P?5m?Fc融合蛋白及其表達(dá)基因、制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種P?5m?Fc融合蛋白及其表達(dá)基因、制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。該P(yáng)?5m?Fc融合蛋白由功能單元與人免疫球蛋白IgG1的Fc部分連接構(gòu)成，其中，所述功能單元由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列與連接子連接構(gòu)成，所述連接子為由六個(gè)依次連接的甘氨酸構(gòu)成的多肽，所述P?5m?Fc融合蛋白中至少具有一個(gè)所述功能單元，當(dāng)所述P?5m?Fc融合蛋白中具有多個(gè)所述功能單元時(shí)，多個(gè)所述功能單元順次連接后再與所述免疫球蛋白的Fc部分連接。該P(yáng)?5m?Fc融合蛋白將P?5m與人IgG1的Fc片段融合表達(dá)制成肽體，不僅可以提高P?5m八肽的藥效，還可顯著延長(zhǎng)藥物的半衰期，獲得很好的成藥性。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。
【專利說(shuō)明】
P-5m-Fc融合蛋白及其表達(dá)基因、制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種P-5m-FC融合蛋白及其表達(dá)基因、 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前的研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者喪生的根本原因。P-5m八肽是來(lái)源于高分 子激肽原第五結(jié)構(gòu)域(D5)的一種具有八個(gè)氨基酸的多肽，這是目前發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于D5的有效 抗腫瘤轉(zhuǎn)移的最短多肽。
[0003] 有研究表明，P-5m八肽在細(xì)胞水平能夠抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞的粘附和侵襲，并 能抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，并且在人源HCCLM3肝癌細(xì)胞中具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效 果。
[0004] 但是P-5m八肽給藥后，具有穩(wěn)定性差、半衰期短的缺陷，目前仍難以在臨床中應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，有必要針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種P-5m-Fc融合蛋白，能夠延長(zhǎng)P-5m八肽的 穩(wěn)定性和半衰期，增強(qiáng)其成藥性。
[0000] -種P-5m-Fc融合蛋白，由功能單元與人免疫球蛋白IgGl的Fc部分連接構(gòu)成，其 中，所述功能單元由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列與連接子連接構(gòu)成，所述連接子為由六個(gè) 依次連接的甘氨酸構(gòu)成的多肽，所述P-5m-Fc融合蛋白中至少具有一個(gè)所述功能單元，當(dāng)所 述P-5m-Fc融合蛋白中具有多個(gè)所述功能單元時(shí)，多個(gè)所述功能單元順次連接后再與所述 免疫球蛋白的Fc部分連接。
[0007] 優(yōu)選的，所述P-5m-Fc融合蛋白包括兩個(gè)功能單元。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種編碼上述的P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)基因，表達(dá)基因的序列 為：
[0009] A)由功能單元的核苷酸序列及編碼免疫球蛋白的Fc部分核苷酸序列組合構(gòu)成;或 者
[0010] B)與A)的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與A)的核 苷酸序列不同的序列;或者
[0011] C)對(duì)上述A)或B)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的 核苷酸序列。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述A)中，所述功能單元的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 不。
[0013] 本發(fā)明還公開了一種表達(dá)載體，為具有上述的P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)基因的表 達(dá)載體。
[0014] 優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pET-28a( + )Fc質(zhì)粒。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種上述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0016] (1)構(gòu)建如上所述的表達(dá)基因，并將上述表達(dá)基因插入至載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載 體
[0017] (2)將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，通過(guò)篩選得到陽(yáng)性表達(dá)載體；
[0018] (3)將上述陽(yáng)性表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)細(xì)胞中，對(duì)步驟(1)中的表達(dá)基因序列進(jìn)行誘導(dǎo) 表達(dá)，即得。
[0019] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（1)中，通過(guò)下述方法構(gòu)建重組表達(dá)載體:首先得到堿 基序列組成為SEQIDN0.2的基因片段，以BamHI和NdeI雙酶切pET-28a( + )Fc質(zhì)粒，回收 酶切的載體片段，將上述SEQ ID N0.2的基因片段通過(guò)DNA連接酶插入至上述載體中，得到 重組質(zhì)粒，即為重組表達(dá)載體；
[0020] 步驟(2)中，所述陽(yáng)性表達(dá)載體通過(guò)以下方法得到:通過(guò)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大 腸桿菌感受態(tài)DH5a，涂布于含X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)和氨芐青霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基上，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒，即為陽(yáng)性表達(dá)載體；
[0021] 步驟(3)中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為:將步驟(2)中得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)熱激 法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. col i BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上， 培養(yǎng);挑取單菌落接種至含氨芐青霉素 LBG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入異丙基-β-D-硫代半 乳糖苷，再誘導(dǎo)培養(yǎng);得到P-5m-Fc融合蛋白。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（2)中，通過(guò)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài) DH5a，涂布于含X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 12-16h后，再挑取單菌落，接種于含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒； [0023]步驟(3)中，將步驟(2)中得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16h;挑取單菌 落接種至含50μg/ml氨芐青霉素的LBG培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0.4-0.6，加入異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度0.2-0.6mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心培養(yǎng)物，取沉淀，加入磷酸 鹽緩沖液和上樣緩沖液，煮沸后再次離心，得到P-5m-Fc融合蛋白。
[0024] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括步驟(5)純化:收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)菌體，并用磷酸鹽 緩沖液懸浮，進(jìn)行超聲破碎，離心，得到以包涵體表達(dá)的P-5m-Fc融合蛋白；將上述包涵體以 裂解緩沖液重懸，再經(jīng)過(guò)Triton X/100(聚乙二醇辛基苯基醚），脫氧膽酸鈉，尿素洗滌進(jìn)行 初步純化，經(jīng)初步純化的包涵體用含有尿素和DTT(二硫蘇糖醇）的Tris-HCl的緩沖溶液進(jìn) 行變性溶解，然后通過(guò)氧化還原劑復(fù)性或堿性條件下空氣氧化復(fù)性，得到具有正確構(gòu)象的 活性P-5m-Fc融合蛋白。
[0025] 通過(guò)上述方式，可將存在于包涵體中的錯(cuò)誤折疊形式的蛋白質(zhì)重新折疊為具有正 確構(gòu)象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
[0026] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(5)純化中：將上述包涵體以裂解緩沖液重懸，所 述裂解緩沖液中包括50mmol/LpH8.0的Tris-HCl，lmmol/L的EDTA，100mmol/lL的NaCl，再 經(jīng)過(guò)體積百分?jǐn)?shù)為2 %的Triton X/100，質(zhì)量百分比濃度為0.2 %的脫氧膽酸鈉，lmol/L尿 素洗滌進(jìn)行初步純化；
[0027] 經(jīng)初步純化的包涵體用pH8.0的含有8mmol/L尿素、20mmol/L DTT的25mmol/L的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行變性溶解；
[0028] 再將上述P-5m-Fc融合蛋白以SP-sepharose陽(yáng)離子層析柱進(jìn)行純化，然后通過(guò)氧 化還原劑復(fù)性或堿性條件下空氣氧化復(fù)性；
[0029]所述氧化還原劑復(fù)性的條件為:在純化后的P-5m-Fc融合蛋白緩沖液中，加入DTT 至終濃度lOmmol/L，然后加入還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽至濃度分別為2mmol/L及 0.2mmol/L，再用4mol/L尿素將P-5m_Fc融合蛋白稀釋成0.5mg/ml，以濃度由4mol/L逐步降 低至Omol/L的尿素緩沖溶液透析復(fù)性，該尿素溶液中含相同濃度的還原型和氧化型谷胱甘 肽；
[0030] 所述堿性條件下空氣氧化復(fù)性的條件為:將純化后的P-5m-Fc融合蛋白透析到尿 素含量為8mol/L的ρΗΙΟ.Ο的25mmol/L Tris-HCl緩沖液中，加入DTT至終濃度10mmoI/L，暴 露在空氣中攪拌過(guò)夜，將P-5m-Fc融合蛋白稀釋成0.5mg/ml，以濃度由4mol/L逐步降低至 0mol/L的尿素緩沖溶液透析復(fù)性；
[0031] 通過(guò)復(fù)性得到具有正確構(gòu)象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
[0032]以上述方式重新折疊蛋白，具有較好的復(fù)性效果，并且以SP-sepharose陽(yáng)離子層 析柱進(jìn)行純化，可進(jìn)一步提高融合蛋白純度。
[0033]本發(fā)明還公開了上述的P-5m-Fc融合蛋白在制備用于抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中 的應(yīng)用。
[0034]特別是對(duì)HCCLM3細(xì)胞侵襲基質(zhì)膜有較好的抑制作用，可用于抑制人源肝癌HCCLM3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0036]本發(fā)明的一種P-5m-Fc融合蛋白，將P-5m與人IgGl的Fc片段融合表達(dá)制成肽體，不 僅可以提高P-5m八肽的藥效，還可顯著延長(zhǎng)藥物的半衰期，獲得很好的成藥性。并通過(guò)實(shí)驗(yàn) 研究證實(shí)了其具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。
[0037]本發(fā)明的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，建立了 P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)工藝，并 對(duì)其中的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。
[0038] 并且，還對(duì)由以包涵體表達(dá)的P-5m-Fc融合蛋白的復(fù)性條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，得到 了能夠?qū)⒋嬖谟诎w中的錯(cuò)誤折疊形式的蛋白質(zhì)重新折疊為具有正確構(gòu)象的活性P-5m-Fc融合蛋白的最佳條件。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為實(shí)施例1中pET-28a( + )P-5m-Fc質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖。
[0040]圖中：1為pET-28a( + )P-5m-Fc質(zhì)粒；2為酶切結(jié)果;Μ為DL2000DNA Marker。
[0041 ] 圖2為實(shí)施例2中pET-28a( + )-Fc和pET-28a( + )P-5m-Fc在未誘導(dǎo)情況下的表達(dá)。 [0042]圖中：1和2為大腸桿菌中未誘導(dǎo)情況下pET_28a( + )_Fc的表達(dá)，3和4為大腸桿菌中 未誘導(dǎo)情況下pET-28a( + )P-5m_Fc的表達(dá)，Μ為Protein Marker，箭頭所指為P-5m_Fc融合蛋 白電泳條帶。
[0043] 圖3為實(shí)施例2中pET-28a( + )-Fc和pET-28a( + )P-5m-Fc在誘導(dǎo)情況下的表達(dá)。
[0044]圖中：1為大腸桿菌中誘導(dǎo)情況下pET-28a( + )-Fc的表達(dá)，2和3為大腸桿菌中誘導(dǎo) 情況下pET-28a( + )P-5m-Fc的表達(dá)，Μ為Protein Marker，箭頭所指為P-5m_Fc融合蛋白電泳 條帶。
[0045] 圖4為實(shí)施例2中pET-28a (+) P-5m-Fc包涵體表達(dá)。
[0046]圖中：1和2為菌液裂解后上清中pET-28a( + )P-5m-Fc表達(dá)蛋白；3為菌液裂解沉淀 中pET-28a( + )表達(dá)蛋白；Μ為Protein Marker，箭頭所指為P-5m-Fc融合蛋白電泳條帶。 [0047] 圖5為實(shí)施例2中pET-28a( + )P-5m-Fc表達(dá)產(chǎn)物的初步純化。
[0048] 圖中：1、2和3為菌液裂解后上清中pET-28a( + )P-5m-Fc表達(dá)蛋白；4和5為初步純化 后的pET-28a( + )P-5m-Fc蛋白；Μ為Protein Marker，箭頭所指為P-5m_Fc融合蛋白電泳條 帶。
[0049] 圖6為實(shí)施例2中pET-28a( + )P-5m_Fc表達(dá)產(chǎn)物的純化及Western-blotting結(jié)果。 [0050] 圖中：1為過(guò)柱純化后的pET-28a( + )P-5m-Fc表達(dá)產(chǎn)物，2為pET-28a( + )P-5m-Fc的 Western-blotting結(jié)果，3為pET_28a( + )_Fc的Western-blotting結(jié)果，Μ為Protein Marker〇
[0051 ] 圖7為實(shí)施例3中P-5m-Fc抑制HCCLM3細(xì)胞穿過(guò)transwell小室的侵襲能力放大400 倍示意圖。
[0052] 圖中：Control表示空白對(duì)照;P-5m_Fc ΙΟμ mol表示用終濃度為ΙΟμ mol的P-5m_Fc 處理后結(jié)果；P-5m-Fc 100μ mol表示用終濃度為100μ mol的P-5m-Fc處理后結(jié)果；P-5m-Fc 100μ mol+Ab表示用終濃度為100μ mol的P-5m-Fc與P-5m多克隆抗體共同處理后結(jié)果;P-5m ΙΟμ mol表示用終濃度為ΙΟμ mol的P-5m處理后結(jié)果;P-5m 100μ mol表示用終濃度為100μ mol 的P-5m處理后結(jié)果。
[0053] 圖8為實(shí)施例3中P-5m-Fc抑制HCCLM3細(xì)胞穿過(guò)transwell小室的侵襲能力對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0054]為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中 給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所 描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹 全面。
[0055] 除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具 體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。
[0056] 實(shí)施例1
[0057] P-5m-Fc融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 [0058] 一、方法。
[0059] 1、細(xì)菌質(zhì)粒的提取與純化
[0060]經(jīng)分析，P_5m的氨基酸序列是GHGKHKNK，發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)篩選后，利用大腸 桿菌偏愛(ài)的密碼子合成了 P_5m肽基因正負(fù)鏈，5'端加 ATG，3'端加6個(gè)甘氨酸密碼子(下文中 的GGT GGT GGT GGT GGT GGT部分），并且為了增加效價(jià)，將P-5m肽基因和甘氨酸密碼子進(jìn) 行重復(fù)兩個(gè)循環(huán)，退火后，5'端、3'端分別產(chǎn)生Nde I識(shí)別位點(diǎn)（CAT ATG)和BamH I識(shí)別位點(diǎn) (GGA TCC):正鏈5'-C CAT ATG GGC GAT GGC AAA GAT AAG AAC AAG GGT GGT GGT GGT GGTGGTGGCGATGGCAAAGATAAGAACAAGGGATCCGCG-3'（即SEQIDN0·2所示的核 苷酸序列）；5'-CGC GGA TCC CTT GTT CTT ATC TTT GCC ATC GCC CAT ACC ACC ACC ACC ACC ACC CTT GTT CTT ATC TTT GCC ATC GCC CAT ATG G-3'。
[0061 ] 隨后，按照Nde I和BamH I限制性內(nèi)切酶試劑盒（廠家：Promaga，型號(hào)：R4024和 R6801)公司提供的說(shuō)明書進(jìn)行酶切，以Nde I和BamH I雙酶切pET-28a(+)Fc質(zhì)粒(來(lái)源：參 照下述文獻(xiàn)制備得到:ΤΡ0模擬肽與人IgGIFc片段的融合表達(dá)及其生物學(xué)特性研究。《生物 工程學(xué)報(bào)》，2002，18(4): 424-430;其中，所用含有全長(zhǎng)Fc片段的質(zhì)粒:pCDNA3.1-hIgGl Fc 購(gòu)自北京普博斯貨號(hào):Vn〇062hIgGl Fc)。
[0062] 酶切步驟中，先做單酶切消化，然后抽提、沉淀DNA后溶于TE，再做另一個(gè)酶切。按 以下體系進(jìn)行酶切反應(yīng):PCR回收產(chǎn)物10yL，10XH buffer 2yL/10XT buffer 3yL，兩種核 酸內(nèi)切酶各lyL，最后用ddH20加至20yL，37°C水浴酶切1.5h，65°C滅活瓊脂糖 凝膠電泳鑒定。
[0063] 2、玻璃奶法快速膠內(nèi)回收DNA
[0064] 將上述質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，1.2%瓊脂糖凝膠電泳用于回收含 P-5m和連接子的退火片段，0.8%瓊脂糖凝膠電泳用于回收酶切的載體片段。
[0065] 3、DNA片段的退火
[0066]利用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子合成上述P_5m肽基因正負(fù)鏈，用滅菌水溶解配成 0 . lpmol/yL的濃度，取相同量的正負(fù)鏈寡核苷酸混合，加入退火緩沖液至lx( lOmmol/ LTris，pH7 · 5-8 ·0，50mmol/L NaCl，lmmol/L EDTA)，95°C熱變性5min，然后使其緩慢冷卻至 室溫。
[0067] 4、DNA粘末端連接
[0068] 以T4DNA連接酶連接上述P-5m和連接子肽的基因雙鏈和同樣酶切回收的質(zhì)粒載 體。
[0069] 連接體系為:載體2yL，目的基因5yL，10X連接bufferlyL，T4DNA連接酶lyL，最后 用 ddH20加至 1 OyL。16 °C 連接 12-16h。
[0070] 5、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法）
[0071] 以無(wú)菌接種環(huán)蘸取凍存于-70°C的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含抗生素的LB瓊 脂平板，37 °C培養(yǎng)16h左右。挑取一個(gè)單菌落，接種到3mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培過(guò)夜。次日將3mL菌液加入到預(yù)熱至37°C的100mL不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C 劇烈振搖(250rpm)培養(yǎng)至0D600值約為0.4~0.6(約2.5~3h)。在無(wú)菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液 轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無(wú)菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中（以下操作均需無(wú)菌且在冰水浴中進(jìn)行），冰 浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到(TCc^CSOOOrpm離心10min，棄上清后，用10mL冰預(yù)冷的CaCl 2溶 液（75mM CaCl2，10mmol/L Tris-Cl ρΗ6·5)溶液重懸沉淀，冰浴 10miru4°C5000rpm離心 10min，棄上清，以2mL用冰預(yù)冷的CaCl2保存液(75mM CaCl2，10mmol/L Tris-Cl ρΗ6·5，15% (ν/V)甘油）溶液重懸每管沉淀，用無(wú)菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無(wú)菌微量離心管中，每管 1 OOyL，置-70 °C超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>[0072] 6、轉(zhuǎn)化
[0073]取上述步驟4得到的連接產(chǎn)物5yL用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì) 胞。
[0074] 具體方法為：連接產(chǎn)物5yL加入100yL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42 °C 90s，冰浴3-5min，均勻涂布于含X-gal和IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37 °C培養(yǎng)12-16h;接菌培養(yǎng)： 挑取單菌落，接種于5ml的LB(含50μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)基，37°C200rpm振蕩培養(yǎng)12h。
[0075] 7、質(zhì)粒小提
[0076] 用質(zhì)粒DNA小量快速制備試劑盒提取PCR法快速鑒定篩選得到的陽(yáng)性質(zhì)粒。用V-gene公司質(zhì)粒小提試劑盒小提質(zhì)粒。按如下操作進(jìn)行:收集lmL過(guò)夜培養(yǎng)物，13000rpm離心 30sec，加入150yL的溶液I，渦旋振蕩懸浮細(xì)菌，再加入150yL的溶液II，上下顛倒幾次，室溫 裂解細(xì)菌3~5min，加入400yL的溶液III，室溫沉淀蛋白5min，然后13000rpm離心10min，小 心吸取上清液到DNA-prep tube中，4000rpm離心lmin，用500yL buffer W1洗滌一次，再用 和500yL buffer W2洗滌兩次，13000rpm離心lmin，加入40~50yL的TE到柱子底部，室溫放 置lmin，13000rpm離心lmin，離心下來(lái)的液體即為質(zhì)粒DNA溶液。
[0077] 8、重組質(zhì)粒的鑒定
[0078] 得到的重組質(zhì)粒送上海聯(lián)合基因公司測(cè)序。
[0079] 二、結(jié)果。
[0080] 1、轉(zhuǎn)化結(jié)果。
[0081] 將連接得到的目的片段連接到pET_28a( + )Fc質(zhì)粒中，挑取白色菌落小提質(zhì)粒，進(jìn) 行雙酶切，得到的DNA條帶均與預(yù)期相符，如圖1所示。
[0082] 2、重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
[0083]將得到的重組質(zhì)粒送上海聯(lián)合基因公司測(cè)序，結(jié)果表明，序列閱讀框和方向正確， 說(shuō)明目的基因已經(jīng)正確的插入表達(dá)質(zhì)粒中。
[0084] 實(shí)施例2
[0085] 重組蛋白在宿主菌的表達(dá)及純化
[0086] -、方法。
[0087] 1、轉(zhuǎn)化
[0088]用熱激方法將陽(yáng)性重組質(zhì)粒p轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)BL21(DE3)，在LB抗性(含50μg/ml 氨芐青霉素)瓊脂平板上37°C培養(yǎng)12-16h。挑取單個(gè)菌株的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，接種10ml含50 Pg/ml氨芐青霉素的LBG培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0.4~0.6，加入IPTG至終濃度 為為 0.3mmol/L，200rpm 繼續(xù)培養(yǎng) 3.5h。
[0089] 2、誘導(dǎo)表達(dá)
[0090] 取上述誘導(dǎo)產(chǎn)物lml，5000rpm離心誘導(dǎo)細(xì)菌培養(yǎng)物，棄上清，沉淀加入100yL PBS 混勻，加入2 X SDS上樣緩沖液100yL混勻，煮沸5min，8000rpm，4°C離心5min，取上清20yL進(jìn) 行SDS-PAGE電泳。
[0091] 3、融合蛋白表達(dá)分析
[0092] 誘導(dǎo)菌以6000rpm離心5min后，棄上請(qǐng)，應(yīng)用1/10V的roS懸浮，進(jìn)行超聲，功率為 300W，超5sec，停10sec，共超聲50次。經(jīng)過(guò)超聲后，以12000rpm離心10min，取上清和沉淀分 別進(jìn)行SDS-PAGE。
[0093] 4、包涵體重組蛋白的洗滌、變性
[0094] (1)洗滌：將主要以包涵體形式存在的目的蛋白用裂解緩沖液（5〇111111〇1/11^8-HCl，pH8.0，l mmol/L EDTA，100mmol/lL NaCl)重懸，經(jīng)過(guò)2%Triton X/100(聚乙二醇辛基 苯基醚），0.2%脫氧膽酸鈉，lmol/L尿素洗滌后，得到初步純化。
[0095] (2)變性:初步純化的包涵體用8mmol/L尿素(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0,20mmol/ L DTT)變性溶解6h。
[0096] 5.SP_sepharose陽(yáng)離子層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化
[0097] (1)將SP-sepharose陽(yáng)離子柱（1ml)柱連接到FPLC上，用1 Oml蒸餾水洗柱子。目的 是沖洗柱中的20 %乙醇。
[0098] (2)用5-10個(gè)柱積的起始緩沖溶液（25mmol/L Tris-HCl，pH8 · 0，0 · 2 %二巰基乙 醇，8mol/L尿素)平衡柱子。流速為1 ml/min。
[0099] (3)用注射器或懦動(dòng)栗上樣，流速為lml/min。收集穿過(guò)峰。
[0100] (4)用5-10個(gè)柱積的起始緩沖液洗滌至280nm吸收達(dá)基線水平。
[0101] (5)用 10-25 個(gè)柱積洗脫緩沖液（25mmol/L 1^8-!1(：1，？!18.0,8111〇1/1尿素，1111〇1/1 NaCl)線性梯度洗脫，分管收集每個(gè)洗脫峰。
[0102] (6)洗脫緩沖液再洗脫10個(gè)柱積。
[0103] (7) 12% SDS-PAGE電泳確定目的蛋白所在組分。
[0104] (8)透析:將含目的蛋白的組分對(duì)起始緩沖液透析48h，每8h更換透析液。
[0105] SDS-PAGE檢測(cè)洗脫樣品，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后照相。
[0106] 6、純化的目的蛋白含量測(cè)定
[0107] 利用BCA蛋白定量試劑盒(廠家:Pierce，型號(hào)：23225)，依據(jù)說(shuō)明書測(cè)定純化的融 合蛋白含量。
[0108] 7、重組蛋白的復(fù)性
[0109] 不同氧化條件下的稀釋法復(fù)性
[0110] (1)氧化還原劑：
[0111] 純化后的蛋白緩沖液中，加入DTT至終濃度10mmol/L，作用lh，加入還原型:氧化型 谷胱甘肽（2mmol/L:0.2mmol/L)作用lh。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，用4mol/L尿素稀釋成0.5mg/ ml，以濃度逐步降低(4m〇l/L-2m〇l/L-0m〇l/L)的尿素溶液(含相同濃度還原型氧化型谷胱 甘肽)透析復(fù)性。
[0112] (2)堿性條件下空氣氧化復(fù)性：
[0113] 純化后的P-5m_Fc融合變性蛋白透析到堿性的8mol/L尿素緩沖液中（25mmol/L 1^8-!0，？!110.0)，加入01'1'至終濃度1〇111111〇1/1，作用1小時(shí)，暴露在空氣中攪拌過(guò)夜，根據(jù) 蛋白定量結(jié)果，先稀釋成〇. 5mg/ml，以濃度逐步降低(4mol/L-2mol/L-0mol/L)的尿素緩沖 溶液(25mmol/L Tris-HCl，ρΗ7· 2)透析復(fù)性。
[0114] 二、結(jié)果。
[0115] l、P-5m_Fc融合蛋白的表達(dá)
[0116] 取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)中，挑取單菌落，活化，然后37°C 搖床培養(yǎng)至0D600約為0.6-0.8。加入IPTG至0.5mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，收菌，超聲的方法破 碎菌體，離心，獲得上清與沉淀。取全菌體、超聲上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2，圖3， 和圖4所不，表明P-5m_Fc融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，分子量約為34kD。
[0117] 2、重組蛋白包涵體的洗滌、溶解
[0118] 包涵體主要由重組蛋白和一些菌體雜質(zhì)組成，其中包括RNA聚合酶，細(xì)菌膜蛋白， rRNA和質(zhì)粒DNA等。
[0119] 包涵體的形成一方面利于重組蛋白的分離純化和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，但由于包涵體是 蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊形式，往往沒(méi)有活性，必須使其變性溶解并在適當(dāng)條件下復(fù)性，重新折疊 成具有正確構(gòu)象的活性蛋白分子。一般來(lái)說(shuō)，包涵體溶解之前要先用低濃度的變性劑和去 污劑進(jìn)行洗滌，以除去包涵體表面的雜蛋白。洗滌條件以除去盡可能多的雜蛋白而不溶解 包涵體為最好。經(jīng)過(guò)不同洗滌條件和濃度的摸索，最終確定了2%1^切11乂-100,0.2%脫氧 膽酸鈉，1 mol/L尿素的系列洗滌條件，包涵體得到初步純化，如圖5所示。
[0120] 3、SP-sepharose陽(yáng)離子柱層析純化
[0121] 變性后的融合蛋白經(jīng)陽(yáng)離子柱層析進(jìn)一步得到純化，在pH8.0的情況下，融合蛋白 與陽(yáng)離子樹脂結(jié)合，并被含有NaCI的緩沖液洗脫下來(lái)，如圖6所示。
[0122] 實(shí)施例3
[0123] P-5m-Fc融合蛋白的活性檢測(cè)
[0124] -、Western_blotting 試驗(yàn)
[0125] 將經(jīng)SDS-PAGE分析后的蛋白條帶(Fc和P-5m-Fc融合蛋白）轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以1 % BSA在4°C條件下封閉過(guò)夜，0.05%roST洗滌3次，每次lOmin，加入2000x稀釋的陽(yáng)性血清，37 。(:作用2h，以0.05%roST洗滌3次，每次lOmin，加入25000 x稀釋的兔抗人IgG酶標(biāo)抗體，以 0 · 05 % PBST洗滌3次，每次lOmin，加入PIERCE發(fā)光底物室溫作用3min，于暗室曝光，顯影后 定影，結(jié)果如圖6所示。
[0126] 上述結(jié)果說(shuō)明Fc與P-5m多克隆抗體不能結(jié)合，而P-5m_Fc與P-5m多克隆抗體能夠 特異結(jié)合。
[0127] 二、間接 ELISA 試驗(yàn)
[0128] 1、制備抗P-5m八肽的多克隆抗體
[0129] (1)抗原制備
[0130] 抗原制備多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成多肽片段，利用高 效液相法進(jìn)行純化，純化后的樣品再用HPLC分析，純度>97%。多肽與載體蛋白-血藍(lán)素聯(lián) 接。
[0131] (2)動(dòng)物免疫
[0132] 純化后的多肽抗原液250μ1與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后采用背部 多點(diǎn)注射法免疫新西蘭白兔。2周后取多肽抗原液加等體積弗氏不完全佐劑同法加強(qiáng)免疫， 以后每?jī)芍苊庖咭淮?，全程共免?次，末次免疫后5-7d于耳緣靜脈試血，間接ELI SA方法檢 測(cè)血清達(dá)理想效價(jià)后頸動(dòng)脈放血，收集兔血清。
[0133] (3)免疫兔血清采集及純化
[0134] 采用頸總動(dòng)脈放血法收集兔血清。
[0135] 鹽析法初步純化兔血清：
[0136] A、10mL血清與生理鹽水等體積混合，邊攪拌邊逐滴加入飽和硫酸銨，使其終濃度 為50%，4°C過(guò)夜，使蛋白充分沉淀。
[0137] B、3000rpm/min離心20min，棄上清。10mL生理鹽水溶解沉淀，邊攪拌邊逐滴加入飽 和硫酸銨，使其終濃度為33%，4°C沉淀3h以上。
[0138] C、3000rpm/min 離心 20min，棄上清。
[0139] D、所得沉淀以PBS溶解至5mL，裝入透析袋，4°C以大于其20倍體積的PBS透析1~ 2d，其間更換PBS數(shù)次，直至萘氏試劑檢測(cè)透析外液無(wú)黃色為止。
[0140] E、初步純化的兔血清以C18反相色譜分離柱分離純化后冷凍抽干。（親和純化抗體 IgG凍干粉定量，lmg/支，-20 °C保存）。
[0141] (4)間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià)
[0142] 于注射免疫程序開始前和每次注射免疫后1周，從兔耳緣靜脈取血lmL，離心取上 清測(cè)定血清效價(jià)。
[0143] A、包被:將合成的多肽溶解于0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液中（pH 9.6)配成100μg/ml 的抗原包被液，?〇〇μ1包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照（1:200稀釋的正常兔血清)和空白對(duì) 照(不加一抗），各3復(fù)孔，1 ΟΟμL孔，37 °C包被3h;
[0144] B、洗滌:250yL/孔洗滌液，洗滌3次，每次5min;
[0145] C、封閉：200yL/孔封閉液，37°C封閉2h;
[0146] D、洗滌:250yL/孔洗滌液，洗滌3次，每次5min;
[0147] E、加一抗:加入1:200稀釋的兔免疫血清，100μL7孔，37°C孵育lh;
[0148] F、洗滌:250yL/孔洗滌液，洗滌3次，每次5min;
[0149] G、加二抗:加入 1:10 000羊抗鼠 IgG-HRP，100yL/孔，37°C孵育lh;
[0150] H、洗滌:250yL/孔洗滌液，洗滌5次，每次5min;
[0151] I、顯色：加入0PD使用液，100μL7孔，避光顯色10~20min;
[0152] J、終止反應(yīng):2mo 1/L 硫酸，50yL/孔。
[0153] 酶標(biāo)儀測(cè)定Α492值，以（被檢標(biāo)本值-空白值)/(陰性對(duì)照值-空白值）即Ρ/Ν彡2.1 為陽(yáng)性。
[0154] 2、P_5m八肽抗體的制備和效價(jià)
[0155] 結(jié)果顯示P_5m肽段具有良好的免疫原性，在接受第一次免疫后2周即第3周，體內(nèi) 抗體滴度開始上升，5次主動(dòng)免疫結(jié)束后即第9周，兔抗血清與多肽抗原發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì) 照組兔血清不與多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。家兔免疫后獲得的血清進(jìn)行倍比稀釋，隨著血清稀釋 度的增加，其反應(yīng)孔0D值降低，以P/N 3 2.1為陽(yáng)性，間接EL ISA測(cè)定效價(jià)均大于1:16 0000， 表明獲得高效價(jià)的多抗。
[0156] 3、檢測(cè)
[0157] 將所純化的P-5m-Fc融合蛋白均以lOyg/mL包被酶標(biāo)板，4°C條件下包被過(guò)夜，然后 以0.05 洗滌3次，每次3min，加入1 % BSA于37 °C封閉2h，以0.05 洗滌3次，每次 3min，加入50 X稀釋的陰、陽(yáng)性血清，37°C作用lh，以0.05%PBST洗滌3次，每次3min，加入 10000x稀釋的兔抗人IgG酶標(biāo)抗體，37°C作用0.5h，以0.05%roST洗滌3次，每次3min，加入 底物0PD，37 °C作用15min，2mo 1/L H2S〇4終止，應(yīng)用ELx800酶標(biāo)儀讀取0D490值。
[0158] 結(jié)果表明獲得了高效價(jià)的P-5m多克隆抗體。
[0159] 三、P-5m-Fc肽體抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能研究
[0160] l、Fc對(duì)照蛋白的表達(dá)、純化
[0161]為確定肽部分在發(fā)揮作用，同時(shí)表達(dá)了對(duì)照的Fc蛋白，將構(gòu)建好的pET-28a_Fc融 合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（圖2,3)，收集菌體，超聲破菌，離心收集包涵體 部分，同融合蛋白一樣進(jìn)行洗滌和尿素溶液變性溶解，并純化。
[0162] 2、融合蛋白對(duì)HCCLM3細(xì)胞侵襲基質(zhì)膜的抑制作用
[0163] (1)方法
[0164] A、將無(wú)基質(zhì)膠的Transell小室包被基底膜：用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基在冰上將 Matrigel稀釋至200μg/ml，在每個(gè)上室內(nèi)加入100μΙ混合液體，放入⑶2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)凝結(jié) 30min后，吸走多余液體。
[0165] B、水化基底膜：向上、下室內(nèi)分別加入500μ1無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，放入⑶2恒 溫培養(yǎng)箱內(nèi)水化30min。
[0166] C、制備細(xì)胞懸液：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞進(jìn)行消化，棄去原有培養(yǎng)液，用含 10mg/ml BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5X105cells/ml，并加入終濃度為0μΜ、10μΜ和 100μΜ的P_5m。
[0167] D、接種細(xì)胞:將200μ1不同組細(xì)胞懸液分別接種至transwell上室，下室加入500μ1 含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入C〇2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
[0168] E、固定:吸走上室液體，用棉簽輕柔拭去膜上細(xì)胞和Matrigel膠，用冰冷的甲醇將 膜下細(xì)胞固定l〇min，風(fēng)干。
[0169] F、染色:室溫下用0.1 %結(jié)晶紫染色15min，用無(wú)菌水洗3次，晾干。
[0170] G、置于倒置顯微鏡下(400 X)拍照，每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，比較各組細(xì)胞侵 襲性差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0171] (2)結(jié)果
[0172] 通過(guò)上述transwel 1侵襲實(shí)驗(yàn)，考察P-5m-Fc融合蛋白作用48h后對(duì)肝癌細(xì)胞迀移 的抑制效果。
[0173] 如圖7-8所示，HCCLM3細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10μΜ P-5m-Fc處理組穿膜細(xì)胞數(shù) 比對(duì)照組少31.6%，100μΜ P-5m處理組穿膜細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組少43.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P彡0.05) ;100μΜ的P-5m-Fc與P-5m多克隆抗體共同處理后穿膜細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組少11.9%， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了抗體封閉后P_5m對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果 顯示該抗體能夠封閉P-5m-Fc對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制能力。
[0174] 并且，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還可以看出，10μΜ P-5m-Fc處理組穿膜細(xì)胞數(shù)比相同劑量P-5m處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)少13.0%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P彡0.05); 100μΜ P-5m-Fc處理 組穿膜細(xì)胞數(shù)比相同劑量P-5m處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)少12.3%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)〇
[0175] 通過(guò)上述結(jié)果可以看出，表達(dá)純化后的P-5m-Fc融合蛋白具有較好的抗腫瘤細(xì)胞 侵襲的活性，其抗腫瘤細(xì)胞侵襲的效果優(yōu)于P_5m八肽。
[0176] 以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí) 施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存 在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書記載的范圍。
[0177] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種P-5m-Fc融合蛋白，其特征在于，由功能單元與人免疫球蛋白IgGl的Fc部分連接 構(gòu)成，其中，所述功能單元由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列與連接子連接構(gòu)成，所述連接子 為由六個(gè)依次連接的甘氨酸構(gòu)成的多肽，所述P-5m-Fc融合蛋白中至少具有一個(gè)所述功能 單元，當(dāng)所述P-5m-Fc融合蛋白中具有多個(gè)所述功能單元時(shí)，多個(gè)所述功能單元順次連接后 再與所述免疫球蛋白的Fc部分連接。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)基因，其特征在于，表達(dá)基因的 序列為： A) 由功能單元的核苷酸序列及編碼免疫球蛋白的Fc部分核苷酸序列組合構(gòu)成;或者 B) 與A)的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與A)的核苷酸 序列不同的序列;或者 C) 對(duì)上述A)或B)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷 酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)基因，其特征在于，所述A)中，所述功 能單元的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一種表達(dá)載體，其特征在于，為具有權(quán)利要求2或3所述的P-5m-Fc融合蛋白的表達(dá)基 因的表達(dá)載體。5. -種權(quán)利要求1所述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 構(gòu)建如權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)基因，并將上述表達(dá)基因插入至載體中，構(gòu)建重組 表達(dá)載體 (2) 將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，通過(guò)篩選得到陽(yáng)性表達(dá)載體； (3) 將上述陽(yáng)性表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)細(xì)胞中，對(duì)步驟（1)中的表達(dá)基因序列進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)，即得。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟（1)中，通過(guò)下述方法構(gòu)建重組表達(dá)載體:首先得到堿基序列組成為SEQ ID NO. 2 的基因片段，以BamH I和Nde I雙酶切pET-28a( + )Fc質(zhì)粒，回收酶切的載體片段，將上述SEQ ID NO. 2的基因片段通過(guò)DNA連接酶插入至上述載體中，得到重組質(zhì)粒，即為重組表達(dá)載體； 步驟(2)中，所述陽(yáng)性表達(dá)載體通過(guò)以下方法得到:通過(guò)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿 菌感受態(tài)DH5a，涂布于含X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基 上，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒，即為陽(yáng)性表達(dá)載體； 步驟(3)中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為:將步驟(2)中得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn) 入大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)； 挑取單菌落接種至含氨芐青霉素 LBG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，培養(yǎng)后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷，再誘導(dǎo)培養(yǎng);得到P-5m-Fc融合蛋白。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟（2)中，通過(guò)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5a，涂布于含X-gal、異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16h后，再挑取單菌落，接 種于含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒； 步驟（3)中，將步驟（2)中得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16h;挑取單菌 落接種至含50μg/ml氨芐青霉素的LBG培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0.4-0.6，加入異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度0.2-0.6mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心培養(yǎng)物，取沉淀，加入磷酸 鹽緩沖液和上樣緩沖液，煮沸后再次離心，得到P-5m-Fc融合蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于，還包括步驟 (5)純化:收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)菌體，并用磷酸鹽緩沖液懸浮，進(jìn)行超聲破碎，離心，得到以包 涵體表達(dá)的P-5m-Fc融合蛋白；將上述包涵體以裂解緩沖液重懸，再經(jīng)過(guò)Triton X/100,脫 氧膽酸鈉，尿素洗滌進(jìn)行初步純化，經(jīng)初步純化的包涵體用含有尿素和DTT的Tris-HCl的緩 沖溶液進(jìn)行變性溶解，然后通過(guò)氧化還原劑復(fù)性或堿性條件下空氣氧化復(fù)性，得到具有正 確構(gòu)象的活性P -5m-Fc融合蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的P-5m-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)純化 中：將上述包涵體以裂解緩沖液重懸，所述裂解緩沖液中包括50mmol/L pH8.0的Tris-HCl， 1 mmol/L的EDTA，100mmol/lL的NaCl，再經(jīng)過(guò)體積百分?jǐn)?shù)為2%的Triton X/100,質(zhì)量百分 比濃度為0.2%的脫氧膽酸鈉，lmol/L尿素洗滌進(jìn)行初步純化； 經(jīng)初步純化的包涵體用PH8.0的含有8mmol/L尿素、20mmol/L DTT的25mmol/L的Tris-HC1緩沖液進(jìn)行變性溶解； 再將上述P-5m-Fc融合蛋白以SP-sepharose陽(yáng)離子層析柱進(jìn)行純化，然后通過(guò)氧化還 原劑復(fù)性或堿性條件下空氣氧化復(fù)性； 所述氧化還原劑復(fù)性的條件為：在純化后的P-5m-Fc融合蛋白緩沖液中，加入DTT至終 濃度10mm〇l/L，然后加入還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽至濃度分別為2mmol/L及 0.2mmol/L，再用4mol/L尿素將P-5m_Fc融合蛋白稀釋成0.5mg/ml，以濃度由4mol/L逐步降 低至Omol/L的尿素緩沖溶液透析復(fù)性，該尿素溶液中含相同濃度的還原型和氧化型谷胱甘 肽； 所述堿性條件下空氣氧化復(fù)性的條件為:將純化后的P-5m-Fc融合蛋白透析到尿素含 量為8mol/L的ρΗΙΟ.Ο的25mmol/L Tris-HCl緩沖液中，加入DTT至終濃度10mmoI/L，暴露在 空氣中攪拌過(guò)夜，將P-5m-Fc融合蛋白稀釋成0.5mg/ml，以濃度由4mol/L逐步降低至Omol/L 的尿素緩沖溶液透析復(fù)性； 通過(guò)復(fù)性得到具有正確構(gòu)象的活性P-5m-Fc融合蛋白。10. 權(quán)利要求1所述的P-5m-Fc融合蛋白在制備用于抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK106046177SQ201610695327
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月19日
【發(fā)明人】韓笑, 杜培革, 安麗萍, 徐廣宇, 孫靜波, 苑廣信, 郭笑, 趙南晰, 王曼力, 李洪宇, 盛瑜
【申請(qǐng)人】北華大學(xué)