抗多亞基因型hcv抗體基因r4-85及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85,還涉及該 抗體基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 迄今為止，全球約有1億7千萬(wàn)丙型肝炎病毒（hepatits C virus，HCV)感染者， 占世界人口總數(shù)的3 %。WHO估計(jì)全球HCV感染新發(fā)病例以每年3至4百萬(wàn)的速度遞增。 HCV主要經(jīng)血行傳播，感染后慢性化比例高達(dá)80%，是導(dǎo)致肝硬化、肝癌的重要原因。HCV屬 黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。HCV基因組高度變異，根據(jù)基因組的異質(zhì) 性，共分為7個(gè)基因型近100種亞型。在全球，HCV感染具有明顯的人種及地理分布差異性， 如：世界主要流行的HCV亞型是1&、11^、2&、213、3&型，而中國(guó)主要流行亞型為113、2 &、3&、313、 6a型。HCV還以準(zhǔn)種形式存在于患者體內(nèi)（即一組遺傳學(xué)上密切相關(guān)又各不相同的病毒株 存在于宿主體內(nèi)）。HCV所具有的這些特性，給HCV的診斷、治療及預(yù)防都帶來(lái)了及大的因 難。到目前為止，在診斷上尚無(wú)各亞型通用的病毒抗原檢測(cè)試劑。在治療上，聚乙二醇干擾 素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒方案使應(yīng)答率升高，但存在明顯的副作用，最近開(kāi)發(fā)的HCV特異 性直接抗病毒藥物則因?yàn)閮r(jià)格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。在預(yù)防方面，也未開(kāi)發(fā)出安全而有 效的HCV疫苗。
[0003] 2001 年 Ania Owsianka 首次發(fā)現(xiàn)在 HCV E2 N-末端（aa412-423)存在一個(gè)在 各亞型HCV中均高度保守的線性表位，并且隨后的研究證實(shí)該表位是HCV受體CD81的結(jié) 合表位。與該表位特異性結(jié)合的抗體與各亞型HCV具有廣泛的結(jié)合特性和中和能力，如： AP33 (mouse)、3/11 (Rat)、HCVl (human)、Hc33. I (human)等。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)這類(lèi)抗-HCV 廣泛性結(jié)合抗體在人肝嵌合鼠模型中不僅可以預(yù)防HCV感染，而且還可以治療已經(jīng)建立的 HCV感染，這對(duì)于預(yù)防肝移植術(shù)后高達(dá)80%的HCV再感染及治療全球1. 7億HCV已感染者 具有重大的現(xiàn)實(shí)意義，這類(lèi)廣泛結(jié)合抗體也為HCV疫苗的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。但是，已 報(bào)道的廣泛交叉結(jié)合抗體并非都對(duì)HCV所有基因型具有中和作用，且針對(duì)不同基因型的中 和能力存在差異。故分離到全球通用的廣泛結(jié)合性抗-HCV抗體可能十分困難，因此從中國(guó) HCV感染人群中分離出的廣泛結(jié)合性抗-HCV抗體可能更匹配中國(guó)流行的HCV亞型，也更適 合應(yīng)用于我國(guó)的HCV診斷、治療及疫苗研究等領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85 ;本發(fā)明 的目的之二在于提供由所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85編碼的抗體；本發(fā)明的目的 之三在于提供含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85的重組載體；本發(fā)明的目的之四 在于提供含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85的噬菌體；本發(fā)明的目的之五在于提 供抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備HCV診斷的試劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之六 在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備預(yù)防HCV感染的疫苗中的應(yīng)用；本發(fā)明 的目的之七在于提供抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備治療HCV感染的藥物中的應(yīng) 用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85,所述抗體基因 R4-85的重鏈氨基酸序列如 SEQ ID NO. 38所示或SEQ ID NO. 38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸并具 有相同活性的氨基酸序列；輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 39所示或SEQ ID NO. 39所示氨 基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列，其抗多亞基因 型HCV抗體基因 R4-85的構(gòu)建過(guò)程如圖4所示。
[0007] 優(yōu)選的，所述抗體基因 R4-85的重鏈和輕鏈由（G4S)3連接肽連接。本發(fā)明中（G4S) 3連接肽的核苷酸序列如SEQIDN0·40所示，具體序列為：5'-ggtggaggcggttcaggcggaggtg gctctggcggtggcggatcg-3,。
[0008] 2、由所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85編碼的抗體。優(yōu)選的，所述抗體為單 鏈抗體、包括兩條重鏈和兩條輕鏈的單體分子或由單體分子聚合成的多聚體。
[0009] 3、含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85的重組載體。
[0010] 4、含有所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85的噬菌體。
[0011] 5、所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備HCV診斷的試劑中的應(yīng)用。
[0012] 6、所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備預(yù)防HCV感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0013] 7、所述抗多亞基因型HCV抗體基因 R4-85在制備治療HCV感染的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)提取39例HCV感染者（涵蓋中國(guó)地區(qū)主 要HCV流行亞型）的外周血白細(xì)胞mRNA，并采用T7噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了足 夠大的抗多亞型HCV scFv噬菌體展示庫(kù)，原始庫(kù)及擴(kuò)增庫(kù)的庫(kù)容分別為3. 6X IO7PFU及 I. 12X10nPFU/mL，通過(guò)對(duì)原始庫(kù)中隨機(jī)挑選的12個(gè)scFv克隆進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā) 現(xiàn)兩兩之間均不相同，表明該噬菌體展示抗體庫(kù)具有足夠大的多樣性，最后通過(guò)HCV E2區(qū) aa412~423線性表位肽QLINTNGSWHIN進(jìn)行淘選，分離得到與這個(gè)在各亞型HCV E2區(qū)均高 度保守的線性表位高特異性結(jié)合的R4-85scFV抗體基因（s/n = 24)。研究已經(jīng)證實(shí)，HCV E2區(qū)aa412~423線性表位在各HCV亞型中均高度保守并且是HCV進(jìn)入肝細(xì)胞的重要受 體CD81的結(jié)合位點(diǎn)，與此表位特異性結(jié)合的抗體對(duì)各亞型HCV具有廣泛結(jié)合特性及中和能 力，對(duì)HCV診斷、治療及疫苗研發(fā)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0016] 圖1為人源性HCV scFv噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建（A :丙型肝炎患者外周血來(lái)源的 IgG、IgM重鏈及輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增條帶，M代表DNA Marker ;B :針對(duì)低拷貝或單拷貝抗體基 因采用半巢式PCR進(jìn)行第一輪擴(kuò)增的目的條帶，1-5分別代表以下上游引物：HuVH2aSS， HuVH6aSS，HuV κ 5aSS，HuV κ 6aSS，HuV λ 5SS ;C :采用重疊延伸PCR法連接重鏈與輕鏈可變 區(qū)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，1 代表 VL κ -linker-VH scFv ;2 代表 VL λ -linker-VH scFv)。
[0017] 圖2為每輪生物淘選后噬菌體克隆與HCV E2區(qū)aa412_423序列結(jié)合活性的對(duì)比 結(jié)果，采用ELISA方法檢測(cè)克隆的結(jié)合特性，每輪淘選均設(shè)陰性對(duì)照，無(wú)游離肽段被親和素 捕獲。
[0018] 圖3為淘選的R4-85陽(yáng)性克隆與特異性識(shí)別E2蛋白aa412-423序列的其他中和 抗體的CDRs區(qū)比對(duì)（★表示該位點(diǎn)氨基酸在所有序列中相同，#表示該位點(diǎn)氨基酸相同的 序列數(shù)彡3)。
[0019] 圖4為HCV scFv抗體構(gòu)建流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例的研究對(duì)象如下：慢性HCV感染者及其血清樣本均來(lái)自西南醫(yī)院感 染科門(mén)診患者?？偣?9人份抗-HCV陽(yáng)性患者抗凝外周血，每份3mL。包括中國(guó)主要流行 HCV亞型：Ib型7例，2a型2例，3a型5例，3b型5例，6a型4例，基因型不確定16例（經(jīng) 抗病毒治療，HCV RNA已陰轉(zhuǎn)）。新鮮采集的患者外周抗凝血立即與33mL RNA/DNA固定劑 (RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow) (Roche)混合，_2(TC保存?zhèn)?用。
[0022] 實(shí)施例1、引物設(shè)計(jì)
[0023] 根據(jù)John McCafferty的報(bào)道設(shè)計(jì)人IgG、IgM重鏈恒定區(qū)及κ、λ輕鏈恒 定區(qū)mRNA基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，以及重鏈、輕鏈可變區(qū)PCR擴(kuò)增引物（McCafferty ],Griffiths Ad Fau-ffinter G? Winter G Fau-Chiswell DJ? Chiswell DJ.Phage antibodies ：filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 1990 ； 348(6301) :552-4.)。為了方便插入T7噬菌體載體，在輕鏈可變區(qū)（VL)正向引物5'端 及重鏈可變區(qū)（VH)反向引物5'端分別加上EcoR I及Hind III酶切位點(diǎn)。為了產(chǎn)生 VL-Iinker-VH基因片段，采用重疊延伸PCR的方式連接PCR擴(kuò)增的VL和VH片段，并在VL 反向引物5'端及VH正向引物5'端分別加上彼此反向重疊互補(bǔ)的（G4S)3連接肽編碼序列。 引物scFvSS和scFvAS用于最后生成完整的scFv基因片段，所有引物序列如表1所示。
[0024] 表1、人源性抗多亞基因型HCV scFv噬菌體展示庫(kù)構(gòu)建所用引物
[0025] CN 105177017 A 說(shuō)明書(shū) 4/10 頁(yè)

CN 105177017 A 說(shuō)明書(shū) 6/10 頁(yè)
[0028] 實(shí)施例2、mRNA抽提及cDNA合成
[0029] 聯(lián)合 RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow(Roche)和 mRNA isolation kit for blood/bone marrow(Roche)，用磁珠法直接從外周血白細(xì)胞中分離提 取mRNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定提取的mRNA濃度及A260/A280值。結(jié)果顯示，每毫升患者 抗凝外周血細(xì)胞中平均獲取130ng mRNA，A260/A280值為1. 90~2. 00,表明分離提取mRNA 可以用于建庫(kù)，然后_80°C保存?zhèn)溆?。各取?0ng從所有樣本提取的mRNA做模板，分別用 人IgG、IgM重鏈恒定區(qū)，κ、λ輕鏈恒定區(qū)mRNA基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，ProtoSeript? II First Strand cDNA Synthesis Kit(NEB)合成 cDNA，合并 cDNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 實(shí)施例3、單鏈可變區(qū)片段（scFv)擴(kuò)增
[0031] PCR擴(kuò)增重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，具體操作方法如下：等摩爾濃度分別預(yù)混重鏈及 κ、λ輕鏈可變區(qū)反向引物，終濃度10 μ M。在50 μ L PCR體積中，各包含單條上游引物及 預(yù)混反向引物各 25pmoL，cDNA 2 μ L，5 X Reaction Buffer 10 μ L，5 XHigh GC Enhancer 10 μL，IOmmol dNTP I μ L，Q51丨' High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)I 單位。反應(yīng) 條件：98 °C預(yù)變性30秒后，98 °C變性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共25個(gè)循 環(huán)；最后72°C后延伸2分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)純化PCR，電泳結(jié)果如圖1中A所示。結(jié)果顯示，單條上游引物 與混合的下游引物能有效的擴(kuò)增出除低拷貝和單拷貝基因外的所有VH及VL。
[0032] 對(duì)擴(kuò)增效果