用于克隆和表達(dá)關(guān)聯(lián)抗體可變區(qū)基因區(qū)段的快速方法
【專利摘要】在本文中報道的方法中，在未中間分離和分析克隆的中間質(zhì)粒的情況下進(jìn)行編碼抗體可變域的核酸區(qū)段的分離，并將分離的核酸區(qū)段插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中。因此，在本文中報道的方法中，不需要例如通過分析分離的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞來中間克隆、分離和分析中間質(zhì)粒。
【專利說明】用于克隆和表達(dá)關(guān)聯(lián)抗體可變區(qū)基因區(qū)段的快速方法
[0001]本文中報道了用于從單一抗體產(chǎn)生B細(xì)胞開始，分離(克隆、表達(dá)和選擇)抗體的方法，其中所述方法的各個步驟都在允許鑒定具有期望的特異性的抗體的溶液中進(jìn)行。
發(fā)明背景
[0002]為了獲得分泌單克隆抗體的細(xì)胞，由Koehler和Milstein研發(fā)的雜交瘤技術(shù)是廣泛使用的。但在雜交瘤技術(shù)中，僅可以融合和增殖一部分獲自經(jīng)免疫的實(shí)驗動物的B細(xì)胞。B細(xì)胞的來源一般是經(jīng)免疫的實(shí)驗動物的器官如脾。
[0003]Zubler等人在1984年開始研發(fā)用于獲得分泌單克隆抗體的細(xì)胞的不同方法(參見例如 Eur.J.1mmunol.14 (1984) 357-363, J.Exp.Med.160(1984) 1170-1183)。其中從經(jīng)免疫的實(shí)驗動物的血液中獲得B細(xì)胞，并在包含細(xì)胞因子的飼養(yǎng)混合物的存在的情況下與鼠EL-4B5飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。使用該方法，10-12天共培養(yǎng)后，可以獲得多達(dá)50ng/ml的抗體。
[0004]ffeitkamp, J.-H.等人(J.1mmunol.Meth.275 (2003) 223-237)報道了從單一抗原特異性B細(xì)胞中產(chǎn)生針對輪狀病毒的重組人單克隆抗體，所述單抗原特異性B細(xì)胞是用熒光病毒樣顆粒選擇的。US2006/0051348中報道了產(chǎn)生針對多個關(guān)聯(lián)抗原(cognateantigen)的多個分離的抗體的方法。W02008/144763和W02008/045140中分別報道了針對IL-6的抗體及其用途，以及用于獲得抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體的培養(yǎng)方法。US2007/0269868中報道了用于獲得抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體的培養(yǎng)方法。Masri等人(在Mol.1mmunol.44 (2007) 2101-2106中)報道了在大腸桿菌中克隆和表達(dá)功能性Fab片段，其獲自針對炭疽毒素的單個人淋巴細(xì)胞。W02007/031550中報道了用于制備免疫球蛋白文庫的方法。 [0005]W02010/056898中報道了從記憶B細(xì)胞中快速表達(dá)和克隆人單克隆抗體。Jin等人(Jin，A.等人，Nature Medicinel5 (2009) 1088-1093)報道了用于從人外周血中篩選抗原特異性的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的快速且有效的單細(xì)胞操作方法。Lightwood等人(Lightwood, Ο-χ 等人，J.1mmunol.Meth.316 (2006) 133-143)報道了通過以下方式產(chǎn)生抗體:針對抗原淘選B細(xì)胞，之后原位培養(yǎng)，并對從抗原陽性孔中全部收獲的細(xì)胞直接進(jìn)行RT-PCR。
[0006]發(fā)明概沭
[0007]在本文報道的方法中，在未中間分離和分析克隆的中間質(zhì)粒/盒的情況下，進(jìn)行編碼抗體(輕鏈和重鏈)可變域的核酸片段或區(qū)段的分離，并將分離的核酸片段或區(qū)段插入到真核表達(dá)盒(每一盒分別用于一個輕鏈和重鏈)中。因此，在本文報道的方法中，不需要例如通過分析分離的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，來中間克隆、分離和分析中間質(zhì)粒/盒，因此，產(chǎn)生了更快的方法。
[0008]本文中報道的一個方面是用于分離編碼抗體的關(guān)聯(lián)可變域的核酸的方法，其包括以下步驟:
[0009]-在RT-PCR中使用獲自抗體分泌B細(xì)胞的RNA作為模板合成單鏈cDNA，
[0010]-在PCR中擴(kuò)增編碼可變域的核酸，并借此分離編碼抗體的關(guān)聯(lián)可變域的核酸片段，[0011]其中在PCR后去除PCR引物。
[0012]在一個實(shí)施方案中，在不分離和分析中間核酸的情況下進(jìn)行該方法。
[0013]本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟:
[0014]-培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的真核細(xì)胞，和
[0015]-從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，
[0016]其中編碼抗體的核酸通過 以下方式獲得
[0017]-在RT-PCR中使用獲自抗體分泌B細(xì)胞的RNA作為模板合成單鏈cDNA，
[0018]-在PCR中擴(kuò)增編碼可變域的核酸，和
[0019]-將編碼可變域的核酸插入到一個或多個真核表達(dá)質(zhì)粒中。
[0020]在一個實(shí)施方案中，在PCR后去除PCR引物。
[0021]在一個實(shí)施方案中，在不分離和分析中間核酸的情況下進(jìn)行該方法。
[0022]本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟:
[0023]-培養(yǎng)用編碼抗體重鏈和輕鏈的一個或多個表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，其中從轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒庫的大腸桿菌細(xì)胞制備所述一個或多個表達(dá)質(zhì)粒，
[0024]-從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體。
[0025]本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟:
[0026]-從真核細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收抗體，所述真核細(xì)胞包含編碼抗體的核酸，
[0027]其中編碼抗體的核酸通過以下方式獲得
[0028]-在PCR中將單鏈cDNA作為模板擴(kuò)增編碼關(guān)聯(lián)可變域的核酸，所述單鏈cDNA獲自抗體分泌B細(xì)胞的RNAjP
[0029]-通過不依賴于連接的克隆，將編碼可變域的核酸插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中，
[0030]其中分別將編碼抗體輕鏈和重鏈可變域的核酸庫用于所述插入。
[0031]在一個實(shí)施方案中，該方法包括第一步:
[0032]-使用RNA作為模板合成單鏈cDNA，所述RNA獲自抗體分泌B細(xì)胞。
[0033]在一個實(shí)施方案中，在PCR后去除PCR引物。
[0034]在一個實(shí)施方案中，在不分離和分析中間核酸的情況下進(jìn)行該方法。
[0035]本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟:
[0036]-培養(yǎng)用編碼抗體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，其中已經(jīng)用表達(dá)質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)染了所述真核細(xì)胞，所述表達(dá)質(zhì)粒庫由轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒庫的大腸桿菌細(xì)胞制備，
[0037]-從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體。
[0038]在一個實(shí)施方案中，編碼抗體的核酸通過以下方式獲得
[0039]-在PCR中將單鏈cDNA作為模板擴(kuò)增編碼關(guān)聯(lián)可變域的核酸，所述單鏈cDNA獲自抗體分泌B細(xì)胞的RNAjP
[0040]-通過不依賴于連接的克隆，將編碼可變域的核酸插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中。
[0041]在一個實(shí)施方案中，該方法包括第一步:
[0042]-使用RNA作為模板合成單鏈cDNA，所述RNA獲自抗體分泌B細(xì)胞。
[0043]在一個實(shí)施方案中，在PCR后去除PCR引物。
[0044]在一個實(shí)施方案中，在不分離和分析中間核酸的情況下進(jìn)行該方法。
[0045]在全部方面的一個實(shí)施方案中，B細(xì)胞是兔B細(xì)胞。[0046]在全部方面的一個實(shí)施方案中，B細(xì)胞是單個沉積的B細(xì)胞。
[0047]在全部方面的一個實(shí)施方案中，B細(xì)胞已培養(yǎng)了大約7天。
[0048]在全部方面的一個實(shí)施方案中，B細(xì)胞及其子代從單細(xì)胞開始，在與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)7天中產(chǎn)生了多于20ng/ml的抗體。
[0049]在全部方面的一個實(shí)施方案中，PCR引物具有SEQ IDN0:5和6或SEQ ID NO:7或8的核酸序列。
[0050]在全部方面的一個實(shí)施方案中，通過測序和不依賴于連接的克隆，將核酸片段插入到表達(dá)質(zhì)粒中。
[0051]在全部方面的一個實(shí)施方案中，將約300ng的核酸用于插入反應(yīng)。
[0052]在全部發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將核酸庫用于插入。
[0053]在全部方面的一個實(shí)施方案中，通過將編碼可變域的核酸測序并不依賴于連接地克隆到無可變域的擴(kuò)增的表達(dá)質(zhì)粒中，來獲得表達(dá)質(zhì)粒。
[0054]在全部方面的一個實(shí)施方案中，質(zhì)粒是在擴(kuò)增之前線性化的。
[0055]發(fā)明詳沭
[0056]定義 [0057]“親和力”指分子(例如抗體)的單個結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間非共價相互作用的總和的強(qiáng)度。除非另外指明，如本文中所用，“結(jié)合親和力”指固有的結(jié)合親和力，其反映了結(jié)合對成員(例如抗體和抗原)之間1:1的相互作用。通?？梢詫⒎肿覺與其配偶體Y的親和力表示為解離常數(shù)(Kd)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，包括本文中所述的那些方法測量親和力。下文描述了用于測量結(jié)合親和力的具體的說明性和示例性實(shí)施方案。
[0058]如本申請中所用，術(shù)語“氨基酸”指一組羧基α-氨基酸，其可以直接或者以前體形式由核酸編碼。各個氨基酸都由三個核苷酸組成的核酸編碼，所以稱為密碼子或堿基三聯(lián)體。每一氨基酸由至少一種密碼子編碼。這稱作“遺傳密碼的簡并性”。如本申請中所用，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，其包含丙氨酸(三字母密碼:ala，單字母密碼:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu, L)、賴氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟顏氨酸(val, V)。
[0059]在本文中，術(shù)語“抗體”以其廣義使用，并包括多種抗體結(jié)構(gòu)，其包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和只要表現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0060]“抗體片段”指非完整抗體的分子，其包含完整抗體的一部分，所述部分與完整抗體結(jié)合的抗原結(jié)合?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F (ab’)2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0061]抗體的“類型”指抗體的重鏈所擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型。例如在人類中存在5種主要的抗體類型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且還可以將它們中的幾種細(xì)分成亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將對應(yīng)于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。
[0062]術(shù)語“抗體可變域的關(guān)聯(lián)對”指獲自單一抗體分泌B細(xì)胞的抗體可變域?qū)?，即在哺乳動物由于與免疫原性分子接觸而導(dǎo)致的免疫應(yīng)答期間已經(jīng)配對產(chǎn)生了所述可變域?qū)蛘咴谡故痉椒ㄖ幸呀?jīng)隨機(jī)組裝成所述可變域?qū)Α?br> [0063]試劑，例如藥物制劑的“有效量”指在所需的時間內(nèi)，對于實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防結(jié)果有效的量(以劑量表示)。
[0064]如本文中所用，術(shù)語“表達(dá)”指細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以及分泌過程?？梢曰诩?xì)胞中存在的相應(yīng)的mRNA的量來測定細(xì)胞中目的核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平。例如，可以通過 qPCR 或 RT-PCR 或者通過 Northern 雜交(參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y.(1989))定量由目的序列轉(zhuǎn)錄的mRNA。可以通過多種方法定量由核酸編碼的多肽，所述方法例如，ELISA、測定多肽的生物學(xué)活性或者應(yīng)用獨(dú)立于該活性的測定法例如使用識別或者與多肽結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡或者放射免疫測定法(參見Sambrook 等人,(1989)，上文)。
[0065]“表達(dá)盒”指含必需的調(diào)控元件，例如啟動子和聚腺苷酸化位點(diǎn)的構(gòu)建體，用于表達(dá)至少在細(xì)胞中含有的核酸。
[0066]術(shù)語“表達(dá)機(jī)器”指參與基因表達(dá)步驟的細(xì)胞的酶、輔因子等的總和，所述基因表達(dá)從核酸或基因的轉(zhuǎn)錄步驟開始(即也稱為“基因表達(dá)機(jī)器)直到由該核酸編碼的多肽的翻譯后修飾。表達(dá)機(jī)器例如包括以下步驟:DNA轉(zhuǎn)錄成前mRNA、前mRNA剪切成成熟的mRNA、將mRNA翻譯成多肽，以及 多肽的翻譯后修飾。
[0067]“表達(dá)質(zhì)?！笔翘峁┯糜谠谒拗骷?xì)胞中表達(dá)所包含的結(jié)構(gòu)基因所需全部元件的核酸。通常，表達(dá)質(zhì)粒包含(例如大腸桿菌的)原核質(zhì)粒增殖單位(其包含復(fù)制起點(diǎn))、選擇標(biāo)記、真核選擇標(biāo)記，以及用于表達(dá)目的結(jié)構(gòu)基因的一個或多個表達(dá)盒，每一表達(dá)盒包含啟動子、結(jié)構(gòu)基因，以及包括多腺甘酸化信號的轉(zhuǎn)錄終止子?；虮磉_(dá)通常位于啟動子的控制之下，并且該結(jié)構(gòu)基因與啟動子“有效連接”。相似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，那么調(diào)控元件和核心啟動子是有效連接的。
[0068]術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且指已經(jīng)引入外源核酸的細(xì)胞，并包括此類細(xì)胞的子代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”、“轉(zhuǎn)染子”、“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”和“轉(zhuǎn)染的細(xì)胞”，不考慮傳代的次數(shù)，所述宿主細(xì)胞包括最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及其衍生的子代。子代在核酸含量方面可以與親本細(xì)胞不完全相同，可以含有突變。本文包括經(jīng)篩選或選擇的具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同的功能或生物學(xué)活性的突變型子代。
[0069]術(shù)語“細(xì)胞”包括原核細(xì)胞(其用于質(zhì)粒的增殖)和真核細(xì)胞(其用于核酸的表達(dá))。在一個實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞選自CHO細(xì)胞(例如 CHO KUCHO DG44) ,BHK 細(xì)胞、NSO 細(xì)胞、Sp2/0 細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞、HEK293EBNA細(xì)胞、PER.C6 ?細(xì)胞和COS細(xì)胞。
[0070]“人抗體”是擁有這樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應(yīng)于由人類或人類細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列或者來自使用人抗體譜產(chǎn)生的非人來源的抗體的氨基酸序列或?qū)?yīng)于其他人抗體編碼序列。人抗體的這種定義特別地排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。[0071]“個體”或“受試者”是脊椎動物。在一個實(shí)施方案中，脊椎動物是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于，馴養(yǎng)的動物(例如，牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如，人類和非人靈長類動物如猴)、兔和嚙齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個體或受試者是人類。在其他實(shí)施方案中，個體或受試者是兔。
[0072]“有效連接”指兩個或者多個組分的并列，其中所述組分在允許它們以期望的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中。例如，如果啟動子和/或增強(qiáng)子順式發(fā)揮作用，以調(diào)控或調(diào)節(jié)所連接序列的轉(zhuǎn)錄，那么它們與編碼序列是有效連接的。通常但并非必須“有效連接”的DNA序列是鄰接的，根據(jù)需要鄰接地并且在(可讀)框內(nèi)連接兩種蛋白質(zhì)編碼區(qū)如分泌前導(dǎo)序列和多肽。然而，盡管有效連接的啟動子通常位于編碼序列的上游，但并非必須與所述編碼序列鄰接。增強(qiáng)子不必是鄰接的。如果增強(qiáng)子增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么增強(qiáng)子與編碼序列是有效連接的。有效連接的增強(qiáng)子可以位于編碼序列的上游、內(nèi)部或下游，并且離啟動子相當(dāng)遠(yuǎn)。如果聚腺苷酸化位點(diǎn)位于編碼序列的下游，使得轉(zhuǎn)錄經(jīng)編碼序列一直進(jìn)行到聚腺苷酸化序列，那么所述聚腺苷酸化位點(diǎn)與編碼序列是有效連接的。如果翻譯終止密碼子位于編碼序列的下游(3’端)，使得翻譯經(jīng)編碼序列一直進(jìn)行至終止密碼子并終止于此，那么所述翻譯終止密碼子與外顯子核酸序列是有效連接的。通過本領(lǐng)域已知的重組方法，例如使用PCR方法和/或通過在合適的限制位點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果不存在合適的限制位點(diǎn)，那么根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，可以使用合成的寡核苷酸接頭。
[0073]術(shù)語“肽接頭”指天然和/或合成來源的氨基酸序列。它們由線性氨基酸鏈組成，其中20個天然存在的氨基酸是單體結(jié)構(gòu)單元。肽接頭具有I至50個氨基酸長度，在一個實(shí)施方案中I至28個氨基酸長度，在另外的實(shí)施方案中2至25個氨基酸長度。肽接頭可以含有重復(fù)的氨基酸序列或者天然存在的多肽的序列。通過允許多肽正確折疊且合適地呈現(xiàn)，接頭具有確保相互連接的多肽可以執(zhí)行其生物學(xué)活性的功能。在一個實(shí)施方案中，肽接頭富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或絲氨酸殘基。這些殘基例如以多達(dá)5個氨基酸的小重復(fù)單元排列，例如 GS (SEQ ID NO:1)、GGS (SEQ ID NO: 2)、GGGS (SEQ ID NO: 3)和 GGGGS (SEQ ID NO: 4) ?小的重復(fù)單元可以重復(fù)I至5次。在多體單元的氨基端和/或羧基端，可以添加多達(dá)6個額外的隨機(jī)天然存在的氨基酸。其他合成的肽接頭由重復(fù)10至20次的單個氨基酸組成，并且在氨基端和/或羧基端可以包含多達(dá)6個額外的隨機(jī)天然存在的氨基酸。全部肽接頭都可以由核酸分子編碼，因此可以重組地表達(dá)。由于接頭本身是肽，所以通過接頭連接的多肽通過兩個氨基酸之間形成的肽鍵與接頭連接。
[0074]相對于參考肽序列的“氨基酸序列百分比)同一性”定義為比對序列且引入空位后，候選序列的氨基酸殘基中與參考多肽序列的氨基酸殘基中相同的氨基酸殘基的百分比，根據(jù)需要，實(shí)現(xiàn)最大的序列百分比同一性，并且不將任何保守替換考慮為序列同一性的一部分。可以以本領(lǐng)域中已知的多種方式，例如使用公眾可用的計算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件實(shí)現(xiàn)用于測定氨基酸序列百分比同一性的比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對序列的合適參數(shù)，包括在全長的待比較序列上實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。為此，使用序列比較計算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生氨基酸序列百分比同一性。Genentech, Inc.已經(jīng)創(chuàng)作了 ALIGN-2序列比較計算機(jī)程序,在U.S.CopyrightOffice, Washington D.C.，20559處使用用戶文檔存檔了源編碼，并且已經(jīng)以U.S.CopyrightRegistration N0.TXU510087 注冊。ALIGN-2 程序可從 Genentech, Inc., South SanFrancisco, California公開獲得，或者可以編譯自源編碼。應(yīng)當(dāng)編譯用于UNIX運(yùn)行系統(tǒng)，包括數(shù)字UNIX V4.0D的ALIGN-2程序。ALIGN-2程序設(shè)定了全部序列比較參數(shù)，并且不需要更改。
[0075]在將ALIGN-2應(yīng)用于氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A與給定氨基酸序列B的氨基酸序列百分比同一性(可備選地表述為與給定氨基酸序列B具有或者包含一定的氨基酸序列百分比同一性的給定氨基酸序列A)可計算如下:
[0076]100乘以分?jǐn)?shù)X/Y
[0077]其中X是通過序列比對程序ALIGN-2進(jìn)行的A和B的程序比對中，評分為同一性匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，其中氨基酸序列A的長度并不等于氨基酸序列B的長度，A與B的氨基酸序列百分比同一性并不等于B與A的氨基酸序列百分比同一性。除非另外指明，如前一段中所述，使用ALIGN-2計算機(jī)程序獲得本文中所使用的全部氨基酸序列百分比同一性值。
[0078]“多肽”是由肽鏈連接的氨基酸組成的聚合物，所述多肽可以是天然或合成產(chǎn)生的。可以將少于約25個氨基酸殘基的多肽稱為“肽”，而將由兩個或多個多肽組成的分子或者包含100個氨基酸殘基以上的一個多肽的分子稱為“蛋白質(zhì)”。多肽還可以包含非氨基酸組分，例如糖基、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可以通過細(xì)胞添加，并且可以根據(jù)細(xì)胞的類型而改變，其中多肽是表達(dá)的。在本文中，根據(jù)多肽的氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼所述氨基酸骨架的核酸來定義多肽。附加物如糖基通常并不指明，但仍可以存在。
[0079]“結(jié)構(gòu)基因”指沒有信號序列的基因區(qū)域，即編碼區(qū)。
[0080]術(shù)語“可變區(qū)” 或“可變域”指參與抗體與抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)域包含4個保守的構(gòu)架區(qū)(FR)和三個超變區(qū)(HVR)(參見例如，Kindt，T.J.等人，KubyImmunology, 6th ed., ff.H.Freeman and C0., Ν.Y.(2007),第 91 頁)。單個 VH 或 VL 結(jié)構(gòu)域足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域分離結(jié)合特定抗原的抗體，以分別篩選互補(bǔ)的VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫(參見例如,Portolano, S.等人，J.1mmunol.150 (1993) 880-887 ；Clackson, T.等人，Nature352 (1991) 624-628)。
[0081 ] 術(shù)語“變體”指親本氨基酸序列的變體，其包含一個或多個氨基酸替換、添加或缺失。
[0082]術(shù)語“載體”指能使與其連接的另一核酸增殖的核酸分子。該術(shù)語包括這樣的載體，其為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)或摻入到已經(jīng)引入所述載體的宿主細(xì)胞的基因組中。某些載體能指導(dǎo)與它們有效連接的核酸的表達(dá)。在本文中，將此類載體稱為“表達(dá)載體”。
[0083]本文中報道的方法的一般步驟
[0084]免疫
[0085]通常將非人動物，例如小鼠、兔、倉鼠和大鼠作為評價基于抗體的治療的動物模型。還可以使用在特定疾病之后仍存活的、患慢性病的或者近期針對特定疾病接種了疫苗的人類的B細(xì)胞。
[0086]在本文報道的方法中，可以使用獲自例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、綿羊、駱馬或人類的B細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，小鼠是NMR1-小鼠或balb/c-小鼠。在另一個實(shí)施方案中，倉鼠選自亞美尼亞倉鼠(Cricetulus migratorius)、中國倉鼠(Cricetulus griseus)和敘利亞倉鼠(Mesocricetulus auratus)。在特定的實(shí)施方案中，倉鼠是亞美尼亞倉鼠。在一個實(shí)施方案中，兔選自新西蘭(NZW)白兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia_突變系兔、basilea突變系兔、用人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)基因的兔、兔IgM敲除的兔及其雜交育種。
[0087]在一個實(shí)施方案中，挑選的用于免疫的實(shí)驗動物，例如小鼠、倉鼠、大鼠和兔不大于12周。
[0088]B細(xì)胞的來源和分離
[0089]實(shí)驗動物或人類的血液提供了抗體產(chǎn)生B細(xì)胞的高度多樣性。由其獲得的B細(xì)胞分泌的抗體在CDR內(nèi)具有幾乎不相同或者重疊的氨基酸序列，因此所述抗體顯示出高度的多樣性。
[0090]在一個實(shí)施方案中，來自實(shí)驗動物或人類的，例如血液的B細(xì)胞獲自免疫后4天至免疫后或者最近一次加強(qiáng)免疫后至少9天。在本文報道的方法中，該時間跨度允許高度的靈活性。在該時間跨度中，提供最具親和力(affine)抗體的B細(xì)胞有可能從脾遷移至血液中(參見例如 Paus, D.等人，JEM203 (2006) 1081 - 1091 ；Smith, K.G.S.等人，The EMBOJ.16 (1997) 2996 - 3006 ；fframmert, J.等人，Nature453 (2008) 667-672)。
[0091]可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得來自實(shí)驗動物或人類的血液的B細(xì)胞。例如，可以使用密度梯度離心(DGC)或紅細(xì)胞裂解(裂解)。與裂解相比，密度梯度離心提供了更高的總產(chǎn)率，即B細(xì)胞克隆的數(shù)目。除通過密度梯度離心獲得細(xì)胞外，在共培養(yǎng)步驟中分裂和培養(yǎng)了大量的細(xì)胞。與使用不同方法獲得的細(xì)胞相比，通過密度梯度離心獲得的分泌抗體的濃度也更高。因此，在一個實(shí)施方案中，通過密度梯度離心提供B細(xì)胞群體。
[0092]mRNA的分離、克隆和測序
[0093]從B細(xì)胞中分離總mRNA，并轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用特異性引物，可以擴(kuò)增編碼關(guān)聯(lián)VH和VL區(qū)的核酸。使用本文中報道的方法，幾乎未獲得相同的序列。因此，該方法提供了與相同抗原結(jié)合的高度多樣性抗體。
[0094]在一個實(shí)施方案中，本文中報道的方法用于產(chǎn)生包含關(guān)聯(lián)抗體可變域的抗體。在一個實(shí)施方案中，關(guān)聯(lián)抗體可變域來自單個B細(xì)胞。
[0095]可以提供引物，以擴(kuò)增獲自NMR1-小鼠、亞美尼亞倉鼠、Balb/c-小鼠、敘利亞倉鼠、兔、大鼠、綿陽、駝馬和人類的B細(xì)胞的編碼VH的核酸。
[0096]本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟:
[0097]a)在單獨(dú)的容器(在一個實(shí)施方案中，容器是多孔板的孔)中，從染色的B細(xì)胞群體(在一個實(shí)施方案中，用I至3種或者2至3種熒光染料對B細(xì)胞染色)中沉積單個(成熟的)B細(xì)胞(獲自實(shí)驗動物或人類的血液或淋巴器官)，
[0098]b)在飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)混合物(在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是EL-4B5細(xì)胞，在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)混合物是天然的TSN(來自與B細(xì)胞所來源的物種相同的實(shí)驗動物的胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清液)，在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)混合物是合成的飼養(yǎng)混合物)存在的情況下培養(yǎng)沉積的各個B細(xì)胞，
[0099]c)通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和核苷酸測序，測定特異性結(jié)合的抗體的輕鏈可變域和重鏈可變域的氨基酸序列，從而獲得編碼單克隆抗體輕鏈可變域和重鏈可變域的核酸，
[0100] d)在各個HC和LC表達(dá)盒中培養(yǎng)包含編碼可變輕鏈和可變重鏈的核酸的細(xì)胞，并從細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，從而產(chǎn)生抗體。
[0101]在一個實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟:
[0102]a)提供(成熟)B細(xì)胞群體(獲自實(shí)驗動物或人類的血液或淋巴器官)，
[0103]b)用至少一種熒光染料(在一個實(shí)施方案中，使用I至3種或者2至3種熒光染料)對B細(xì)胞群體的細(xì)胞染色，
[0104]c)在單獨(dú)容器(在一個實(shí)施方案中，容器是多孔板的孔)中沉積染色的B細(xì)胞群體的單細(xì)胞，
[0105]d)在飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)混合物(在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是EL-4B5細(xì)胞，在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)混合物是天然的TSN(來自與B細(xì)胞所來源的物種相同的實(shí)驗動物的胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清液)，在一個實(shí)施方案中，飼養(yǎng)混合物是合成的飼養(yǎng)混合物)存在的情況下培養(yǎng)沉積的各個B細(xì)胞， [0106]e)測定各個B細(xì)胞的培養(yǎng)物中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0107]f)分離分泌具有期望的結(jié)合特異性的抗體的B細(xì)胞的總RNA，
[0108]g)用對輕鏈可變域和重鏈可變域特異的引物，用polyA+提取的mRNA進(jìn)行RT-PCR，
[0109]h)測定特異性結(jié)合抗體的輕鏈可變域和重鏈可變域的氨基酸序列，
[0110]i)將編碼單克隆抗體輕鏈可變域和重鏈可變域的核酸引入用于表達(dá)抗體的各個表達(dá)盒中，
[0111]j)將核酸引入到細(xì)胞中，
[0112]k)培養(yǎng)細(xì)胞，并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，從而產(chǎn)生抗體。
[0113]具體的實(shí)施方案
[0114]在本文報道的方法中，在未中間分離和分析克隆的中間質(zhì)粒的情況下，進(jìn)行編碼抗體(輕鏈和重鏈)可變域的核酸區(qū)段的分離，并將分離的核酸區(qū)段插入到真核表達(dá)質(zhì)粒(每一表達(dá)盒分別用于一個輕鏈和重鏈)中。因此，在本文報道的方法中，不需要例如通過分析分離的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，來中間克隆、分離和分析中間盒/質(zhì)粒。在一個實(shí)施方案中，在未中間分離和分析克隆的中間質(zhì)粒的情況下進(jìn)行本文中報道的方法。
[0115]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本文中報道的方法中，可將特異性聚合酶鏈反應(yīng)后獲得的編碼抗體的重鏈和輕鏈可變域的各個核酸片段分別插入到真核表達(dá)構(gòu)建體中(每一真核表達(dá)構(gòu)建體用于一個鏈)，并在不需要中間接種(plating)的情況下進(jìn)行放大，所述中間接種用于挑選和分析獲自經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的單個克隆的質(zhì)粒DNA。
[0116]通常，將限制酶切割位點(diǎn)分別設(shè)計到正義和反義引物中，以允許將PCR片段插入到合適設(shè)計的表達(dá)載體中。然而，連接過程的相對高度混雜導(dǎo)致了相當(dāng)大的數(shù)量的各個質(zhì)粒克隆，其含未插入核酸片段(“空載體”)、含以錯誤方向插入的核酸片段或者僅含待克隆核酸的不完全片段。該問題通常通過將連接反應(yīng)物接種在固體培養(yǎng)基上，通過分離各個細(xì)菌克隆解決。然后挑選這些細(xì)菌克隆中的幾個，培養(yǎng)于液體培養(yǎng)物中，并且針對所插入的核酸片段的方向和完整性，分析這些克隆中含有的各個質(zhì)粒。然后選擇一個正確裝配的質(zhì)粒并進(jìn)一步擴(kuò)增，以用于例如所編碼的多肽的重組表達(dá)。盡管該方法是一種用于克隆小的有限數(shù)量的DNA片段的多次測試的方法，但由于需要挑選、擴(kuò)增和分析源自如上所述的單個克隆的質(zhì)粒DNA，所以當(dāng)需要克隆大量的核酸片段時，該方法是繁瑣、費(fèi)力和費(fèi)時的。
[0117]因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以在不需要中間分離和分析單個克隆的情況下，在一個連貫的工作流程中進(jìn)行從DNA片段的最初產(chǎn)生以及克隆到表達(dá)載體中直到重組表達(dá)通過各個質(zhì)粒載體編碼的多肽的整個工作流程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將不依賴于連接的克隆作為一種方法應(yīng)用于改進(jìn)上述工作流程是有利的。因此，在一個實(shí)施方案中，通過不依賴于連接的克隆插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中。
[0118]不依賴于連接的克隆同樣不需要比通過限制和連接的常規(guī)克隆更高效，即在該意義上不需要獲得的各個克隆的數(shù)目顯著更高。但由于該方法基于互補(bǔ)單鏈DNA突出端的序列特異性退火，而不是用于裝配復(fù)雜分子的酶促連接，所以該方法包含了待克隆的各個核酸片段的顯著更長的互補(bǔ)單鏈端。因此，與通過限制酶產(chǎn)生的2-4個核苷酸對比，在不依賴于連接的克隆中通常使用包括15-30個核苷酸的單鏈核苷酸突出端。此外，由于在不依賴于連接的克隆中不存在連接酶，所以不會發(fā)生空載體的再連接。因此，在不依賴于連接的克隆中，就大小、方向和完整性而言，增加了核酸片段正確插入到載體的比例，而且同時減少了完全不含插入核酸片段的“空的”再連接載體的比例，以及含缺損DNA片段的質(zhì)粒的頻率。事實(shí)上，通過不依賴于連接的克隆獲得的克隆產(chǎn)物的分析顯示，全部質(zhì)粒分子的90%以上都含有以正確方向全長插入的核酸。
[0119]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于絕大多數(shù)由此產(chǎn)生的全部質(zhì)粒分子都含有正確插入的核酸片段，所以可以在液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)并放大轉(zhuǎn)化細(xì)菌的整個庫，而不需要將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基上、分離單個克隆，以及分析和分離各個質(zhì)粒DNA克隆的中間步驟。使用本文中報道的方法，可以實(shí)現(xiàn)所需時間和勞動的減少。使用此種改進(jìn)的方法，可以進(jìn)行該過程的自動化。
[0120]下表概述了經(jīng)典方法與本文中報道方法之間的差異?？梢钥闯觯璨襟E的數(shù)目可以減少40%以上。
[0121]表
[0122]
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟: -從真核細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收所述抗體，所述真核細(xì)胞包含編碼所述抗體的核酸， 其中編碼所述抗體的核酸通過以下方式獲得 -在PCR中將單鏈CDNA作為模板擴(kuò)增編碼關(guān)聯(lián)可變域的核酸，所述單鏈CDNA獲自抗體分泌B細(xì)胞的RNA，和 -通過不依賴于連接的克隆，將編碼可變域的核酸插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中， 其中分別將編碼抗體輕鏈可變域和重鏈可變域的核酸庫用于所述插入。
2.用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟: -培養(yǎng)用編碼所述抗體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，其中已經(jīng)用表達(dá)質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)染了所述真核細(xì)胞，所述表達(dá)質(zhì)粒庫由轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒庫的大腸桿菌細(xì)胞制備， -從所述真核細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述B細(xì)胞是兔B細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3中任一項的方法，其特征在于所述B細(xì)胞是單個沉積的B細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3或4中任一項的方法，其特征在于培養(yǎng)所述B細(xì)胞約7天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和3至5中任一項的方法，其特征在于所述B細(xì)胞及其子代從單細(xì)胞開始，在與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)的7天中產(chǎn)生了多于20ng/ml的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3至6中任一項的方法，其特征在于所述PCR引物具有SEQIDNO:5和6或SEQ ID NO:7或8的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和3至7中任一項的方法，其特征在于在所述PCR之后去除所述PCR引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其特征在于通過測序和不依賴于連接的克隆，將所述核酸片段插入到所述表達(dá)質(zhì)粒中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和3至9中任一項的方法，其特征在于將約300ng核酸用于所述插入反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其特征在于通過將所述編碼可變域的核酸測序并不依賴于連接地克隆到無可變域的擴(kuò)增的表達(dá)質(zhì)粒中，來獲得所述表達(dá)質(zhì)粒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于在所述擴(kuò)增之前線性化所述質(zhì)粒。
【文檔編號】C12N15/10GK104011074SQ201280060807
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】S·霍格, E·科佩茨基, D·奧斯特勒, S·西伯爾, G·蒂芬塔勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司