維素膜(0.22μ)事先在加入了20％甲醇的Tris(25mM)甘氨酸(192mM)緩沖液中平衡。電泳在5V×20分鐘條件下進(jìn)行(IA/cm2)。為了防止非特異性結(jié)合，在飽和步驟后，將膜與檢測(cè)的血清一起溫育。
選擇性存在的抗體的結(jié)合可用適當(dāng)標(biāo)記的第二抗人A3b以比色法，放射免疫測(cè)定法或化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例2酚聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)UK114抗體。
使用以下緩沖液(A)50mM碳酸氫鈉pH8.5，(B)50mM磷酸鈉 pH7.2，(C)50mM磷酸鈉 pH7.4，0.1％(w/v)NaN3(D)40mM磷酸鉀 pH7.4，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaN3，0.05(v/v)Tween 20，(E)50mM磷酸鈉 pH7.4，0.1％(w/v)NaN3，0.1％(w/v)BSA，(F)50mM磷酸鈉 pH7.4，150mM NaCl，0.1％(w/v)NaN3，0.5％(w/v)無(wú)蛋白酶的BSA，0.05％(v/v)Tween20，0.％％(v/v)正常山羊。
將3.5ml UK114(3.5mg)的緩沖液A溶液和9μl的NHS-LC生物素(S.P.A.，米蘭)的二甲基亞砜溶液(2mg/ml)混合。將混合物于22℃溫育3小時(shí)并于4℃在Spectrapor6透析管中對(duì)緩沖液B進(jìn)行透析(除去3500D)，中間更換幾次縮沖液B。
將微量滴定孔于4℃用100μlBSA-生物素(5μg/ml的緩沖液C溶液)包被24小時(shí)，然后洗滌并用100μl抗生蛋白鏈菌素(5μg/ml的緩沖液E的溶液)處理。在第二次4℃過(guò)夜溫育后，洗滌各孔并于4℃用100μl的UK114-生物素以不同濃度(2，1和0.5μg/ml的緩沖液E的溶液)處理24小時(shí)。洗滌后，各孔被封閉。
除了在第三次溫育步驟中使用緩沖液E代替UK114-生物素溶液外，可按照相同的步驟制作未包被抗原孔。
該洗滌步驟可通過(guò)加入300μl/孔的緩沖液D三次而進(jìn)行。封閉可以通過(guò)加入300μl的含有10％的蔗糖和不同的封閉劑(1％和5％的牛血清白蛋白，1％的甘氨酸，加入3％的聚乙烯吡咯烷酮的1％的BSA，5％的正常山羊血清)的緩沖液C而進(jìn)行。室溫30分鐘后，棄去封閉液并在真空室干燥，然后包入聚乙烯和鉆箔中4℃貯存?zhèn)溆谩?br> ELISA步驟在測(cè)定前將血清樣品和陰性對(duì)照按1∶21用緩沖液F稀釋。將100μl樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液(1，2，4和8μ/ml的緩沖液F的溶液)加入包被孔中并在水平振蕩器上(400-500rpm)于室溫溫育1小時(shí)。用300μl緩沖液D洗滌各孔四次，然后加入100μl的溶解于Stabilgen緩沖液中的1∶3000的山羊抗人IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體溶液。在水平振蕩器(400-500rpm)上室溫溫育1小時(shí)后，洗板并用100μlBlueStar溶液(H2O2/TMB)展開(kāi)。在室溫下(18-24℃)溫育15分鐘后，加入100μl1MH2SO4終止反應(yīng)，在雙波長(zhǎng)光度計(jì)上以630nm為參比波長(zhǎng)讀取450nm處的光密度(OD)。
OD值高于8μml的標(biāo)準(zhǔn)液的樣品可在測(cè)定前作進(jìn)一步稀釋。
樣品的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出。
測(cè)定受過(guò)免疫治療的病人體內(nèi)的效價(jià)對(duì)那些經(jīng)受UK101治療的病人進(jìn)行抗UK114抗體效價(jià)測(cè)評(píng)發(fā)現(xiàn)僅僅在UK101給藥(4次皮下注射)15天后，抗體應(yīng)答在28％乳癌患者和46％結(jié)腸癌患者體內(nèi)比背景值高。從開(kāi)始UK101治療40天后，可以分別在63％結(jié)腸癌和97％乳癌患者體內(nèi)檢測(cè)出抗UK114抗體效價(jià)的增加(

圖1和2)。
實(shí)施例3抗UK114抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒效應(yīng)該細(xì)胞毒性研究使用分別用由保藏于ECACC的第930806103號(hào)雜交瘤P3D1DII分泌的單克隆抗體和兔多克隆抗UK114抗體(rAb)間接免疫熒光表面染色陽(yáng)性和陰性的KATO-III(胃癌)和NICH(小細(xì)胞肺癌)腫瘤細(xì)胞系。該細(xì)胞毒性是在異源的(豚鼠)或者同源的補(bǔ)體存在下或者在純化的人單核細(xì)胞存在下，將細(xì)胞系和不同濃度的mAbP3D1DII，Rb抗114Ab或者作為對(duì)照和無(wú)關(guān)的單克隆或多克隆抗體一起培養(yǎng)不同的時(shí)間，以該細(xì)胞系中釋放的51Cr的百分?jǐn)?shù)來(lái)測(cè)評(píng)的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)除了無(wú)關(guān)的對(duì)照抗體外，mAb P3D1DII和抗UK114rAb都能誘導(dǎo)KATO-III的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，但當(dāng)熱滅活或者C9缺陷性血清用作補(bǔ)體源時(shí)則沒(méi)有這種情況。當(dāng)C9缺陷性血清用純化的C9再生時(shí)，細(xì)胞毒性便得到恢復(fù)。此外，當(dāng)KATO-III用作靶細(xì)胞時(shí)，Rb抗UK114Ab而并非無(wú)關(guān)的RbAb誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。用純化的抗原預(yù)吸收抗UK-114Ab消除了抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。相反，對(duì)于NICH沒(méi)有觀察到補(bǔ)體細(xì)胞毒性或者ADCC。這些結(jié)果提示抗UK114抗體對(duì)表面表達(dá)UK114抗原的腫瘤細(xì)胞系具有潛在的補(bǔ)體和抗體細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性。
實(shí)施例4用人腫瘤細(xì)胞系異種移植的裸鼠體內(nèi)的抗UK114抗體的細(xì)胞毒性用1×106HT29人結(jié)腸腺癌細(xì)胞皮下注射以攻擊裸鼠。8小時(shí)后，在它們的腫瘤部位注射0.2ml的用UK114免疫兔而產(chǎn)生的抗UK114兔超免疫(1/12效價(jià))血清。分別在攻擊后第7，11，14，18，21，25天重復(fù)以上處理過(guò)程。另一組小鼠則用已對(duì)UK-114給藥發(fā)生臨床反應(yīng)并產(chǎn)生抗UK114抗體的腫瘤病人的血清進(jìn)行類似的處理。
權(quán)利要求
1.一種免疫檢測(cè)天然抗體的方法，該天然抗體能識(shí)別那些提取于哺乳動(dòng)物器官并被保藏于ECACC的保藏號(hào)為930806103或者930806104的雜交瘤分泌的單克隆抗體所識(shí)別的蛋白并且存在于大約93％的人類實(shí)體瘤中，該方法包括所述天然抗體和選擇性標(biāo)記的蛋白間的免疫復(fù)合物的檢測(cè)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中的免疫復(fù)合物用第二個(gè)標(biāo)記的抗物種抗體檢測(cè)。
3.能識(shí)別那些提取于哺乳動(dòng)物器官并被保藏于ECACC的保藏號(hào)為930806103或者930806104的雜交瘤分泌的單克隆抗體所識(shí)別的蛋白的且存在于大約93％的人類實(shí)體瘤中的天然抗體。
4.包括抗體或者超免疫血清的細(xì)胞毒性組合物，該抗體或者超免疫血清是通過(guò)用高氯酸從羊肝臟中提取的并被保藏于ECACC的保藏號(hào)為930806103或者930806104的雜交瘤分泌的單克隆抗體所識(shí)別的蛋白免疫動(dòng)物或者人而產(chǎn)生的。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)那些能識(shí)別提取于哺乳動(dòng)物器官中的且分子量約為14Kda的蛋白的自然抗體的診斷方法。該抗體在對(duì)異基因物種給藥時(shí)具有抗腫瘤活性。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1166838SQ95195990
公開(kāi)日1997年12月3日 申請(qǐng)日期1995年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月4日
發(fā)明者A·巴托雷利 申請(qǐng)人:澤特希斯有限公司