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一種新型增強(qiáng)子及其應(yīng)用

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一種新型增強(qiáng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及用于增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)哺乳動(dòng)物來(lái) 源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的增強(qiáng)子及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析、蛋白質(zhì)或多肽類(lèi) 藥物研究開(kāi)發(fā)的先決條件。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)如抗體,最初是將抗體基因重新 導(dǎo)人淋巴細(xì)胞中由病毒(如SV40)或IgG的啟動(dòng)子增強(qiáng)子引導(dǎo),產(chǎn)生的抗體具有相應(yīng)的結(jié) 合能力和效應(yīng)功能,但表達(dá)量很低。常用的非淋巴細(xì)胞類(lèi)有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、小倉(cāng) 鼠腎(BHK)細(xì)胞、COS細(xì)胞、小鼠 NSO胸腺瘤細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞等。不同宿主細(xì) 胞表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和蛋白糖基化類(lèi)型不同,需根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白選擇最佳的 宿主細(xì)胞。COS細(xì)胞是進(jìn)行外源基因瞬時(shí)表達(dá)時(shí)用途最廣的宿主,其重組載件易于組建,便 于使用,而且對(duì)插入DNA的量或者采用基因組DNA序列的情況都沒(méi)有什么限制,便于通過(guò)檢 測(cè)表達(dá)情況來(lái)確證cDNA的陽(yáng)性克隆,也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。CHO 細(xì)胞則利于外源基目的穩(wěn)定整合,易于大規(guī)模培養(yǎng),能在無(wú)血清和蛋白的條件下生產(chǎn),是用 于真核生物基因表達(dá)較為成功的宿主細(xì)胞。CHO細(xì)胞已用于多種動(dòng)物來(lái)源蛋白的生產(chǎn),但其 產(chǎn)量較低,一般僅占細(xì)胞蛋白的2. 5%,而用細(xì)菌表達(dá)可獲得占總蛋白50%的蛋白表達(dá)水平, 但大腸桿菌表達(dá)的動(dòng)物蛋白能進(jìn)行正確的翻譯后加工如糖基化和三維結(jié)構(gòu)的形成,不具有 與天然抗體相似的功能活性,且在人體內(nèi)易于清除。如果需要表達(dá)具有生物學(xué)功能的膜蛋 白或分泌型蛋白,例如細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞外的激素和酶,則不能在原核細(xì)胞中表達(dá)。而 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白則具有天然蛋白的生物學(xué)活性。為提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白表達(dá) 量,需要選擇合適的表達(dá)載體和有效的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。
[0003] 影響外源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的因素很多,如增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子、 RNA加工(RNA Processing)、基因拷貝的數(shù)目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合 位點(diǎn)、重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性和宿主細(xì)胞的基因組偏好性(genetic properties) 等。在調(diào)控基因表達(dá)的因素中,增強(qiáng)子的選擇也起到了舉足輕重的作用。
[0004] 增強(qiáng)子(enhancer)指增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。增強(qiáng)子是通過(guò)啟 動(dòng)子來(lái)增加轉(zhuǎn)錄的。有效的增強(qiáng)子可以位于基因的5'端,也可位于基因的3'端,有的還可 位于基因的內(nèi)含子中。增強(qiáng)子的效應(yīng)很明顯,一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10~200倍,有 的甚至可以高達(dá)上千倍。例如,人珠蛋白基因的表達(dá)水平在巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, CMV)增強(qiáng)子作用下可提高600~1000倍。增強(qiáng)子的作用同增強(qiáng)子的取向(5' 一 3'或3' 一 5')無(wú)關(guān),甚至遠(yuǎn)離靶基因達(dá)幾千kb也仍有增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子具有如下特點(diǎn):
[0005] ①具有遠(yuǎn)距離效應(yīng)。
[0006] ②無(wú)方向性。
[0007] ③順式調(diào)節(jié)。
[0008] ④無(wú)物種和基因的特異性。
[0009] ⑤具有組織特異性。
[0010] ⑥有相位性。
[0011] ⑦有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。
[0012] 增強(qiáng)子有別于啟動(dòng)子處有兩點(diǎn):[1]增強(qiáng)子對(duì)于啟動(dòng)子的位置不固定,而能有很 大的變動(dòng);[2]它能在兩個(gè)方向產(chǎn)生相互作用。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子 的轉(zhuǎn)錄,它能刺激在它附近的任一啟動(dòng)子。首先被發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子是SV40增強(qiáng)子。兩個(gè)增強(qiáng) 子位于基因組的兩個(gè)串連的72bp重復(fù)中,約在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游200bp處,每個(gè)72bp重復(fù)中 有一個(gè)。缺失實(shí)驗(yàn)顯示兩個(gè)重復(fù)缺失一個(gè)并不產(chǎn)生什么影響,而如兩個(gè)均缺失即將大大降 低活體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。有人發(fā)現(xiàn),如果將β珠蛋白基因放在含有72bp重復(fù)的DNA分子中,它的 轉(zhuǎn)錄作用在活體內(nèi)將增高約200倍以上,甚至當(dāng)此72bp順序位于離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游HOObp 或下游3000bp時(shí)仍有作用。各個(gè)基因中的增強(qiáng)子順序差別較大,但有一個(gè)基本的核心順序 (core sequence) :AAAGGTGTGGGTTTGG。增強(qiáng)子能大大增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。
[0013] 目前,用于表達(dá)重組蛋白尤其是重組抗體蛋白的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞主要是CHO細(xì) 胞,而CHO細(xì)胞中常用的增強(qiáng)子是CMV增強(qiáng)子和SV40增強(qiáng)子。其中,CMV增強(qiáng)子廣泛用于 重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建,以提高重組蛋白的表達(dá)量。但多數(shù)重組蛋白的表達(dá)水平很難達(dá) 到工業(yè)生產(chǎn)的要求,通過(guò)改造表達(dá)載體和宿主改造提高重組蛋白表達(dá)水平,成為重組蛋白 尤其是重組抗體蛋白表達(dá)的重點(diǎn)工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明目的是提供一種可以增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,提高外源基因表達(dá)的增強(qiáng)子, 以改善哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量低的現(xiàn)狀,從而降低哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白(尤其是抗 體)的生產(chǎn)成本。
[0015] 首先,本發(fā)明提供了一種人工合成的用于增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)哺乳動(dòng)物來(lái) 源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的增強(qiáng)子,所述增強(qiáng)子的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 所示。
[0016] 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。
[0017] 本發(fā)明的增強(qiáng)子可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中促進(jìn)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表 達(dá)。
[0018] 本發(fā)明的增強(qiáng)子可通過(guò)常規(guī)的合成方法制備。
[0019] 本發(fā)明的增強(qiáng)子可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,用于增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,促 進(jìn)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表達(dá)。
[0020] 利用本發(fā)明的增強(qiáng)子在動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的方法為:將編碼 本發(fā)明增強(qiáng)子的DNA序列插入裝有哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)DNA序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 啟動(dòng)子的5'端或者3'端,而后將該哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后表達(dá)目的 蛋白。構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體時(shí),先插入本發(fā)明增強(qiáng)子DNA序列,而后加入哺乳動(dòng)物來(lái) 源蛋白質(zhì)DNA序列的過(guò)程,對(duì)于轉(zhuǎn)染后哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)目的蛋白具有同樣的效果。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,所述表達(dá)載體含有前述編碼本發(fā)明 增強(qiáng)子的DNA序列及編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0022] 所述表達(dá)載體中,編碼本發(fā)明增強(qiáng)子的DNA序列在所述表達(dá)載體啟動(dòng)子的5'端或 3,端。
[0023] 所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是hEF-1 α啟動(dòng)子(human elongation factor-lalpha promoter)、hCMV 啟動(dòng)子(human cytomegalovirus promoter)> SV40 (Simian vacuolating virus40)早期啟動(dòng)子等。
[0024] 如本發(fā)明實(shí)施例列舉的,所述表達(dá)載體為pIRESneo3 (購(gòu)自Clontech)和經(jīng)過(guò)改造 的pIRESneo3,所述經(jīng)過(guò)改造的pIRESneo3中,人EF-I α啟動(dòng)子序列或人SV40啟動(dòng)子序列 替換了 pIRESne〇3質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子序列。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞為前述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選自CH0、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。
[0026] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法,為在適合表達(dá)所述 哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的條件下,培養(yǎng)前述含有本發(fā)明增強(qiáng)子的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng) 物宿主細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)可以為任意分子量的蛋白質(zhì),如抗體輕鏈或者重 鏈等。
[0027] 更具體的,本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的表達(dá)方法,其步驟包括,
[0028] 1、將本發(fā)明所述的增強(qiáng)子序列插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體啟動(dòng)子的5'端或者3' 端,
[0029] 2、在增強(qiáng)子序列插入之前或者之后加入哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的核苷酸序列,
[0030] 3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞,
[0031] 4、培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞,表達(dá)目的蛋白。
[0032] 本發(fā)明提供了本發(fā)明所述增強(qiáng)子在提高哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白表達(dá)量的應(yīng)用。本發(fā)明 將本發(fā)明增強(qiáng)子與現(xiàn)有hCMV增強(qiáng)子進(jìn)行比較,外源蛋白表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果表明,本發(fā)明的 增強(qiáng)子特別適用于CHO細(xì)胞,與現(xiàn)有hCMV增強(qiáng)子相比,在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量獲 得大幅提升,表達(dá)水平提高了約2~3倍,其應(yīng)用有利于篩選到高表達(dá)單克隆細(xì)胞株,具有 降低生產(chǎn)成本、縮短研發(fā)時(shí)間等優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1顯示本發(fā)明增強(qiáng)子與hCMV增強(qiáng)子的比較(pCV載體)
[0034] 圖2顯示本發(fā)明增強(qiáng)子與hCMV增強(qiáng)子的比較(pEF載體)
[0035] 圖3顯示本發(fā)明增強(qiáng)子與hCMV增強(qiáng)子的比較(pSV載體)
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下述實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明,但并不對(duì)其發(fā)明范圍進(jìn)行限制。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例所列舉的表達(dá)載體,是pIRESneo3 (購(gòu)自Clontech)和經(jīng)過(guò)改造的 pIRESneo3。經(jīng)過(guò)改造的pIRESneo3表達(dá)載體中,hEF-la啟動(dòng)子,SV40早期啟動(dòng)子分別 替換了原質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子(Human cytomegalovirus major immediate early promoter)序列。
[0038] 實(shí)施例1本發(fā)明增強(qiáng)子的合成
[0039] PCR法合成增強(qiáng)子,5'與:V端添加 NruI (TCGCGA)酶切位點(diǎn),以便于插入表達(dá)載 體啟動(dòng)子5'端(無(wú)方向性)。
[0040] 增強(qiáng)子I :
[0041] CATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCA TGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGT TCTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACGCGTTACATAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACTTCCCATAGTAACCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGCGCC AATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTA TCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCGGTGTGGAAAGCCCATTGA CGTCAATGGGA (SEQ ID N0:1)
[0042] 增強(qiáng)子2 :
[0043] TGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGTAC TGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCAT TGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTC AATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTGGTGTGGAAAGCCAG CCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTT AAA (SEQ ID NO :2)
[0044] 增強(qiáng)子3 :
[0045] CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA ATAAT
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