GACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAAC TGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG CCTGGCATTATGCCCATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACAGTACATCAATGGGCGTGGATAGC GGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGA (SEQ ID NO ：3)
[0046] 增強(qiáng)子4 :
[0047] TAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCAT TGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTC AATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCTATTGACGTCAATG ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG (SEQ ID NO ：4)
[0048] 增強(qiáng)子5 :
[0049] TACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATACTGAGTCAATAGGGACTTTCCA TTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGT CAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCAGCCAATTTAATTAA AACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG (SEQ ID NO ：5)
[0050] 實(shí)施例2hCMV增強(qiáng)子的擴(kuò)增
[0051] 以質(zhì)粒pIRESneo3 (購(gòu)自Clontech公司）為模版，hCMV增強(qiáng)子序列為參考，設(shè)計(jì)引 物（5<與：V端添加 NruI (TCGCGA)酶切位點(diǎn)）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出hCMV增強(qiáng)子 序列，反應(yīng)條件如表1。
[0052] 所得PCR產(chǎn)物與經(jīng)過SmaI處理的pUC57 (購(gòu)自Fermentas公司）連接，并進(jìn)行測(cè) 序鑒定以獲得正確的目的序列。
[0053] 表1 PCR反應(yīng)條件
[0054]
[0055] 實(shí)施例3人EF-I α啟動(dòng)子的擴(kuò)增
[0056] 以質(zhì)粒pEF6/V5_HisA (購(gòu)自Invitrogen公司）為模版，人EF-I α啟動(dòng)子序列為 參考，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出人EF-Ια啟動(dòng)子序列，反應(yīng)條件如表1。
[0057] 所得PCR產(chǎn)物與經(jīng)過SmaI處理的pUC57 (購(gòu)自Fermentas公司）連接，并進(jìn)行測(cè) 序鑒定以獲得正確的目的序列。
[0058] 實(shí)施例4SV40早期啟動(dòng)子的擴(kuò)增
[0059] 以質(zhì)粒pEF6/V5-HisA (購(gòu)自Invitrogen公司）為模版，SV40早期啟動(dòng)子序列為參 考，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出SV40早期啟動(dòng)子序列，
[0060] 反應(yīng)條件如表1。
[0061] 所得PCR產(chǎn)物與經(jīng)過SmaI處理的pUC57 (購(gòu)自Fermentas公司）連接，并進(jìn)行測(cè) 序鑒定以獲得正確的目的序列。
[0062] 實(shí)施例5重組pCV表達(dá)載體的構(gòu)建
[0063] 將人 IgGl 重鏈恒定區(qū)（genebank ID:3500,5 ^ 端添加了 Kozak 序列）經(jīng) NheI/ BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的質(zhì)粒pIRESne〇3 (pCV)，所獲得的重組 質(zhì)粒命名為pCV-CHh。
[0064] 將增強(qiáng)子1，增強(qiáng)子2,增強(qiáng)子3,增強(qiáng)子4,增強(qiáng)子5分別替換pCV-CHh載體中的 hCMV增強(qiáng)子。所獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pCV-CHl，pCV-CH2, pCV-CH3, pCV-CH4, pCV-C H5。
[0065] 實(shí)施例6重組pCV表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)研究
[0066] 米用脂質(zhì)體法（freestyle MAX，invitrogen)將質(zhì)粒 pCV-CHh，pCV-CHl, pCV_CH2， PCV-CH3, pCV-CH4, pCV-CH5分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，檢測(cè)CH瞬時(shí)表達(dá)水平。
[0067] 按照 freestyle MAX 操作說明書，將 5 μ g pCV-CHh，pCV-CHl, pCV-CH2, pCV-CH3, p CV-CH4, pCV-CH5質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板（3ml/welI)的CHO-S細(xì)胞(約3 X IO6個(gè)細(xì)胞)。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞在8%C02 , 37°C的Infors中搖動(dòng)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)液上清，使用ELISA法檢 測(cè)人 IgG 重鏈（CH)表達(dá)量。pCV-CHh，pCV-CHl, pCV-CH2, pCV-CH3, pCV-CH4, pCV-CH5 的表達(dá) 量分別是390ng/ml, 921ng/ml, 428ng/ml, 460ng/ml, 500ng/ml, 403ng/ml。結(jié)果顯示，本發(fā)明 增強(qiáng)子相對(duì)于hCMV增強(qiáng)子，在相同條件下，將CH表達(dá)量提高了 2倍多，見圖1。
[0068] 實(shí)施例7重組pEF表達(dá)載體的構(gòu)建
[0069] 將實(shí)施例3中的產(chǎn)物與pIRESne〇3質(zhì)粒進(jìn)行Spel/Nhel雙酶切連接，獲得質(zhì)粒 pEF〇
[0070] 將人 IgGl 重鏈恒定區(qū)（genebank ID:3500,5 '端添加了 Kozak 序列）經(jīng) NheI/ BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的質(zhì)粒pEF，所獲得的重組質(zhì)粒命名為 pEF-CH。
[0071] 將hCMV增強(qiáng)子，增強(qiáng)子1，增強(qiáng)子2,增強(qiáng)子3,增強(qiáng)子4,增強(qiáng)子5分別用NruI酶 處理，PEF載體用NruI酶處理。將上述增強(qiáng)子酶切產(chǎn)物分別與pEF酶切產(chǎn)物連接，所獲得 的重組質(zhì)粒分別命名為 pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5。
[0072] 實(shí)施例8重組pEF表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)研究
[0073] 米用脂質(zhì)體法（freestyle MAX, invitrogen)將質(zhì)粒 pEF-CHh，pEF-CHl, pEF_CH2, PEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，檢測(cè)CH瞬時(shí)表達(dá)水平。
[0074] 按照 freestyle MAX 操作說明書，將 5 μ g pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, p EF-CH4, pEF-CH5質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板（3ml/welI)的CHO-S細(xì)胞(約3 X IO6個(gè)細(xì)胞)。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞在8%C02 , 37°C的Infors中搖動(dòng)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)液上清，使用Elisa法檢 測(cè)人 IgG 重鏈恒定區(qū)表達(dá)量。pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5 的 CH 表達(dá)量分別是 460ng/ml, 1260ng/ml, 603ng/ml, 530ng/ml, 820ng/ml, 469ng/ml。結(jié)果顯示， 本發(fā)明增強(qiáng)子相對(duì)于hCMV增強(qiáng)子，在相同條件下，CH表達(dá)量提高了近3倍，見圖2。
[0075] 實(shí)施例9重組pSV表達(dá)載體的構(gòu)建
[0076] 將實(shí)施例4中的產(chǎn)物與pIRESne〇3質(zhì)粒進(jìn)行Spel/Nhel雙酶切連接，獲得質(zhì)粒 pSV。
[0077] 將人 IgGl 重鏈恒定區(qū)（genebank ID:3500,5 '端添加了 Kozak 序列）經(jīng) NheI/ BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的質(zhì)粒pSV，所獲得的重組質(zhì)粒命名為 pSV-CH。
[0078] 將hCMV增強(qiáng)子，增強(qiáng)子1，增強(qiáng)子2,增強(qiáng)子3,增強(qiáng)子4,增強(qiáng)子5分別用NruI酶 處理，PSV載體用NruI酶處理。將上述增強(qiáng)子酶切產(chǎn)物分別與pSV酶切產(chǎn)物連接。所獲得 的重組質(zhì)粒分別命名為 pSV-CHh, pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5。
[0079] 實(shí)施例10重組pSV表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)研究
[0080] 米用脂質(zhì)體法（freestyle MAX, invitrogen)將質(zhì)粒 pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, PSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，檢測(cè)CH瞬時(shí)表達(dá)水平。
[0081] 按照 freestyle MAX 操作說明書，將 5 μ g pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, p SV-CH4, pSV-CH5質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板（3ml/welI)的CHO-S細(xì)胞(約3 X IO6個(gè)細(xì)胞)。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞在8%C02, 37°C的Infors中搖動(dòng)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)液上清，使用ELISA法 檢測(cè) CH 表達(dá)量。pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5 的表達(dá)量分別是 230ng/ml, 505ng/ml, 200ng/ml, 191ng/ml, 303ng/ml, 231ng/ml。結(jié)果顯不，本發(fā)明增強(qiáng)子相 對(duì)于hCMV增強(qiáng)子，在相同條件下，CH表達(dá)量提高了 2倍，見圖3。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人工合成的增強(qiáng)子，其特征在于所述增強(qiáng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 /Jn〇2. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的核苷 酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述核苷酸序列位于表 達(dá)載體啟動(dòng)子的5'端或者3'端。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體啟動(dòng)子選 自hEF-1 a啟動(dòng)子、hCMV啟動(dòng)子或者SV40早期啟動(dòng)子。5. -種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求2-4任一所述表達(dá)載 體所轉(zhuǎn)染。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為CHO、BHK、 SP2/0、HEK293 或者 C127。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。8. -種哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的表達(dá)方法，其步驟包括， a，將權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)子序列插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體啟動(dòng)子的5'端或者3' 端， b，在增強(qiáng)子序列插入之前或者之后加入哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的核苷酸序列， c，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞， 山培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，表達(dá)目的蛋白。9. 一種如權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)子在提高哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)表達(dá)量的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人工合成的DNA增強(qiáng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明增強(qiáng)子可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組蛋白表達(dá)載體，用于增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)度，從而增強(qiáng)哺乳動(dòng)物或者其他來(lái)源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)，將其在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量大幅度提高。
【IPC分類】C12N15/67, C12N15/113, C12N15/85, C12N5/10
【公開號(hào)】CN104975018
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410129992
【發(fā)明人】張玉晶, 張成海, 周遠(yuǎn)鋒
【申請(qǐng)人】上海中信國(guó)健藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月1日