Rna 轉錄載體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改進的RNA轉錄載體，其非常適合用于產(chǎn)生用于體內(nèi)治療目的的mRNA。載體中的改進在于翻譯增強子(TE)和核保留元件(NRS)的存在，特別是當后者是卡波西肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)的“表達和核保留元件”(ENE)時。
【專利說明】RNA轉錄載體及其用途 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明總的來說涉及一種改進的RNA轉錄載體，其非常適合用于產(chǎn)生用于體內(nèi)治 療目的的mRNA。載體中的改進特別地在于翻譯增強子和核保留元件的存在。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 雖然我們的免疫系統(tǒng)能夠區(qū)分健康細胞與腫瘤細胞和感染原，但它有時無法適當 識別該問題并對其作出反應。因此，醫(yī)學已經(jīng)聚焦于開發(fā)幾種幫助免疫系統(tǒng)監(jiān)視和消除腫 瘤細胞和感染原的策略。樹突狀細胞(DC)是已知為免疫應答刺激中的關鍵參與者的抗原提 呈細胞(APC)并且已付出許多努力來在免疫療法中開發(fā)DC。例如在癌癥的情況下，目標是通 過誘發(fā)可以特異性降低腫瘤負荷并誘導免疫記憶以控制腫瘤復發(fā)的效應T細胞來誘導和保 持腫瘤特異性免疫應答。一旦可靶向的腫瘤相關抗原(TAA)已被識別，它們可用于在體內(nèi)或 離體加載專職APC，即樹突狀細胞。
[0004] 已關于DC就體內(nèi)或離體免疫療法評估了不同的抗原形式，例如肽、蛋白質、全腫瘤 細胞提取物、質粒DNA或mRNA。在這些方法中，編碼抗原的mRNA正作為為特別有前景的方法 出現(xiàn)。相對于使用肽的傳統(tǒng)疫苗接種的優(yōu)點是mRNA編碼整個抗原的遺傳信息。全長抗原是 經(jīng)加工的并且所有可用的表位提呈在患者的MHC分子中，而不需要確定HLA特異性肽。沒有 患者需要因可用的肽不匹配其HLA類型而被從治療中排除。此外，mRNA不構成基因組整合的 風險，從而使其相較于DNA或病毒載體具有有利的安全性特征。由于它的瞬時性質，mRNA僅 在短時期過程中表達，并最終降解成天然產(chǎn)物。另外，mRNA用作其自身的佐劑，促進共刺激 信號，這在基于mRNA的免疫療法的情況下是有利的。已應用了用于外源mRNA遞送到DC中的 兩條路徑:離體使用經(jīng)轉染的DC的后續(xù)過繼轉移或通過mRNA的直接施用和體內(nèi)攝取。
[0005] 由Diken等人(2011)進行的研究突出顯示成熟刺激和/或其遞送的時間選擇必須 仔細選擇，因為mRNA的攝取依賴于巨胞飲，其是未成熟DC的功能，一旦DC成熟則丟失。因此， 傳統(tǒng)成熟刺激例如脂多糖(LPS)與TAA mRNA的共遞送對抗原的生物利用度具有負面影響， 抗原的生物利用度是共同決定抗原特異性T細胞應答的誘導的參數(shù)(Van Lint 2012;Diken 2011)。迄今為止，已研究了兩種不同的策略來用TAA mRNA同時加載DC并在體內(nèi)激活它們。
[0006] Fotin-Mleczek等人(2011)描述了含有游離mRNA和與魚精蛋白復合的mRNA的雙組 分系統(tǒng)，從而提供用于適應性免疫的抗原來源以及增強的病原體識別受體TLR7的觸發(fā)。這 種免疫策略導致強抗腫瘤免疫應答的誘導和持久的記憶應答，這是重要的，因為記憶T細胞 應防止腫瘤的再現(xiàn)。
[0007] Bonehi 11等人，2008評估了mRNA的特定組合用于佐劑目的的用途，最初用于活化 離體產(chǎn)生的DC，但也同樣適用于直接施用和體內(nèi)攝取(Bonehi 11，2008)。這已導致了專利申 請(W02009034172)，其中發(fā)明人描述了抗原性肽脈沖的抗原提呈細胞或用編碼TAA的mRNA (共）電穿孔的抗原提呈細胞的T細胞刺激能力可通過對其提供不同的分子佐劑(通過使用 編碼兩種或更多種免疫刺激因子的mRNA或DNA分子的混合物電穿孔)來極大增強。提供的概 念證明是這樣的用靶特異性肽脈沖的或用編碼靶特異性抗原的mRNA共電穿孔的經(jīng)修飾的 抗原提呈細胞在體外和疫苗接種后均能刺激抗原特異性T細胞，從而形成有前景的用于抗 腫瘤、抗病毒、抗細菌或抗真菌免疫療法的新方法。用于該發(fā)明的免疫刺激因子的優(yōu)選組合 是CD40L和caTLR4,或CD40L和CD70。在其它優(yōu)選的實施方案中，使用CD40L、CD70和caTLR4免 疫刺激分子的組合，其在下文被稱為"TriMix"。
[0008] 本發(fā)明涉及含有5'翻譯增強子序列和3'核保留序列的RNA轉錄載體。與空pUC載體 或者含有翻譯增強子或核保留序列的載體相比，根據(jù)本發(fā)明的載體顯示了在由體外轉錄的 mRNA編碼的蛋白質的表達方面出人意料的改進。這些改進特別地是由于兩種組分(翻譯增 強子和RNA穩(wěn)定序列)在載體中的同時存在和其在由此得到的表達產(chǎn)物中的并入。此外，獲 自本發(fā)明的載體的TriMix mRNA在小鼠癌癥模型中的體內(nèi)應用導致腫瘤生長更慢和所述小 鼠預期壽命增加。
[0009] 發(fā)明概述
[0010]在第一方面，本發(fā)明提供了一種核酸載體，其包含與SEQ ID N°1具有至少80%序 列同一性的翻譯增強子(TE)序列、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。 [0011]在具體的實施方案中，可轉錄的核酸序列選自包含編碼CD40L、⑶70、caTLR4的 mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0012]在優(yōu)選的實施方案中，翻譯增強子由SEQ ID N°l、2或3中的任一種表示，更特別地 由SEQ ID N°1表示。
[0013]在其它方面，本發(fā)明提供了增加體外轉錄的RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的方法； 所述方法包括以下步驟：
[0014] (i)提供根據(jù)本發(fā)明的載體，其中所述可轉錄的核酸序列是可轉錄的DNA序列，其 對應于待轉錄的所述RNA;和
[0015] (i i)體外轉錄所述可轉錄的DNA序列。
[0016]在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種RNA分子，其包含與SEQ ID N°1具有至少 80%序列同一性的翻譯增強子(TE)、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N° 4表示的核保留序 列。
[0017] 所述RNA分子可進一步包括多聚-A尾。
[0018]在本發(fā)明的RNA分子的上下文中，所述可翻譯的核酸序列可選自包含編碼CD40L、 CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0019] 在RNA分子的優(yōu)選的實施方案中，翻譯增強子由SEQ ID N°l、2或3中的任一種表 示;更特別地由SEQ ID N°1表示。
[0020]本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的一種或多種RNA分子的組合物;更特別地所述 一種或多種RNA分子代表編碼⑶40L、⑶70和caTLR4的mRNA分子。
[0021 ]根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以包含編碼抗原/疾病特異性mRNA的mRNA。
[0022] 本發(fā)明進一步提供了所述RNA分子和/或包含一種或多種所述RNA分子的組合物用 于多種目的的用途，諸如例如用于在體內(nèi)或體外引入宿主細胞中；或用于醫(yī)學。
[0023] 本發(fā)明的一個方面還提供包含根據(jù)本發(fā)明的一種或多種載體、一種或多種RNA分 子、或組合物的試劑盒。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于使用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種RNA分子或組合物治療有此需 要的患者的方法;其中所述RNA分子可以同時或以一定間隔依次施用。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的RNA分子或組合物可以通過任何合適的施用途徑(例如結內(nèi)、皮內(nèi)、 淋巴管內(nèi)和瘤內(nèi)）施用至有此需要的患者。此外，當治療例如癌癥患者時，根據(jù)本發(fā)明的RNA 分子或組合物的施用可以與用于從患者中的腫瘤釋放腫瘤mRNA的方法(例如消融或聲致穿 孔)組合使用。
[0026] 本發(fā)明的編號陳述
[0027] 1. 一種核酸載體，其包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子 (TE)序列、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。
[0028] 2.權利要求1的核酸載體，其中所述可轉錄的核酸序列選自包含編碼⑶40L、⑶70、 caTLR4的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0029] 3.權利要求1-2中任一項的核酸載體，其中所述翻譯增強子由SEQ ID N°l、2或3中 的任一種表示;更特別地由SEQ ID N°1表示。
[0030] 4.增加體外轉錄的RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的方法，所述方法包括以下步驟：
[0031] (i)提供權利要求1-3中任一項的載體，其中所述可轉錄的核酸序列是可轉錄的 DNA序列，其對應于待轉錄的所述RNA;和
[0032] (i i)體外轉錄所述可轉錄的DNA序列。
[0033] 5.-種RNA分子，其包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子 (TE)、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。
[0034] 6.權利要求5的RNA分子，其還包含多聚-A尾。
[0035] 7.權利要求5或6中任一項的RNA分子，其中所述可轉錄的核酸序列選自包含編碼 CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0036] 8.權利要求5-7中任一項的RNA分子，其中所述翻譯增強子由SEQ ID N°1表示。
[0037] 9.-種組合物，其包含權利要求5-8中任一項的一種或多種RNA分子。
[0038] 10.權利要求9的組合物，其中所述一種或多種RNA分子代表編碼CD40UCD70和 caTLR4 的 mRNA 分子。
[0039] 11.權利要求10的組合物，其還包含編碼抗原/疾病特異性mRNA的mRNA。
[0040] 12.權利要求5-8中任一項的RNA分子或權利要求9-11中任一項的組合物用于引入 宿主細胞中的用途。
[0041 ] 13.權利要求5-8中任一項的RNA分子或權利要求9-11中任一項的組合物，其用于 醫(yī)學用途。
[0042] 14.-種試劑盒，其包含權利要求1-3中任一項的一種或多種載體;權利要求5-8中 任一項的一種或多種RNA分子;或權利要求9-11中任一項的組合物。
[0043] 附圖簡述
[0044] 通過具體參考附圖，應強調(diào)的是所顯示的細節(jié)是通過舉例的方式示出的并僅用于 本發(fā)明的不同實施方案的舉例說明性討論的目的。它們是為了提供本發(fā)明原理和概念方面 的最有用和容易的描述而呈現(xiàn)的。在這方面，沒有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更詳 細地顯示本發(fā)明的結構細節(jié)。結合附圖的描述使得本領域技術人員明顯地知曉如何在實踐 中體現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式。
[0045] 圖1:用由pUC-載體、pUC-TE載體、pUC-ENE載體或pUC TE ENE-載體編碼的TriMix mRNA電穿孔iDC。顯示了陽性DC群的MFI(平均熒光強度)值。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。（配對 t檢驗，*卩〈0.05)<^ pUC = 6;N pUC-TE = 15;N pUC-ENE = 15;N pUC TE ENE = 19
[0046] 圖2:用WTlmRNA電穿孔的DC中的WT1表達。用由不同載體編碼的WTlmRNA電穿孔iDC 并在電穿孔后4h、24h和48h通過細胞內(nèi)染色分析其WT1表達。顯示了使用不同WT1編碼載體 電穿孔iDC后的MFI值比較。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。（配對t檢驗，*P〈0.05; * *P〈 0.01; * * *P〈0.001)〇N=6
[0047] 圖3:DC的eGFP表達動力學。用eGFP和由pUC-載體或pUC TE ENE-載體編碼的 TriMix mRNA共電穿孔iDC。在電穿孔后的幾個時間點分析eGFP表達。分析eGFP陽性DC群的 MFI值。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。（配對t檢驗，*P〈0.05; * *P〈0.01; * * *?〈0.001)<^ = 9
[0048]圖4:未成熟和成熟DC的表型。在iDC電穿孔后24小時研究所示分子的MFI值。數(shù)據(jù) 表示為平均值土SEM。（配對t檢驗，*P〈0.05; * *P〈0.01; * * *P〈0.001)<XD40N = 9; CD70N= 19; CD80N= 12; CD 83N= 12; CCR7N= 12。
[0049] 圖5:P815的雙側腫瘤模型:使用tNGFR作為對照或使用pUC TE ENE TriMix單獨處 理一個腫瘤。將對側、未處理的腫瘤用來評估全身抗腫瘤免疫應答。顯示了每組的每只個體 小鼠 （n = 6)的腫瘤生長，隨后顯示了平均腫瘤體積的概覽。以Kaplan-Meier曲線可視化存 活率。存活率的差異通過對數(shù)秩檢驗來分析。
[0050]圖6: P815的雙側腫瘤模型：使用tNGFR或0.8體積的Hartman溶液作為對照來單獨 處理一個腫瘤。將對側、未處理的腫瘤用來評估全身抗腫瘤免疫應答。顯示了每組的每只個 體小鼠 （n = 6)的腫瘤生長，隨后顯示了平均腫瘤體積的概覽。以Kaplan-Meier曲線可視化 存活率。存活率的差異通過對數(shù)秩檢驗來分析。
[00511圖7:具有其最重要的元件的pUC TE ENE-載體。
[0052] 圖8:顯示如通過Clustal 2.1從EMBL創(chuàng)建的3個可變TE序列（SEQ ID N°l、2和3)的 序列比較。
[0053] 圖9: (A)用WTlmRNA電穿孔的DC中的WT1表達。用由不同載體編碼的10yg WTlmRNA 電穿孔iDC，并且通過電穿孔后4小時、24小時和48小時的細胞內(nèi)染色來分析其WT1表達。顯 示了用不同WT1編碼載體電穿孔iDC后MFI值的比較。N=3(B)用eGFP mRNA電穿孔的DC中的 eGFP表達。用由不同載體編碼的10yg eGFP mRNA電穿孔iDC，并且通過電穿孔后4小時、24小 時和48小時的細胞內(nèi)染色來分析其eGFP表達。顯示了用不同WT1編碼載體電穿孔iDC后MFI 值的比較。N=3
[0054] 發(fā)明詳述
[0055] 在第一個方面，本發(fā)明提供了包含翻譯增強子(TE)和核保留序列的核酸載體。更 具體地，所述核酸載體包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子(TE)序 列、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。
[0056] 術語"載體"在這里以其最一般的意義使用，并且包括核酸的任何中間媒介物，其 例如使得所述核酸能夠被引入原核和/或真核宿主細胞中，并在合適的情況下被整合到基 因組中。這樣的載體優(yōu)選在細胞中復制和/或表達。載體包括質粒、噬菌?；虿《净蚪M。如 本文所使用的，術語"質粒"一般涉及染色體外遺傳物質的構建體，通常為環(huán)狀DNA雙鏈體， 其可以獨立于染色體DNA復制。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明，核酸分子或核酸序列是指一種核酸，其優(yōu)選是脫氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)。根據(jù)本發(fā)明，核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組制備的和化學合成的分 子。根據(jù)本發(fā)明，核酸可以是單鏈或雙鏈以及線性或共價閉合環(huán)狀分子的形式。術語"核酸" 另外還包括在核苷酸堿基、糖或磷酸上化學衍生的核酸，以及含有非天然核苷酸及核苷酸 類似物的核酸。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明所描述的核酸優(yōu)選是分離的。根據(jù)本發(fā)明的術語"分離的核酸"意指核 酸已被（1)體外擴增，例如通過聚合酶鏈反應(PCR)(2)通過克隆重組產(chǎn)生，（3)純化，例如通 過切割和凝膠電泳分級分離，或(4)合成，例如通過化學合成。分離的核酸是可通過重組DNA 技術操作的核酸。
[0059] 5'翻譯增強子(TE)
[0060] 翻譯的轉錄后調(diào)控主要在翻譯起始階段來控制。起始因子的復合物結合到5'CAP 結構并招募核糖體亞單位。此復合物隨后開始沿著mRNA掃描移動，直到遇到合適背景下的 AUG密碼子。此過程的效率可以通過mRNA的5 '和3 'UTR(非翻譯區(qū)）中的多種結構特征來控 制。這些特征包括在5 'UTR中的TOP(末端寡嘧啶段）區(qū)域、IRES(內(nèi)部核糖體進入位點）和上 游的0RF(開放閱讀框）。在3'UTR中已描述了 CITE(Cap非依賴性翻譯增強子)基序。還已顯示 多聚-A尾的長度在翻譯起始中起重要作用，因為PABP(多聚-A結合蛋白）需要締合至多聚-A 尾和CAP位點上的eIF4復合物兩者。
[00611 IRES是能夠獨立于與5'CAP結構的相互作用而招募核糖體的基序。第一個IRES元 件描述于小核糖核酸病毒(例如，EMCV，腦心肌炎病毒）中。在感染期間，CAP依賴性翻譯被關 閉，從而獲得病毒蛋白的CAP非依賴性翻譯的優(yōu)勢。幾種真核IRES序列已經(jīng)在最近幾年被描 述。在應激情況下，CAP依賴性翻譯被下調(diào)，而一些必需基因的CAP非依賴性翻譯可以持續(xù)。 更具體地，通過例如LPS在Toll樣受體4上的連接活化的樹突狀細胞也關閉CAP依賴性翻譯， 而一些基因的CAP非依賴性翻譯保護細胞免于凋亡。
[0062] Hu等人研究了編碼小鼠 Gtx同源異形域蛋白的mRNA的5'前導物中的序列。他們描 述了與18S核糖體RNA中的序列互補的序列。他們發(fā)現(xiàn)此基序對翻譯的效率具有顯著的影響 (Hu 等人，I"9)。
[0063]后來，已顯示該基序作為內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)發(fā)揮功能，并顯示此5'前導 物的較短的非重疊區(qū)段可以增強雙順反子mRNA中的第二順反子的翻譯。這些區(qū)段之一為9 個核苷酸長，并且當此IRES模塊的多個拷貝連接在一起時，IRES活性大大增強。被人0珠蛋 白5'UTR的9n片段間隔的相同9n區(qū)段的串聯(lián)重復序列被顯示當位于mRNA的5'末端在0RF之 前時，作為單順反子mRNA中的翻譯增強子(TE)發(fā)揮功能。
[0064] 因此，在本發(fā)明的上下文中，可使用任何作為mRNA的翻譯增強子發(fā)揮功能的序列， 例如本文上述的那些元件。特別地，翻譯增強子是轉錄的RNA中促進翻譯的序列。一個可能 的作用模式是通過增強核糖體與mRNA的5'末端的結合。
[0065] 在具體的實例中，根據(jù)本發(fā)明的載體可產(chǎn)生含有來自Gtx前導序列的野生型9n序 列CCGGCGGGT的10X串聯(lián)重復序列的RNA。這些基序通過從人珠蛋白的5'UTR衍生的9n序列 TTCTGACAT連接。此DNA片段可被克隆在質粒中位于噬菌體啟動子序列和0RF (開放閱讀框） 之間。
[0066]在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的翻譯增強子與SEQ ID N°1具有至少80%的序 列同一性。如從圖8中明顯看出的，SEQ ID N° 2和3相比于SEQ ID N°1具有至少80%的序列 同一性，并因此適合于與本發(fā)明相關使用。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的翻譯增強子與SEQ ID ~°1具有至少85%、86%、87%、88%或89%的序列同一性。如從圖8中明顯看出的，3￡〇10 N° 2和3相比于SEQ ID N°1具有至少85%的序列同一性。甚至更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的翻譯 增強子與SEQ ID N°1 具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性。如從圖8中明顯看出的，SEQ ID N°3相比于SEQ ID N°1具有至少90% 的序列同一性。甚至更優(yōu)選地，翻譯增強子由SEQ ID N°l、2或3中的任一種表示;最優(yōu)選由 SEQ ID N°1 表示。
[0067]核保留序列
[0068] 轉錄后基因控制過程的重要性近年來已經(jīng)變得越來越明顯。在這些過程中，開始 受到相當大的關注的一個是mRNA穩(wěn)定性的控制。隨著日益認識到mRNA降解對基因表達具有 顯著影響以及mRNA衰減的速率可響應于環(huán)境和發(fā)育的信號而進行調(diào)節(jié)，現(xiàn)正進行著旨在理 解此過程的轟轟烈烈的研究工作。已經(jīng)取得顯著進展，并且過去20年的研究已闡明了 mRNA 降解的許多一般性特征。
[0069] 細胞的和病毒的mRNA均經(jīng)受強力的RNA衰減途徑。病毒已經(jīng)開發(fā)出不同的方法來 保護它們的mRNA免于宿主的脫腺苷酸化機制?？úㄎ魅饬鱿嚓P皰疹病毒(KSHV)的多腺苷酸 化的非翻譯RNA(PAN)在感染細胞的核中非常豐富。這種RNA對脫腺苷酸化和降解具有抗性。 PAN的累積取決于在3 '區(qū)中的79個核苷酸的RNA元件的活性，該元件被稱為ENE(表達和核保 留元件hConrad等人在2005年發(fā)表了涉及ENE的第一篇文章，將其描述為產(chǎn)生無內(nèi)含子轉 錄物的增加的核豐度的卡波西肉瘤病毒RNA元件(0)1^ &(1，2005)。該￡呢片段含有與多聚-八 尾相互作用的特定富含U的發(fā)夾結構。像這樣，獲得導致RNA保留在核中和因而核保留元件 的名稱的二級結構。第二作用是富含U的發(fā)夾結構與mRNA的多聚-A尾相互作用從而導致免 于宿主降解的"屏蔽"作用，這是在產(chǎn)生用于免疫治療目的的mRNA中具有特別利益的性狀。 [0070]多腺苷酸化的核(PAN)RNA(也稱為Tl. 1或nut-IRNA)是由致癌性Y皰疹病毒卡波 西肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)產(chǎn)生的IncRNA( Sun等人，1996) IAN RNA在裂解性感染期間累 積到非常高的水平（~500,000個拷貝/細胞)并且是產(chǎn)生晚期病毒蛋白和感染性病毒所需 的（Sun等人，1996)。位于PAN RNA的多腺苷酸化位點上游~120nt的表達和核保留元件 (ENE)對于在核中的這樣的高累積是必不可少的（Conrad和Steitz，2005)。該ENE通過阻斷 脫腺苷酸化抑制PAN RNA的快速衰減(Conrad等人，2006) IAN RNA不產(chǎn)生蛋白表達。核保留 保持RNA遠離在細胞質中的翻譯機器，而多聚-A尾的屏蔽阻止結合到PABP(多聚A結合蛋 白），其是有效翻譯所必不可少的。因此，將此序列用于轉染是非顯而易見的。
[0071] KSHV ENE是長79個核苷酸的RNA元件，包括具有不對稱的內(nèi)部富含U的環(huán)的莖環(huán)結 構，其與相鄰的堿基對結合構成ENE的功能核心。結合至寡(A) 9的ENE核心的晶體結構揭示 了在富含U的環(huán)和寡(A)9之間形成的5個連續(xù)U-A-U堿基三元體(Mitton-Fry等人,2010)，其 通過與莖下部的三個G-C堿基對的較少相互作用的A延伸。遺傳和生化分析顯示了PAN RNA 的多聚(A)尾和ENE之間相似的體內(nèi)相互作用(Mitton-Fry等人，2010)。
[0072] 因此，在本發(fā)明的上下文中，可以使用任何功能為mRNA的核保留元件的序列，例如 本文上述的那些元件。具體地，核保留元件是具有保護mRNA避免胞質衰減的能力的順式作 用序列。
[0073] 在具體的實施方案中，核保留元件還作為RNA穩(wěn)定序列發(fā)揮功能。
[0074]在具體的實例中，核保留元件是KSHV的表達和核保留元件。將從PAN(多腺苷酸化 的非翻譯的)RNA分離的79bp序列置于RNA生產(chǎn)質粒中的A124序列段的上游。該ENE形成與多 聚A尾締合和保護其免受降解的富含U的環(huán)。
[0075]在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核保留元件由SEQ ID N°4表示。
[0076]本發(fā)明的載體中的其它元件
[0077]在其它實施方案中，本發(fā)明的核酸載體可以含有選自包含噬菌體啟動子、可轉錄 的核酸序列和多聚-A尾的列表的其它元件。
[0078]信使RNA或核糖核酸(mRNA)由4種核苷酸(腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷一磷酸）的單鏈 聚合物組成。翻譯起始復合物對mRNA的識別、mRNA與核糖體的恰當附接以及保護避免5 '外 切核酸酶需要5'末端修飾或5'CAP。該修飾由添加到第一轉錄核苷酸的7-甲基鳥苷核苷酸 組成。編碼區(qū)開始于起始密碼子(通常為AUG)且結束于終止密碼子(通常是UAA、UAG或UGA)。 在起始密碼子之前和終止密碼子之后，成熟的mRNA含有5 '非翻譯區(qū)（UTR)和3'UTR。這些區(qū) 域對mRNA穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性和翻譯效率起作用。
[0079] 可轉錄的核酸序列(特別是編碼肽或蛋白質的核酸)和表達控制序列是彼此"功能 性"連接的，只要它們以這樣的方式彼此共價連接:可轉錄的核酸和尤其是編碼核酸的轉錄 或表達在表達控制序列的控制下或在表達控制序列的影響下。
[0080] 本文所指定的核酸，特別是可轉錄的核酸和編碼核酸，可以與任何表達控制序列 特別是啟動子組合，所述表達控制序列與所述核酸可以是同源的或異源的，術語"同源"是 指這樣的事實：核酸還天然地功能性連接至表達控制序列，并且術語"異源"是指這樣的事 實:核酸不天然地功能性連接至表達控制序列。
[0081] 術語"表達控制序列"包括根據(jù)本發(fā)明的啟動子、核糖體結合序列和其它控制元 件，其控制基因的轉錄或衍生的RNA的翻譯。在本發(fā)明的具體實施方案中，表達控制序列可 以被調(diào)控。表達控制序列的精確結構可取決于物種或細胞類型而變化，但通常包括分別牽 涉起始轉錄和翻譯的5'-非轉錄和5'-和3-非翻譯序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列 等。更具體地，5'-非轉錄表達控制序列包括啟動子區(qū)，其涵蓋用于功能性連接的基因的轉 錄控制的啟動子序列。表達控制序列還可以包括增強子序列或上游激活子序列。
[0082] 在具體的實施方案中，核酸根據(jù)本發(fā)明功能性連接至表達控制序列，其相對于所 述核酸可以是同源或異源的。
[0083] 術語"啟動子"或"啟動子區(qū)"是指基因的編碼序列的上游(5'）的DNA序列，其通過 提供RNA聚合酶的識別和結合位點控制所述編碼序列的表達。啟動子區(qū)可以包括針對牽涉 調(diào)節(jié)所述基因的轉錄的其它因子的其它識別或結合位點。啟動子可以控制原核或真核基因 的轉錄。啟動子可以是"誘導型"的并且可響應誘導劑起始轉錄，或者如果轉錄不通過誘導 劑控制，其可以是"組成型"的。如果誘導劑不存在，誘導型啟動子僅被表達至非常小的程度 或根本不表達。在誘導劑的存在下，基因被"開啟"或轉錄水平增加。這通常通過特定轉錄因 子的結合介導。
[0084] 在具體的實施方案中，可轉錄的核酸序列選自包含編碼⑶40L(NM_000074)、⑶70 (NM_001252)、caTLR4((人TLR4基因的截短形式，其僅含有基因的跨膜和胞質區(qū)以及在其之 前的LAMP1 (溶酶體相關膜蛋白）的信號肽)的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0085]根據(jù)本發(fā)明的噬菌體啟動子可以是用于RNA轉錄的任何合適的啟動子，并且優(yōu)選 選自包含T7啟動子、SP6啟動子和T3啟動子的列表;更特別地為T7啟動子。
[0086] 如本發(fā)明的上下文中使用的多聚-A尾優(yōu)選由約100-150個腺苷，更特別地120-125 個腺苷，優(yōu)選約124個腺苷組成。
[0087] 術語"多腺苷酸盒"或"多聚-A序列"是指通常位于RNA分子的3'末端的腺苷酸殘基 的序列。本發(fā)明提供了在RNA轉錄過程中通過DNA模板的方式在與編碼鏈互補的鏈中的重復 胸苷酸殘基的基礎上附接的這樣的序列，然而所述序列通常不在DNA中編碼而是在核中通 過模板依賴性RNA聚合酶在轉錄后被附接至RNA的游離3'末端。根據(jù)本發(fā)明，這種類型的多 聚(A)序列被理解為意指至少20,優(yōu)選至少40,優(yōu)選至少為80,優(yōu)選至少100并優(yōu)選至多500， 優(yōu)選至多400,優(yōu)選至多300,優(yōu)選至多200,特別是至多150個連續(xù)A核苷酸的核苷酸序列，并 且特別是約120個連續(xù)A核苷酸的核苷酸序列，其中術語"A核苷酸"是指腺苷酸殘基。
[0088] 本發(fā)明進一步提供了可通過根據(jù)本發(fā)明的核酸載體的轉錄獲得的RNA分子。
[0089]在其它方面，本發(fā)明提供了增加體外轉錄的RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的方法； 所述方法包括以下步驟：
[0090] (i)提供根據(jù)本發(fā)明的載體，其中所述可轉錄的核酸序列是可轉錄的DNA序列，其 對應于待轉錄的所述RNA;和
[0091 ] (ii)體外轉錄所述可轉錄的DNA序列；
[0092]以及由所述方法獲得的RNA分子。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明，術語"轉錄"包括"體外轉錄"，其中術語"體外轉錄"涉及其中在體外 以無細胞的方式合成RNA特別是mRNA的方法。轉錄物的制備優(yōu)選利用克隆載體，其通常被稱 為轉錄載體并且其包括在根據(jù)本發(fā)明的術語"載體"中。
[0094] 術語"從核酸序列轉錄的核酸序列"是指RNA(在合適的情況下作為完整的RNA分子 的一部分），其是前者核酸序列的轉錄產(chǎn)物。
[0095] 術語"可以被轉錄以產(chǎn)生共同的轉錄物的核酸"意指所述核酸以這樣的方式彼此 功能性連接，以使得在合適的情況下在線性化例如含有所述核酸的核酸分子(特別是封閉 的環(huán)狀核酸分子)的限制性內(nèi)切酶切割之后，在啟動子控制下的轉錄導致包含彼此共價連 接的所述核酸的轉錄物的RNA分子，在合適的情況下由位于其間的序列分開。
[0096]根據(jù)本發(fā)明，術語"表達"以其最一般的意義使用，并且包括RNA和/或蛋白質的產(chǎn) 生。它還包括核酸的部分表達。此外，表達可以是瞬時的或穩(wěn)定的。對于RNA而言，術語"表 達"或"翻譯"特別地是指肽或蛋白質的產(chǎn)生。
[0097] 術語"具有活性以增加核酸序列的翻譯效率和/或穩(wěn)定性的核酸序列"意指第一核 酸能夠以這樣的方式修飾(在與第二核酸的共同轉錄物中）所述第二核酸翻譯效率和/或穩(wěn) 定性，以使得所述翻譯效率和/或穩(wěn)定性與所述第二核酸在沒有所述第一核酸的情況下的 翻譯效率和/或穩(wěn)定性相比增加。在此背景下，術語"翻譯效率"涉及在特定時間段內(nèi)由RNA 分子提供的翻譯產(chǎn)物的量，并且術語"穩(wěn)定性"涉及RNA分子的半衰期。
[0098] 在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了包含翻譯增強子(TE)和核保留元件(ENE)的 RNA分子;或包含一種或多種所述RNA分子的組合物。更具體地，本發(fā)明提供了包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子(TE)、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示 的核保留序列的RNA分子;或包含所述RNA分子的組合物。
[0099 ] 所述RNA分子可以進一步包括選自包含可翻譯的核酸序列和多聚-A尾的列表中的 一種或多種元件；其中所述可翻譯的核酸序列可以選自包含編碼⑶40L、⑶70、caTLR4的 mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。
[0100] 在本發(fā)明的上下文中，TE元件優(yōu)選位于可轉錄/可翻譯的RNA分子的5'末端，并且 核保留序列(ENE)優(yōu)選位于3'末端。
[0101] "核酸的3'末端"根據(jù)本發(fā)明是指具有游離羥基的那個末端。"核酸的5'末端"根據(jù) 本發(fā)明是指具有游離磷酸基團的那個末端。
[0102] 在本發(fā)明的上下文中，"mRNA"意指"信使RNA"，并且是指使用DNA作為模板產(chǎn)生的 并且其本身編碼肽或蛋白質的轉錄物。mRNA通常包含5'-非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)和3'-非翻 譯區(qū)。mRNA在細胞中具有有限的半衰期(half time)。根據(jù)本發(fā)明，mRNA可以通過體外轉錄 從DNA模板制備。除了根據(jù)本發(fā)明的修飾以外，它還可以通過進一步穩(wěn)定修飾和加帽來進行 修飾。
[0103] 在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與編碼抗原/疾病特異性mRNA的 mRNA組合或不組合的編碼CD40L、CD70和caTLR4的mRNA。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明的抗原/疾病特異性mRNA可以選自包含腫瘤抗原、病原體衍生的抗原、 變應原等的非限制性列表。
[0105] 本發(fā)明進一步提供了 RNA分子和/或包含一種或多種所述RNA分子的組合物用于多 種目的的用途，諸如例如用于在體內(nèi)或體外引入宿主細胞中；或用于醫(yī)學。
[0106] 本發(fā)明一個方面還提供包含根據(jù)本發(fā)明的一種或多種載體、一種或多種RNA分子 或組合物的試劑盒。
[0107] 本發(fā)明還提供了用于使用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種RNA分子或組合物治療有此需 要的患者的方法;其中，所述RNA分子可以同時或以一定間隔依次施用。
[0108] 本發(fā)明提供了待施用給患者的核酸特別是RNA。核酸可以通過離體方法施用，即通 過從患者取出細胞，遺傳修飾所述細胞(例如通過轉染)和將經(jīng)修飾的細胞重新引入到患者 內(nèi)。轉染和轉導方法是本領域技術人員已知的。本發(fā)明還提供了待體內(nèi)施用的核酸。
[0109] 根據(jù)本發(fā)明，術語"轉染"是指將一種或多種核酸引入生物體或宿主細胞。可以使 用各種方法來將根據(jù)本發(fā)明的核酸體外或體內(nèi)引入細胞。這樣的方法包括核酸_CaP04沉淀 轉染，與DEAE有關的核酸轉染，用攜帶目標核酸的病毒感染的轉染，脂質體介導的轉染等。 在具體的實施方案，優(yōu)選將核酸導入至特定細胞。在這樣的實施方案中，用于將核酸施用至 細胞的載體(例如，逆轉錄病毒或脂質體)可具有結合的靶向分子。例如，可以將分子(例如 特異于靶細胞上的表面膜蛋白的抗體，或針對靶細胞上的受體的配體)摻入或結合至核酸 載體。如果期望通過脂質體施用核酸，則可以將結合至與胞吞作用相關的表面膜的蛋白質 摻入脂質體制劑中，以使得能夠靶向和/或吸收。這樣的蛋白質包括特異于特定細胞類型的 衣殼蛋白或其片段，針對被內(nèi)化的蛋白質的抗體，靶向胞內(nèi)位點的蛋白質等。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的RNA分子或組合物可以通過任何合適的施用途徑施用給有此需要的 患者，例如結內(nèi)、皮內(nèi)、淋巴管內(nèi)和瘤內(nèi)施用途徑。此外，當治療例如癌癥患者時，根據(jù)本發(fā) 明的RNA分子或組合物的施用可以與用于從患者中的腫瘤釋放腫瘤mRNA的方法(例如消融 或或聲致穿孔)組合使用。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明，標準方法可以用于制備重組核酸，培養(yǎng)細胞，尤其是電穿孔和脂質體 轉染。酶促反應按照生產(chǎn)商的說明書或以本身已知的方式進行。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明，"來源于核酸序列的核酸序列"是指與其所來源于的核酸相比，含有 單個或多個核苷酸取代、缺失和/或添加并且優(yōu)選與其所來源于的核酸互補（即在所述核酸 之間存在一定程度的同源性并且所述核酸的核苷酸序列以顯著直接或互補的方式對應)的 核酸。
[0113] 根據(jù)本發(fā)明，來源于核酸的核酸具有其所來源于的核酸的功能性質。這樣的功能 性質特別地包括通過功能性連接至可以被轉錄成RNA的核酸(可轉錄的核酸序列），增加從 此核酸產(chǎn)生的RNA在完整RNA分子中的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力。
[0114] 如果兩個序列能夠彼此雜交并形成穩(wěn)定的雙鏈體，則核酸與另一核酸是"互補" 的，所述雜交優(yōu)選在允許多核苷酸之間特異性雜交的條件(嚴格條件）下進行。嚴格條件描 述于例如Molecular Cloning: A laboratory manual，J Sambrook等人中。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明，互補的核酸具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，并且優(yōu)選 至少95%，至少98%或至少99%相同的核苷酸。
[0116] 根據(jù)本發(fā)明，如果第一多核苷酸區(qū)的5'末端是最靠近第二多核苷酸區(qū)的3'末端的 所述第一多核苷酸區(qū)的部分，所述第一多核苷酸區(qū)被認為位于所述第二多核苷酸區(qū)的下 游。
[0117] 3'非翻譯區(qū)通常從翻譯產(chǎn)物的終止密碼子延伸至通常在轉錄過程后附接的多聚A 序列。哺乳動物mRNA的3'-非翻譯區(qū)通常具有被稱為AAUAAA六核苷酸序列的同源性區(qū)域。該 序列推測是多聚-A附接信號，并且常常位于多聚-A附接位點上游10至30個堿基的位置。
[0118] 3'-非翻譯區(qū)可以含有一個或多個可折疊以產(chǎn)生莖-環(huán)結構的反向重復序列，其用 作針對外切核糖核酸酶的屏障或與已知增加 RNA穩(wěn)定性的蛋白質（例如RNA結合蛋白）相互 作用。
[0119] 5'-和/或3'-非翻譯區(qū)可以根據(jù)本發(fā)明功能性地連接至可轉錄的核酸和特別是編 碼核酸，從而這些區(qū)域與核酸以這樣的方式相關聯(lián)，以使得從所述可轉錄的核酸轉錄的RNA 的穩(wěn)定性和/或翻譯效率增加。
[0120] 根據(jù)本發(fā)明，術語"基因"是指特定的核酸序列，其負責產(chǎn)生一個或多個細胞產(chǎn)物 和/或實現(xiàn)一個或多個細胞產(chǎn)物和/或實現(xiàn)一個或多個細胞間或細胞內(nèi)功能。更具體而言， 所述術語涉及DNA區(qū)段，其包含編碼特定蛋白或功能性或結構性RNA分子的核酸。
[0121] 根據(jù)本發(fā)明，術語"宿主細胞"是指可用外源核酸轉化或轉染的任何細胞。根據(jù)本 發(fā)明的術語"宿主細胞"包括原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母細胞和昆蟲細 胞）。特別優(yōu)選的是哺乳動物細胞，例如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊和靈長類動物的細胞。 細胞可以來源于多樣的組織類型，并且包括原代細胞和細胞系。具體實例包括角質形成細 胞，外周血白細胞，骨髓干細胞和胚胎干細胞。在其它實施方案中，宿主細胞是抗原提呈細 胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。核酸可以單個拷貝或多個拷貝存在于宿主細胞 中并且在一個實施方案中，在宿主細胞中表達。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明，由核酸編碼的肽或蛋白質可以是位于細胞質中、核中、膜中、細胞器 中或分泌形式的肽或蛋白質。它們包括結構蛋白，調(diào)節(jié)蛋白，激素，神經(jīng)遞質，生長調(diào)節(jié)因 子，分化因子，基因表達調(diào)控因子，DNA相關蛋白，酶，血清蛋白，受體，藥物，免疫調(diào)節(jié)劑，癌 基因，毒素，腫瘤抗原或抗原。所述肽或蛋白質可具有天然存在的序列或突變的序列以增 強、抑制、調(diào)節(jié)或消除其生物活性。
[0123] 術語"肽"是指包含經(jīng)由肽鍵彼此連接的2個或更多，優(yōu)選3個或更多，優(yōu)選4個或更 多，優(yōu)選6個或更多，優(yōu)選8個或更多，優(yōu)選10個或更多，優(yōu)選13個或更多，優(yōu)選16個或更多， 優(yōu)選100個或優(yōu)選150個連續(xù)氨基酸的物質。術語"蛋白質"是指大的肽，優(yōu)選是具有至少151 個氨基酸的肽，但術語"肽"和"蛋白質"在本文中通常被用作同義詞。術語"肽"和"蛋白質" 根據(jù)本發(fā)明包括不僅含有氨基酸組分還含有非氨基酸組分(諸如糖和磷酸結構）的物質，并 且還包括含有鍵(諸如酯鍵、硫醚鍵或二硫鍵)的物質。
[0124] "報告因子"涉及一種分子，通常是肽或蛋白質，其由報告基因編碼，并且在報告因 子測定法中測量。常規(guī)的系統(tǒng)通常使用酶報告因子和測量所述報告因子的活性。
[0125] 根據(jù)本發(fā)明，兩個元件（諸如核苷酸或氨基酸）如果彼此直接相鄰而沒有任何中 斷，則它們是連續(xù)的。
[0126] "限制性內(nèi)切酶"或"限制性酶"是指一類在特定堿基序列內(nèi)切割DNA分子的兩條鏈 中的磷酸二酯鍵的酶。它們識別雙鏈DNA分子上的特異性結合位點（被稱為識別序列hDNA 中的所述磷酸二酯鍵被所述酶切割的位點被稱為切割位點。在IIS型酶的情況下，切割位點 位于離DNA結合位點確定距離的位置。
[0127] 應用領域
[0128] 本發(fā)明的應用領域是疫苗接種，即經(jīng)修飾的mRNA用于接種的用途或包含經(jīng)修飾的 mRNA藥物組合物作為接種劑的用途，或經(jīng)修飾的mRNA用于制備用于接種目的的藥物組合物 的用途。疫苗接種基于將抗原引入生物體或受試者，特別是引入生物體或受試者的細胞。在 本發(fā)明的上下文中，編碼抗原的遺傳信息以編碼抗原和/或不同的TriMix mRNA鏈的經(jīng)修飾 的mRNA的形式被引入到生物體或受試者中。藥物組合物中所含有的經(jīng)修飾的"抗原"mRNA被 翻譯成抗原，即表達由經(jīng)修飾的mRNA編碼的多肽或抗原性肽并刺激針對所述多肽或抗原性 肽的免疫應答。對于針對病原生物體(例如，病毒、細菌或原生動物）的疫苗接種，可將這樣 的生物體的表面抗原用作針對其引發(fā)免疫應答的抗原。在本發(fā)明的上下文中，包含編碼這 樣的表面抗原的經(jīng)修飾的mRNA的藥物組合物可以用作疫苗。在其中基因疫苗用于治療癌癥 的應用中，通過產(chǎn)生編碼腫瘤抗原(特別是專一表達在癌細胞上的蛋白質）的經(jīng)修飾的mRNA 來使免疫應答針對腫瘤抗原。這樣的編碼腫瘤抗原的經(jīng)修飾的mRNA可以單獨地或作為根據(jù) 本發(fā)明的藥物組合物的組分使用，其中經(jīng)修飾的mRNA或其組合物的施用導致生物體中癌抗 原的表達。針對這樣的疫苗的免疫應答從而會給接種疫苗的受試者賦予一定程度的針對與 免疫接種的癌抗原相關的癌癥的保護性免疫。可替代地，可以將這樣的措施用于使用編碼 表達在患者的癌細胞上的腫瘤抗原的經(jīng)修飾的mRNA接種癌癥患者以刺激癌癥患者的免疫 應答來攻擊表達所編碼的抗原的任何癌細胞。
[0129] 對于基因治療應用，例如其中使用本發(fā)明的藥物組合物的基因治療應用，其中的 經(jīng)修飾的mRNA編碼至少一種生物活性肽或多肽，在待治療的患者中不形成或僅不充分或有 缺陷性地形成所述生物活性肽或多肽。因此，給這樣的患者施用編碼所述至少一種生物活 性肽或多肽的經(jīng)修飾的mRNA或其組合物，至少部分地恢復所述至少一種生物活性肽或多肽 在患者中的表達和/或活性和從而補充了患者的遺傳缺陷。將正常、功能性基因直接引入至 活動物中已被研究作為用于替換有缺陷的遺傳信息的手段。在這樣的研究中，核酸序列被 直接引入活動物的細胞中。因此，由本發(fā)明的經(jīng)修飾的mRNA編碼的多肽的實例包括、但不限 于，肌營養(yǎng)不良蛋白，在囊性纖維化中被缺陷性地改變的氯離子通道，在代謝障礙例如苯丙 酮尿癥、半乳糖血癥、同型胱氨酸尿癥、腺苷脫氨酶缺乏癥等中是缺乏或缺陷性的酶；以及 牽涉神經(jīng)遞質例如多巴胺、去甲腎上腺素和GABA的合成的酶，尤其是酪氨酸羥化酶和DOPA 脫羧酶，以及a-1-抗胰蛋白酶等。本發(fā)明的藥物組合物還可以用于實現(xiàn)細胞表面受體和/或 細胞表面受體的結合伴侶的表達，包含在其中的經(jīng)修飾的mRNA編碼這樣的生物活性蛋白質 或肽。以細胞外方式的或結合至細胞表面受體的這樣的蛋白質的實例包括例如組織纖維蛋 白溶酶原活化劑（TPA)，生長激素，胰島素，干擾素，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CFS)和促紅細胞生成素(EP0)等。
[0130] 通過選擇合適的生長因子，可以例如將本發(fā)明的藥物組合物用于組織再生，或用 于與干細胞相互作用。通過這種方式，可以治療例如特征在于組織變性的疾病，其包括神經(jīng) 變性疾病例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病等，以及其它退化性病況，例如關節(jié)炎。在這些 情況下，經(jīng)修飾的mRNA，特別是本發(fā)明的藥物組合物中所含有的經(jīng)修飾的mRNA，優(yōu)選編碼 (但不限于)TGF-P家族成員，神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如NGF、神經(jīng)營養(yǎng)素等。
[0131] 治療方法
[0132] 因此，本發(fā)明還提供了用于預防和/或治療選自包含癌癥、變態(tài)反應和感染性疾病 例如細菌、病毒或真菌感染例如HIV感染或肝炎的非限制性列表的至少一種疾病或病癥的 方法。
[0133] 在整個說明書中使用的術語"癌癥"和/或"腫瘤"并不旨在限制于可能已例舉的癌 癥或腫瘤類型。因此，該術語包括所有增生性疾病，例如贅生物，發(fā)育異樣，惡化前或癌前病 變，異常細胞生長，良性腫瘤，惡性腫瘤，癌癥或轉移，其中所述癌癥選自：白血病，非小細胞 肺癌，小細胞肺癌，CNS癌，黑素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，神經(jīng)膠質瘤，結腸癌，膀 胱癌，肉瘤，胰腺癌，結腸直腸癌，頭頸癌，肝癌，骨癌，骨髓癌，胃癌，十二指腸癌，食管癌，甲 狀腺癌，血液學癌癥，和淋巴瘤。癌癥的特異性抗原可以例如是MelanA/MARTl，癌-種系抗 原，gp 100，酪氨酸酶，CEA，PSA，Her-2/neu，存活蛋白，端粒酶。
[0134] 在整個說明書中使用的術語"感染性疾病"或"感染"并不旨在限制于可能已例舉 的感染類型。因此，該術語包括針對其的免疫接種對受試者會是有益的所有感染原。非限定 性實例是下述病毒引起的感染或病癥:獲得性免疫缺陷綜合征_腺病毒感染-甲病毒感染-蟲媒病毒感染 _貝爾麻痹-博爾納病-布尼亞病毒感染-杯狀病毒感染 _水痘-感冒-尖銳濕 疣-冠狀病毒感染-柯薩奇病毒感染-巨細胞病毒感染_登革熱-DNA病毒感染-傳染性膿皰，_ 腦炎-腦炎，蟲媒病毒-腦炎，單純皰疹病毒-EB病毒感染-傳染性紅斑-幼兒急疹-疲勞綜合 征，慢性 _漢坦病毒感染_出血熱，病毒性-肝炎，病毒性，人-唇皰疼 _單純皰疼-帶狀皰疼-耳 部帶狀皰疹-皰疹病毒感染-HIV感染-傳染性單核細胞增多癥-禽流感-流感，人-拉沙熱-麻 疹-腦膜炎，病毒性-傳染性軟疣-猴痘-腮腺炎-脊髓炎-乳頭瘤病毒感染-副粘病毒感染-白 蛉熱-脊髓灰質炎-多瘤病毒感染-脊髓灰質炎后綜合征-狂犬病-呼吸道合胞病毒感染-裂 谷熱-RNA病毒感染-風疹-嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征-慢病毒病-天花-亞急性硬化性全腦 炎-蜱傳播疾病-腫瘤病毒感染-疏-西尼羅熱-病毒病-黃熱病-人畜共患病-等等。針對病毒 的特異性抗原可以是HI V-gag、-tat、-rev或-nef，或丙型肝炎抗原。
[0135] 其它非限制性實例是下述細菌或真菌引起的感染或病癥:膿腫-放線菌病-微粒孢 子蟲病-炭疽-關節(jié)炎，反應性-曲霉病-菌血癥-細菌感染和真菌病-巴爾通體感染-肉毒中 毒-腦膿腫-布氏桿菌病-伯霍爾德桿菌感染-彎曲桿菌感染_念珠菌病-念珠菌病，外陰陰 道-貓抓病-蜂窩織炎-中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染-軟下疳-衣原體感染-衣原體科感染-霍亂-梭菌 感染-球孢子菌病-角膜潰瘍-交叉感染-隱球菌病-皮膚真菌病-白喉-埃里希體病-膿胸，胸 膜-心內(nèi)膜炎，細菌性-眼內(nèi)炎-小腸結腸炎，偽膜性-丹毒-大腸桿菌感染-筋膜炎，壞死性-富尼埃壞疽-癤病-梭桿菌感染-氣性壞疽-淋病-革蘭陰性菌感染-革蘭陽性菌感染-腹股溝 肉芽腫-化膿性汗腺炎-組織胞漿菌病-瞼腺炎-膿皰瘡-克雷伯氏菌感染-軍團桿菌病-麻 風-鉤端螺旋體病-李斯特菌感染-路德維希咽峽炎-肺膿腫-萊姆病-性病性淋巴肉芽腫-馬 杜拉分支菌病-類鼻疽-腦膜炎，細菌性-分枝桿菌感染-支原體感染-真菌病-諾卡氏菌感 染-甲癬-骨髓炎-甲溝炎-盆腔炎癥性疾病-瘟疫-肺炎球菌感染-假單胞菌感染-鸚鵡熱-產(chǎn) 褥感染-Q熱-鼠咬熱-回歸熱-呼吸道感染-咽后膿腫-風濕熱-鼻硬結病-立克次體感染-洛 磯山斑疹熱-沙門氏菌感染-猩紅熱-恙蟲病-敗血癥-性傳播疾病，細菌性-性傳播疾病，細 菌性-休克，膿毒性-皮膚疾病，細菌性-皮膚疾病，傳染病-葡萄球菌感染-鏈球菌感染-梅 毒-梅毒，先天性-破傷風-蜱傳播疾病-癬-花斑癬-沙眼-結核病-結核病，脊髓-土拉菌病-傷寒-斑疹傷寒，流行性虱傳-泌尿道感染-惠普爾病-百日咳-弧菌感染-雅司病-耶爾森氏 菌感染-人畜共患病-接合菌病-等等。
[0136] 如本文所用且除非另有說明，術語"溶劑化物"包括可以由本發(fā)明的RNA分子與合 適的無機溶劑(例如，水合物)或有機溶劑形成的任何組合，諸如但不限于注射用水，哈特曼 溶液，PBS，0.9 % NaCl，無血清培養(yǎng)基。
[0137] 通常，對于藥物用途，本發(fā)明的RNA分子可被配制成藥物制劑或藥物組合物，其包 含本發(fā)明的至少一種RNA分子和至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和/或佐 劑，和任選地一種或多種另外的藥學活性產(chǎn)品。
[0138] 通過非限制性實例的方式，這樣的制劑可以是適于口服施用、胃腸外施用（例如通 過淋巴管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射或靜脈內(nèi)輸注）、局部施用（包括眼部）、通過 吸入施用、通過皮膚貼劑、通過植入物、通過栓劑等的形式。這樣的合適的施用形式(取決于 施用的方式，其可以是固體、半固體或液體的)_以及用于制備其的方法和載體、稀釋劑和賦 形劑對于本領域技術人員將是清楚;再次參考例如1^^-6,372,778、1^4-6,369,086、1^-A-6,369,087和US-A-6, 37 2, 733,以及標準手冊，例如最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences。
[0139] 這樣的制劑的一些優(yōu)選、但非限制性的實例包括片劑，丸劑，粉劑，錠劑，囊劑，扁 囊劑，酏劑，懸浮劑，乳劑，溶液，糖漿，氣霧劑，軟膏，乳膏劑，洗劑，軟和硬明膠膠囊，栓劑， 滴眼劑，無菌注射液和無菌包裝粉劑(其通常在使用前重構），其用于作為推注施用和/或用 于連續(xù)施用，其可與載體、賦形劑和稀釋劑進行配制，所述載體、賦形劑和稀釋劑本身適合 用于這樣的制劑，例如為乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹膠，磷酸鈣，藻 酸鹽，黃蓍膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，纖維素，（無菌)水，甲 基纖維素，甲基-和丙基羥苯酸酯，滑石，硬脂酸鎂，食用油，植物油和礦物油或其合適的混 合物。該制劑可任選含有其它藥學活性物質（其可以或可以不導致與本發(fā)明的產(chǎn)品的協(xié)同 效應）以及通常用于藥物制劑的其它物質，諸如潤滑劑，濕潤劑，乳化劑和懸浮劑，分散劑， 崩解劑，增量劑，填充劑，防腐劑，甜味劑，調(diào)味劑，流動調(diào)節(jié)劑，脫模劑，等等。該組合物還可 以配制以提供其中含有的活性產(chǎn)物的快速、持續(xù)或延遲釋放，例如使用基于天然凝膠或合 成聚合物的脂質體或親水性聚合物基質。為了提高根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的產(chǎn)品的溶解 性和/或穩(wěn)定性，可有利的是使用a-、f3-或y -環(huán)糊精或它們的衍生物。
[0140] 更具體地，組合物可以在包含治療有效量的由本發(fā)明的產(chǎn)品的固體分散體組成的 顆粒和一種或多種藥學上可接受的水溶性聚合物的藥物制劑中進行配制。
[0141] 術語"固體分散體"定義包含至少兩種組分的固體狀態(tài)(相對于液體或氣體狀態(tài)） 下的系統(tǒng)，其中一種組分幾乎均勻分散在整個其它組分中。當組分的所述分散體使得系統(tǒng) 在整個如熱力學所定義的一個相上是化學和物理均勻或同質的或由如熱力學所定義的一 個相組成，則這樣的固體分散體被稱為"固體溶液"。固體溶液是優(yōu)選的物理系統(tǒng)，因為其中 的組分通常是它們所施用至的生物體可容易生物利用的。
[0142] 可以進一步方便的是以納米顆粒的形式配制產(chǎn)品，所述納米顆粒具有以足以保持 小于lOOOnm的有效平均顆粒尺寸的量吸附在其表面上的表面改性劑。合適的表面改性劑可 優(yōu)選選自已知的有機和無機藥用賦形劑。這樣的賦形劑包括各種聚合物，低分子量寡聚物， 天然產(chǎn)物和表面活性劑。優(yōu)選的表面改性劑包括非離子和陰離子表面活性劑。
[0143] 配制根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物的另一個有趣的方式涉及一種藥物組合物，據(jù)此產(chǎn)品被摻 入在親水性聚合物中并將此混合物作為涂層膜施加在許多小珠上，從而得到具有良好的生 物利用度的組合物，其可以方便地制造并且適于制備用于口服施用的藥物劑型。適合用作 珠粒中的芯的材料是多樣的，只要所述物質是藥學上可接受的并且具有適當?shù)某叽绾陀?度。這樣的材料的實例是聚合物，無機物質，有機物質，和糖類及其衍生物。
[0144] 制劑可以本身已知的方式來制備，這通常涉及將根據(jù)本發(fā)明的至少一種產(chǎn)物與一 種或多種藥學上可接受的載體混合，并且，如果需要的話，與其它藥物活性產(chǎn)物組合，必要 時在無菌操作下條件。再次參考 US-A-6，372，778、US-A-6，369，086、US-A-6，369，087 和1^-A-6,372,733和上面提到的其它現(xiàn)有技術，以及標準手冊，例如最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences。
[0145] 本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選是單位劑量形式，并可以適當?shù)匕b，例如在盒、泡 (blister)、小瓶、瓶、小袋、安瓿中或在任何其它合適的單劑量或多劑量固定器或容器(其 可適當?shù)貥擞洠┲校蝗芜x地具有包含產(chǎn)品信息和/或使用說明的一個或多個傳單。一般地，這 樣的單位劑量將含有〇. l-l〇〇〇mg。
[0146] 產(chǎn)品可以通過多種途徑施用，包括淋巴管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、口服、直腸、眼、經(jīng)皮、皮下、 靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑，主要取決于所用的特定制劑和待治療或預防的病況。本發(fā)明的至 少一種產(chǎn)品通常將以"有效量"施用，這是指產(chǎn)品一旦適當施用則足以在它所施用至的個體 中實現(xiàn)期望的治療或預防效果。通常，取決于待預防或治療的病況和施用途徑，這樣的有效 量將通常是0.01-1000mg/千克患者體重/天，其可以作為單次每日劑量施用、劃分在一個或 多個每日劑量上或基本上連續(xù)地施用例如使用點滴輸注。待施用的量、施用的途徑和進一 步的治療方案可以由治療醫(yī)師確定，這取決于各種因素，例如患者的年齡、性別和一般狀況 以及待治療的疾病/癥狀的性質和嚴重程度。再次參考US-A-6，372，778、US-A-6，369，086、 US-A-6，369，087和US-A-6，372，733和上面提到的其它現(xiàn)有技術，以及標準手冊，例如最新 版本的Remington's Pharmaceutical Sciences。
[0147] 按照本發(fā)明的方法，所述藥物組合物可以在治療過程中在不同的時間分開施用， 或以分開或單一組合形式同時施用。本發(fā)明因此應理解為包括所有這樣的同時或交替治療 方案，并且應相應地解釋術語"施用"。
[0148] 對于口服施用形式，本發(fā)明的組合物可以與適當?shù)奶砑觿├缳x形劑、穩(wěn)定劑或 惰性稀釋劑混合，并通過常規(guī)方法形成合適的施用形式，例如片劑、包衣片劑、硬膠囊、水性 溶液、醇溶液或油性溶液。合適的惰性載體的實例是阿拉伯膠、氧化鎂、碳酸鎂、磷酸鉀、乳 糖、葡萄糖或淀粉，特別是玉米淀粉。在這種情況下，配制可以作為干顆粒和作為濕顆粒進 行。合適的油性賦形劑或溶劑是植物油或動物油，例如葵花油或鱈魚肝油。用于水性或醇溶 液的合適的溶劑是水、乙醇、糖溶液，或它們的混合物。聚乙二醇和聚丙二醇也可用作用于 其它施用形式的其它助劑。作為立即釋放片劑，這些組合物可含有微晶纖維素、磷酸二鈣、 淀粉、硬脂酸鎂和乳糖和/或本領域中已知的其它賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、稀釋劑 和潤滑劑。
[0149] 當通過鼻腔氣霧劑或吸入劑施用時，這些組合物可以根據(jù)藥物制劑領域中眾所周 知的技術制備，并且可以作為鹽水中的溶液來制備，使用芐醇或其它合適的防腐劑、吸收促 進劑以提高生物利用度、氟碳化合物和/或本領域已知的其它增溶劑或分散劑。以氣霧劑或 噴霧劑形式施用的合適的藥物制劑是例如本發(fā)明的產(chǎn)品的溶液、懸浮液或乳液或它們在藥 學上可接受的溶劑(例如乙醇或水，或這樣的溶劑的混合物）中的生理學上可耐受的鹽。如 果需要的話，制劑還可以另外含有其它藥物助劑例如表面活性劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，以及推 進劑。
[0150] 對于皮下施用，如果需要的話，可以將根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品與由此常規(guī)的物質例如 增溶劑、乳化劑或其它助劑帶入溶液、懸浮液或乳液中。本發(fā)明的產(chǎn)品還可以被冷凍干燥， 所獲得的凍干物例如用于產(chǎn)生注射或輸注制劑。合適的溶劑是例如水、生理鹽水溶液以及 糖溶液諸如葡萄糖或甘露醇溶液，或可替代地所提及的各種溶劑的混合物。可注射的溶液 或懸浮液可根據(jù)已知技術進行配制，使用適合的無毒、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，諸如 甘露醇、水、林格氏溶液或等滲氯化鈉溶液，或適合的分散劑或濕潤劑和懸浮劑，例如無菌 的、無刺激性的、非揮發(fā)性油類，包括合成的單或二甘油酯，和脂肪酸，包括油酸。
[0151] 當以栓劑形式直腸施用時，這些制劑可以通過將根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品與適合的非刺 激性賦形劑例如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇(其在常溫下是固體的，但在直腸腔中是液 化和/或溶解的以釋放藥物)混合來制備。
[0152] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)品和組合物被局部使用，例如表面的或在吸收 和非吸收的應用中。
[0153] 所述組合物在獸醫(yī)領域是具有價值的，其在本文中的目的不僅包括預防和/或治 療動物中的疾病，而且還對于經(jīng)濟上重要的動物諸如牛、豬、羊、雞、魚等提高了動物的生長 和/或重量和/或從動物獲得的肉或其它產(chǎn)品的量和/或質量。因此，在另一個方面，本發(fā)明 涉及用于獸醫(yī)用途的含有本發(fā)明的至少一種產(chǎn)品和至少一種合適的載體（即，適合于獸醫(yī) 用途的載體)的組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的產(chǎn)品在這樣的組合物的制備中的用途。 實施例
[0154] 一般材料和方法
[0155] 體外實驗:單核細胞衍生的DC的產(chǎn)生
[0156]外周血單核細胞(PBMC)被用作DC前體的來源，并從白細胞去除術產(chǎn)物中分離。如 下在體外從有適應性的（plastic)貼壁級分產(chǎn)生臨床級DC。在第0天，TOMC以10 X106個細 胞/mL的密度鋪板在適于造血細胞培養(yǎng)的補充有2%自體血漿(AP)的培養(yǎng)基中。靜置細胞2 小時，以允許在37°C下單核細胞的有適應性的貼壁。通過洗滌除去非貼壁細胞，并將貼壁細 胞在細胞工廠（Cell Factory)中在補充有l(wèi)%AP、l，OOOU/mL GM-CSF和500U/mL IL-4的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第2和4天，將含有第0天的細胞因子量的培養(yǎng)基添加至DC培養(yǎng)物。DC培養(yǎng)的 第6天，將細胞收獲并冷凍保存。
[0157] 體外實驗:DC的電穿孔
[0158] 如所指示，在第6天，用mRNA對4-8 X 106個DC進行電穿孔。電穿孔之前，將DC洗滌兩 次，第一次用無補充劑的PBS且第二次用減少血清的無酚紅培養(yǎng)基。在第二洗滌步驟后，將 DC重懸于含有該mRNA的終體積200iU的減少血清培養(yǎng)基中。在4-mm間隙電穿孔杯中進行電 穿孔。以下列條件使用指數(shù)衰減脈沖：電壓，300V;電容，150yF，電阻，〇〇Q，產(chǎn)生》11ms的脈 沖時間。在電穿孔后立即將DC在補充有l(wèi)%huAB血清和PS/L-GLU的培養(yǎng)基中稀釋并在37°C 下在濕潤的5%C02氣氛中培養(yǎng)。電穿孔后，沒有額外的細胞因子被添加至DC。
[0159] 體內(nèi)實驗:小鼠
[0160] 雌性、6至12周齡的DBA/2小鼠。
[0161] 體內(nèi)實驗:小鼠細胞系
[0162] 肥大細胞瘤細胞系P815獲自C.Uyttenhove(Universit6Catholique de Louvain, Louvain-La-Neuve，Belgium)〇
[0163] 體內(nèi)實驗:腫瘤細胞接種和mRNA的原位遞送
[0164] 如在實驗中所指示，為了生長可觸知的腫瘤，用5 X105個P815腫瘤細胞兩脅皮下 注射小鼠。對于mRNA的瘤內(nèi)遞送，將小鼠用異氟烷(Abbott)麻醉。將腫瘤在它們達到約 100mm 3的體積時用在50yl0.8哈特曼溶液/注射腫瘤的最終體積中的含有10yg TriMix mRNA的各自組分的混合物進行注射。在不同組之間使用相同量的mRNA。從pGEM載體產(chǎn)生的 編碼tNGFR的mRNA用作對照。
[0165] 實施例1
[0166] 具體材料和方法
[0167] 如在上文的一般材料和方法部分中所述，進行iDC產(chǎn)生和電穿孔。用5yg TriMix各 成分電穿孔iDC，以使DC成熟。所有流式細胞染色在PBS/BSA/疊氮化物中進行。為了分析 CD70的表達，使用抗CD70異硫氰酸熒光素(FITC)。在FACSFortessa流式細胞儀(BD)上進行 數(shù)據(jù)采集，并使用FACS Diva軟件進行分析。
[0168] 結果:
[0169] 電穿孔后二十四小時，將DC就其⑶70表面表達進行染色。這些結果表明，用TriMix 電穿孔iDC后，當與pUC-載體(pUC TE ENE質粒的基礎）、pUC TE-載體和pUC ENE-載體相比 較時，CD70表達的強度(平均熒光強度(MFI))在用由含有兩種調(diào)控元件(TE+ENE)的pUC TE ENE質粒（SEQ ID N°5)編碼的TriMix電穿孔后顯著更高。在用由pUC TE ENE質粒編碼的 TriMix電穿孔后，CD70表達顯著更高，而與缺乏這些元件的pUC相比，pUC TE和pUC ENE的使 用均導致降低的或最多相等的CD70表達水平（圖1)。因此，兩種元件(TE和ENE)在載體中的 存在似乎在用由pUC TE ENE質粒編碼的TriMix電穿孔后增加⑶70表達方面具有意料不到 的協(xié)同作用。
[0170] 實施例2
[0171] 具體材料和方法:
[0172] 如在上文的一般材料和方法部分中所述，進行iDC產(chǎn)生和電穿孔。分別用20yg編碼 WT1的mRNA電穿孔iDC，以使抗原加載。為了分析細胞內(nèi)WT1的表達，將細胞固定和透化，并用 抗WT1單克隆抗體（克隆6F_H2;Dako 〇5^〇11^1:;[011，03印;[1^61^3,0六)細胞內(nèi)染色。將]^6同種 型匹配的PE標記的抗小鼠抗體(Becton&Dickinson，Erembodegem，Belgium)用作第二抗體。 非反應性同種型匹配的抗體(eBioscience，Vienna, Austria)用作對照。在FACSFortessa流 式細胞儀(BD)上進行數(shù)據(jù)采集，并使用FACS Diva軟件進行分析。
[0173] 結果:
[0174] 這些結果表明，與其它WTlmRNA編碼載體相比，在用由pUC TE ENE載體編碼的WT1 電穿孔iDC后，觀察到更持久的WT1表達（圖2)。這些數(shù)據(jù)很好地顯示了 5'TE和3'ENE區(qū)段的 不同作用方式。雖然PUC-TE載體mRNA的表達在4小時后較高，但它很快下降。在整個周期中， 來自含有ENE的RNA的翻譯比所有其它的翻譯更低。pUC TE ENE-載體具有TE的高可翻譯性 和ENE序列的長久效應。WT1的表達水平以比在其它載體中顯著更慢的速率減少。
[0175] 實施例3
[0176] 具體的材料和方法:
[0177] 如在上文的一般材料和方法部分中所述，進行iDC產(chǎn)生和電穿孔。用5yg編碼eGFP 的mRNA和TriMix(每種成分5yg)共電穿孔iDC，以使DC抗原加載和成熟。在幾個時間點通過 流式細胞儀評估eGFP的表達。
[0178] 結果:
[0179] 在電穿孔后的幾個時間點監(jiān)測eGFP的表達（圖3)。這些結果顯示，在電穿孔后4小 時，來自兩種載體的eGFP的表達水平是可比較的。然而，在較晚的時間點，來自pUC TE ENE 來源的mRNA的表達明顯顯著更高。這再次指出了轉基因的更穩(wěn)定和長久的表達。
[0180] 實施例4
[0181] 具體材料和方法:
[0182] 如在上文的一般材料和方法部分中所述，進行iDC產(chǎn)生和電穿孔。用5yg的TriMix 各成分電穿孔iDC，以使DC成熟。所有流式細胞染色在PBS/BSA/疊氮化物中進行。為了分析 DC的細胞表面上的表面分子的表達，使用以下的單克隆抗體：CD40-APC(別藻藍蛋白）， CD70-FITC，CD80-PE，CD83-PE(藻紅蛋白），CD86-PE和CCR7-APC。在FACSFortessa流式細胞 儀(BD)上進行數(shù)據(jù)采集，并使用FACS Diva軟件進行分析。
[0183] 結果:
[0184] 使用由pUC TE ENE載體編碼的TriMix mRNA的電穿孔iDC能夠誘導DC的成熟（圖 4)〇
[0185] 實施例5:P815的雙側腫瘤模型:單獨治療一個腫瘤
[0186] 具體的材料和方法:
[0187] 為了生長可觸知的腫瘤，用5 X105個P815腫瘤細胞兩脅皮下注射小鼠。當兩個腫 瘤達到約100mm3的可注射體積時開始治療。通過使用其中僅一個腫瘤被治療的雙側腫瘤模 型，我們旨在評估疫苗接種策略的全身效應。因此，只有左側腫瘤用溶解在0.8X哈特曼溶 液中的對照mRNA或pUC TE ENE TriMix mRNA(10yg的各mRNA組分)注射。通過測量處理的和 未處理的對側腫瘤的大小和通過存活率評估全身抗腫瘤免疫應答。
[0188] 結果:
[0189] 通過使用雙側腫瘤模型，我們可以評估免疫接種策略的全身效應。pUC TE ENE TriMix mRNA的單瘤內(nèi)遞送導致處理的和未處理的對側腫瘤的腫瘤生長顯著降低（圖5)。疫 苗接種對遠處腫瘤的效果可以是單瘤內(nèi)TriMix注射可用于治療多種腫瘤病變的指示。
[0190] 實施例6: P815的雙側腫瘤模型:單獨治療一個腫瘤，哈特曼溶液案和tNGFR作為對 照
[0191] 具體的材料和方法:
[0192] 為了生長可觸知的腫瘤，用5 X105個P815腫瘤細胞兩脅皮下注射小鼠。當兩個腫 瘤達到約100mm3的可注射體積時開始治療。通過使用其中僅一個腫瘤被治療的雙側腫瘤模 型，我們旨在評估疫苗接種策略的全身效應。因此，只有左側腫瘤用溶解在0.8X哈特曼溶 液中的對照mRNA或pUC TE ENE TriMix mRNA(10yg的各mRNA組分)注射，所有均為50yl/注 射瘤的總體積。通過測量處理的和未處理的對側腫瘤的大小和通過存活率評估全身抗腫瘤 免疫應答。
[0193] 結果:
[0194] 通過使用雙側腫瘤模型，我們可以評估免疫接種策略的全身效應。本實驗證實了 之前的觀察，即
[0195] l.pUC TE ENE TriMix mRNA的單瘤內(nèi)遞送導致處理的和未處理的對側腫瘤的腫 瘤生長顯著降低。
[0196] 2.pUC TE ENE TriMix mRNA的單瘤內(nèi)遞送導致荷瘤小鼠的存活延長。
[0197] 3.疫苗接種對所治療腫瘤的效果更加顯著。
[0198] 另外，通過利用使用媒介物處理腫瘤的組，我們可以顯示mRNA本身的佐劑效應。
[0199] 實施例7:不同TE序列的比較
[0200] 具體材料及方法:
[0201 ]關于此處的具體測定方法的細節(jié)可以在如上所述的實施例2和3中找到。
[0202] 結果:使用FT1或eGFP對iDC的電穿孔
[0203]使用由包含SEQ ID N°1、SEQ ID N°2或SEQ ID N°3表示的TE元件的pUC TE ENE載 體編碼的WT1 (圖9A)或eGFP(圖9B)分別電穿孔iDC不導致WT1或eGFP表達的顯著差異。
[0204]這些數(shù)據(jù)清楚地表明，與SEQ ID N°1具有至少80%的序列同一性的序列，諸如例 如SEQ ID N°1、SEQ ID N°2或SEQ ID N°3,可以互換地用作根據(jù)本發(fā)明的載體中的翻譯增 強子元件。
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【主權項】
1. 一種核酸載體，其包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子(TE)序 列、可轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。2. 權利要求1的核酸載體，其中所述可轉錄的核酸序列選自包含編碼CD40UCD70、 caTLR4的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。3. 權利要求1-2中任一項的核酸載體，其中所述翻譯增強子由SEQ ID N°1表示。4. 增加體外轉錄的RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的方法;所述方法包括以下步驟： (i) 提供權利要求1 -3中任一項的載體，其中所述可轉錄的核酸序列是可轉錄的DNA序 列，其對應于待轉錄的所述RNA;和 (ii) 體外轉錄所述可轉錄的DNA序列。5. -種RNA分子，其包含與SEQ ID N°1具有至少80%序列同一性的翻譯增強子(TE)、可 轉錄的核酸序列和由SEQ ID N°4表示的核保留序列。6. 權利要求5的RNA分子，其還包含選自包括多聚-A尾的列表的一種或多種元件。7. 權利要求5或6中任一項的RNA分子，其中所述可轉錄的核酸序列選自包含編碼 CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾病特異性mRNA的列表。8. 權利要求5-7中任一項的RNA分子，其中所述翻譯增強子由SEQ ID N°1表示。9. 一種組合物，其包含權利要求5-8中任一項的一種或多種RNA分子。10. 權利要求9的組合物，其中所述一種或多種RNA分子代表編碼⑶40LXD70和caTLR4 的mRNA分子。11. 權利要求10的組合物，其還包含編碼抗原/疾病特異性mRNA的mRNA。12. 權利要求5-8中任一項的RNA分子或權利要求9-11中任一項的組合物用于引入宿主 細胞中的用途。13. 權利要求5-8中任一項的RNA分子或權利要求9-11中任一項的組合物，其用于醫(yī)學 用途。14. 一種試劑盒，其包含權利要求1-3中任一項的一種或多種載體;權利要求5-8中任一 項的一種或多種RNA分子;或權利要求9-11中任一項的組合物。
【文檔編號】A61K31/7088GK105849269SQ201480071159
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年11月12日
【發(fā)明人】C·黑爾曼, K·蒂勒曼斯
【申請人】Vrije布魯塞爾大學