專(zhuān)利名稱(chēng)：蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種標(biāo)記化學(xué)物質(zhì)，特別是生物物質(zhì)的方法，該標(biāo)記的目的是為了化學(xué)，和特別是生物測(cè)試，以及更具體地說(shuō)是特定的結(jié)合測(cè)試，例如免疫測(cè)試以及雜交探針技術(shù)和在特定的擴(kuò)增產(chǎn)物中將標(biāo)記摻入，如在測(cè)試中應(yīng)用PCR形式時(shí)。
蟲(chóng)熒光素酶介導(dǎo)的蟲(chóng)熒光素的斷裂(Eqn 1)有高的產(chǎn)率和穩(wěn)定的光輸出，使之可以應(yīng)用相對(duì)簡(jiǎn)單的設(shè)備檢測(cè)很低濃度的酶(參見(jiàn)McCapra，在Turner等(編輯)生物傳感器基礎(chǔ)和應(yīng)用，OxfordUniversity Press，(1988)617-37中生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的潛在應(yīng)用)。已發(fā)展了許多應(yīng)用蟲(chóng)熒光素酶作為間接標(biāo)記的方法(參見(jiàn)Wanilund和DeLuca，在Deluca和McElroy(編輯)生物發(fā)光免疫測(cè)試用于測(cè)定甲氧鹽和DNP的蟲(chóng)熒光素酶抗原凝集，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)化學(xué)和分析應(yīng)用。倫敦Academic Press(1981)693-696新的酶免疫分析的超敏感檢測(cè)系統(tǒng)，臨床化學(xué)和臨床生物化學(xué)雜志(Clin.Chem.Clin.Biochem.J)(1987)25，31-28和Murakami等，在Szalay等(編輯)生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光現(xiàn)狀報(bào)告，ChichesterJohn Wiley and Sons，(1993)296-300中‘應(yīng)用腺苷酸激酶和熒火蟲(chóng)蟲(chóng)熒光素酶的生物發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展’。
本發(fā)明人注意到應(yīng)用蟲(chóng)熒光素酶作為直接標(biāo)記在保持敏感性的同時(shí)可大大簡(jiǎn)化測(cè)試設(shè)計(jì)，但就需要可將其與測(cè)試結(jié)合試劑偶聯(lián)而又不導(dǎo)致已知為非常不穩(wěn)定的酶促活性滅活的方法。常規(guī)的共價(jià)偶聯(lián)試劑如戊二醛，SMCC和SMPB快速且不可逆的抑制蟲(chóng)熒光素酶的活性。
蟲(chóng)熒光素酶，例如來(lái)自Photinus Pyralis的，含有7,725-737四個(gè)半胱氨酸殘基(參見(jiàn)Wet等(1987)分子和細(xì)胞生物學(xué))，其中兩個(gè)殘基靠近活性位點(diǎn)或者是活性位點(diǎn)的一部分(參見(jiàn)Deluca和McElroy(1978)酶學(xué)方法，57，3-15)。本發(fā)明人確定共價(jià)偶聯(lián)試劑與這些殘基的結(jié)合引起了所看到的對(duì)酶的滅活并提供了一種可保護(hù)酶不被非可逆的滅活的將蟲(chóng)熒光素酶與測(cè)試試劑偶聯(lián)的方法。
因此本發(fā)明的第一個(gè)方面即提供了一種將蟲(chóng)熒光素酶與化學(xué)本體，特別是一種特異的結(jié)合試劑例如抗體，抗原或核酸，更特別是一種抗體結(jié)合的方法，它包括(a)將蟲(chóng)熒光酶與一種或多種D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和腺苷三磷酸混合和(b)用共價(jià)偶聯(lián)試劑進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶和結(jié)合試劑之間的共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，其中D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸的量足以保護(hù)蟲(chóng)熒光素酶的活性免受共價(jià)偶聯(lián)試劑的抑制。優(yōu)選步驟(a)操作是將蟲(chóng)熒光素酶與其溶液形式的底物混合并且優(yōu)選鎂和腺苷三磷酸二者以腺苷三磷酸鎂(Mg2+ATP)的形式存在，可選擇地與D-蟲(chóng)熒光素在一起。優(yōu)選只存在Mg2+ATP或D-蟲(chóng)熒光素之一。如果Mg2+ATP和蟲(chóng)熒光素三者都存在，那么優(yōu)選要在反應(yīng)混合物中除去氧。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種標(biāo)記的化學(xué)本體，它包含通過(guò)本發(fā)明的方法所提供的與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合了的化學(xué)本體。優(yōu)選化學(xué)本體是一種適于用于特定的結(jié)合測(cè)試的特異的結(jié)合試劑，優(yōu)選是一種抗體，抗原或核酸。當(dāng)結(jié)合試劑是核酸時(shí)優(yōu)選寡核苷酸，但可以是多核苷酸或單個(gè)核苷酸，并且可被用做雜交探針或鏈延伸引物，例如PCR引物。最好本體是一種以前試圖將抗體與蟲(chóng)熒光素酶偶聯(lián)而結(jié)果卻是幾乎全部失活的抗體。
提供蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的化學(xué)本體，和特別是蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的抗體的一個(gè)具體地優(yōu)點(diǎn)是使光導(dǎo)向裝置相關(guān)的捕獲測(cè)試成為可能。在一個(gè)優(yōu)選的這類(lèi)測(cè)試中，靶抗原的捕獲抗體被固定到一個(gè)光導(dǎo)向裝置上，例如一個(gè)可將照在其上的光線(xiàn)輸入到光測(cè)量裝置如光電倍增管上的光導(dǎo)纖維；被測(cè)抗原以液體樣品形式用于光導(dǎo)向裝置并且第二種以蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記為特征的抗體在溶液中與光導(dǎo)向裝置接觸，在那里它與已被捕獲并已與捕獲抗體結(jié)合的抗原結(jié)合。
為了確定捕獲的抗原的存在和/或其量，只需要將溶液中的D-蟲(chóng)熒光素和Mg2+ATP與結(jié)合有抗原-抗體復(fù)合物的光導(dǎo)向裝置的表面相接觸，并測(cè)量發(fā)射并轉(zhuǎn)移到光測(cè)量裝置如光電倍增管中的光的量即可。用這種方式即可進(jìn)行有更高敏感性的光度(luminometric)測(cè)試，通過(guò)應(yīng)用幾種能分別捕獲不同的抗原的光導(dǎo)向裝置并將其放在一個(gè)樣品室中以使可在同一步中加入幾種不同的蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的抗體而同時(shí)進(jìn)行幾種不同的免疫測(cè)試而提供多種特異性。
另外電荷耦合器件(CCD)或等同物如二極管陳列成光電倍增管可被用于同時(shí)在一維或二維探測(cè)器陳列表面監(jiān)測(cè)幾個(gè)離散區(qū)，各自固定有對(duì)不同抗原特異的抗體，從而可通過(guò)光線(xiàn)發(fā)射的位置檢測(cè)特定抗原的存在。同樣地，將那些光導(dǎo)或電荷耦合器件用在已固定抗原或?qū)Π锌贵w專(zhuān)一的抗免疫球蛋白抗體上，可對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)試，其中當(dāng)同時(shí)以樣品形式加入競(jìng)爭(zhēng)性抗體時(shí)，與光導(dǎo)向裝置上的抗原結(jié)合的蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的抗體的量將會(huì)減少。
對(duì)樣品和蟲(chóng)熒光素酶抗體的添取以及光導(dǎo)向裝置與D-蟲(chóng)熒光素和Mg2+ATP底物溶液的接觸來(lái)說(shuō)，在光電倍增管上檢測(cè)的光的量可能是與樣品中與固定化的抗原或抗免疫球蛋白抗體特異的抗體的量相關(guān)的。
應(yīng)該可以理解如果在光導(dǎo)向裝置的表面結(jié)合了寡核酸探針(參見(jiàn)申請(qǐng)人在PCT/GB92/01698中的方法)并應(yīng)用了蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的寡核苷酸，那么即可以如上所述抗體-抗原測(cè)試類(lèi)似的方法對(duì)寡核苷酸和多核苷酸進(jìn)行測(cè)試。而且，應(yīng)用不同的光導(dǎo)向裝置或陳列區(qū)域(arrayarea)，可從單一的樣品中同時(shí)檢測(cè)抗原和核酸。
在光導(dǎo)向裝置例如平面型波導(dǎo)管或光導(dǎo)纖維(這些它倍加)的表面上進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的結(jié)合測(cè)試的一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)是對(duì)從所感興趣的樣品即結(jié)合的樣品中分離試劑的需要被減小，這是當(dāng)在光導(dǎo)向裝置表面上產(chǎn)生的光在幾百個(gè)納米之內(nèi)時(shí)優(yōu)選被探測(cè)器檢測(cè)的到，但在大量的溶液中卻不能。因此應(yīng)用這類(lèi)形式(format)的測(cè)試(通常稱(chēng)為消散(evanescence))不需要漂洗步驟或連續(xù)的試劑添加，并且因此可以操作迅速還可選擇一種應(yīng)用流動(dòng)元件的液體流動(dòng)形式。
本發(fā)明的標(biāo)記試劑，制造它們的方法以及其使用方法，將參照下文的非限制性實(shí)施例和附圖以說(shuō)明的形式予以例解。
附1示如實(shí)施例1所描述的各種不同量的Mg2+ATP保護(hù)下將蟲(chóng)熒光素酶種與共價(jià)偶聯(lián)試劑溫育后發(fā)光對(duì)時(shí)間的作圖。
圖2示如實(shí)施例1所述進(jìn)行的測(cè)試中，發(fā)光對(duì)蓖麻毒蛋白量的作圖。上面的圖是應(yīng)用1/100稀釋度的IgG-蟲(chóng)熒光素酶組合物獲得的而下面的圖應(yīng)用了1/1000稀釋度。
方程式1熒火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)其中LH2是蟲(chóng)熒光素，E是蟲(chóng)熒光素酶，AMP是腺苷單磷酸，PP1是無(wú)機(jī)焦磷酸，而L是氧化蟲(chóng)熒光素。
實(shí)施例1Multilite光度計(jì)和3.5ml的聚苯乙烯管(Biotrace Bridgend UK)被用于所有的光測(cè)定中。熒火蟲(chóng)蟲(chóng)熒光素酶(L-5256)，DTT，BSA(級(jí)分V)，ATP和蓖麻毒蛋白購(gòu)自Sigma(Poole，UK)；D-蟲(chóng)熒光素購(gòu)自Fluka(Gillingham，UK)以及磺琥珀酰胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)購(gòu)自Pierce和Warriner(Chester，UK)。綿羊抗蓖麻毒蛋白抗體用常規(guī)技術(shù)制得并且其它試劑為分析純。
蟲(chóng)熒光素酶底物是含0.4mmol/L D-蟲(chóng)熒光素，40mmol/L硫酸鎂，2mmol/L ATP，2mmol/L EDTA，2mmol/L DTT，0.2％BSA和2μmol/L焦磷酸鈉的10mmol/L的HEPES緩沖液，pH7.75。從貯液中當(dāng)天新鮮配制底物。向3.5ml聚苯乙烯管中的200μl底物(如上所述)中加入2μl待測(cè)樣品并在5秒鐘之后測(cè)定發(fā)光，綜合10秒鐘的時(shí)間段而對(duì)蟲(chóng)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定。
底物保護(hù)方法將4.2mmol/L蟲(chóng)熒光素酶與630mmol/L Sulfo-SMCC在10mmol/L，pH7.75 HEPES緩沖液混合，并將混合物在室溫溫育30分鐘。在一定的時(shí)間點(diǎn)上從反應(yīng)混合物中取出樣品并在緩沖液中稀釋100倍并測(cè)定樣品的蟲(chóng)熒光素酶活性。向混合物中加入各種濃度的Mg2+ATP或D-蟲(chóng)熒光素并監(jiān)測(cè)其對(duì)活性的影響以確定對(duì)抑制最有效的保護(hù)。
Sulfo-SMCC的共價(jià)偶聯(lián)將綿羊抗蓖麻毒蛋白IgG與2-巰基乙胺氫氯酸鹽在37℃反應(yīng)90分鐘以還原釋放硫羥基團(tuán)(參見(jiàn)PierceWarriner試劑盒說(shuō)明書(shū))。在1ml含0.5mmol/L ATP和2.5mmol/L硫酸鎂pH7.0的磷酸鹽緩中液中配制4mg蟲(chóng)熒光素酶。加入50μl20mmol/L Sulfo-SMCC磷酸鹽緩沖液，pH6.0并將混合物在室溫保溫30分鐘。用Pierce GF-5脫鹽柱純化活化的蟲(chóng)熒光素酶，并將pH7.0的磷酸鹽緩沖液中將活化的蟲(chóng)熒光素酶和還原的IgG以1∶1的摩爾比結(jié)合，其中磷酸鹽緩沖液包含0.25mmol/L EDTA，0.5mmol/L ATP和2.5mmol/L硫酸鎂。將反應(yīng)在室溫進(jìn)行30分鐘并且然后在于Pierce.GF-5脫鹽柱上純化蟲(chóng)熒光素酶-抗體結(jié)合物之前加入10μl 1mol/L的半胱氨酸終止反應(yīng)20分鐘。在使用前將產(chǎn)物貯藏在4℃pH7.0含0.25mmol/LEDTA的磷酸鈉緩沖液。
用如下的ELISA測(cè)試對(duì)結(jié)合的蟲(chóng)熒光素酶中保留的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)以試管為基礎(chǔ)的生物發(fā)光ELISA將聚乙烯管用100μl蓖麻毒蛋白的含0.2％乙基汞硫代水楊酸鈉的磷酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6在4℃包被過(guò)夜。將蟲(chóng)熒光素酶-抗體結(jié)合物在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中稀釋并在用200μl 1％BSA封閉試管之后，加入100μl標(biāo)記抗體并在37℃溫育1小時(shí)。將試管在含5％Tween 20的PBS中漂洗5次。向每克管中加入200μl底物并立即測(cè)定發(fā)光。結(jié)果如

圖1所示為Mg2+ATP保護(hù)底物的結(jié)果，其中以光度計(jì)的讀數(shù)值所示的保留活性的百分比是對(duì)時(shí)間作圖的，它來(lái)自含0.63μmol/LSulfo-SMCC，4.2μmol/L蟲(chóng)熒光素酶和Mg2+ATP的反應(yīng)混合物對(duì)樣品的消耗(removal)(每個(gè)點(diǎn)三個(gè)重復(fù))。作圖示不含Mg2+或ATP；0.03mmol/L ATP和0.2mmol Mg2+，0.125mmol/L ATP和2.0mmol/LMg2+，0.25mmol/L ATP和2.5mmol/L Mg2+的反應(yīng)。還評(píng)價(jià)了D-蟲(chóng)熒光素的保護(hù)作用(未出示)并且發(fā)現(xiàn)可保留一定的活性但明顯比Mg2+ATP的作用低。測(cè)試的D-蟲(chóng)熒光素酶的濃度的最大值是1mmol/L并且當(dāng)與Sulfo-SMCC接觸30分鐘可保持蟲(chóng)熒光素酶的活性與用Mg2+ATP的大于40％相比，它可保留11％的活性。
圖2示以試管為基礎(chǔ)的生物發(fā)光ELISA結(jié)果。使用聚苯乙烯管是為了可以直接在Multilite光度計(jì)上進(jìn)行光測(cè)量，但是同樣可使用微滴定板和平板光度計(jì)。結(jié)果表明活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合物被制得并且抗體保留了其結(jié)合特征。實(shí)施例2將抗蓖麻毒蛋白的綿羊多克隆抗體與跟光電倍增管相連的光導(dǎo)纖維共價(jià)偶聯(lián)；帶有偶聯(lián)抗體的纖維的部分(段)位于一個(gè)小室中，如果需要該小室可以被各種溶液填滿(mǎn)或也可倒空。測(cè)試按如下的循環(huán)進(jìn)行(i)將含D-蟲(chóng)熒光素的底物溶液加入到小室中以使任何存在的蟲(chóng)熒光素酶引起光的發(fā)射；(ii)用含蓖麻毒蛋白的測(cè)試樣品替代底物溶液；(iii)用含蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的綿羊抗蓖麻毒蛋白IgG的溶液替代測(cè)試樣品溶液；
(iv)用含D-蟲(chóng)熒光素的底物溶液取代綿羊抗蓖麻毒蛋白溶液；(v)用再生緩沖液取代底物溶液。
用這種形式就可能確定測(cè)試樣品中的蓖麻毒蛋白的量，聯(lián)系步驟(iv)中光電倍增管中相對(duì)原始信號(hào)的信號(hào)的增加并聯(lián)系蓖麻毒蛋白的量，例如應(yīng)用獲得的已知量的蓖麻毒蛋白的信號(hào)的增加的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
本申請(qǐng)所描述的結(jié)合蟲(chóng)熒光素酶的方法和標(biāo)記的化學(xué)本體也適于對(duì)于英國(guó)申請(qǐng)GB 9405750.2的PCT/GB95/00629申請(qǐng)中描述的蟲(chóng)熒光素酶。同樣地該方法也可適于GB 9501170.6，GB 9501l72.2中所描述的蟲(chóng)熒光素酶并可用于GB 9414096.9中所描述的捕獲測(cè)試。
權(quán)利要求
1.一種將蟲(chóng)熒光素酶與化學(xué)本體結(jié)合的方法，它包括(a)將蟲(chóng)熒光素酶與一種或多種D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和腺苷三磷酸混合和(b)用共價(jià)偶聯(lián)試劑進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶和化學(xué)本體之間的共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，其中D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸的量足以保護(hù)蟲(chóng)熒光素酶活性免受共價(jià)偶聯(lián)試劑的抑制。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的操作是在溶液中將蟲(chóng)熒光素酶與D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸混合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中鎂離子和腺苷三磷酸二者是以腺苷三磷酸鎂(Mg2+ATP)的形式存在。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)操作中為4μmol/L蟲(chóng)熒光素酶應(yīng)用了0.2mmol/L或更多的ATP。
5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟(a)的操作需要2mmol/L鎂離子的存在。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中共價(jià)偶聯(lián)劑包括戊二醛，SMCC和/或SMPB。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)的操作是在蟲(chóng)熒光素酶已被共價(jià)偶聯(lián)試劑在D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸(ATP)的存在下激活之后進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中應(yīng)用了0.5mmol/L ATP。
9.一種標(biāo)記的化學(xué)本體，它包括由權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法所提供的與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的化學(xué)本體。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法或標(biāo)記的化學(xué)本體，其中化學(xué)本體是適用特定的結(jié)合測(cè)試的特定的結(jié)合試劑。
11.權(quán)利要求10的方法或標(biāo)記的化學(xué)本體，其中化學(xué)本體是一種抗體；抗原或核酸。
12.一種特異的結(jié)合測(cè)試，其特征在于它包括對(duì)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的標(biāo)記化學(xué)本體的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求12的特定的結(jié)合測(cè)試，其中靶化學(xué)本體的存在和/或量是通過(guò)將其特異地與權(quán)利要求6的化學(xué)本體結(jié)合，在一定的條件下將結(jié)合的本體與D-蟲(chóng)熒光素接觸而確定的，其中的條件是蟲(chóng)熒光素酶可裂解D-蟲(chóng)熒光素并引起發(fā)光，并且發(fā)射的光的量與靶化學(xué)本體的存在相關(guān)。
14.權(quán)利要求12或13的特定的結(jié)合測(cè)試，其中靶化學(xué)本體是一種抗原并且在同與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的特異的結(jié)合試劑結(jié)合之前被一種對(duì)其特定的捕獲抗體捕獲。
15.權(quán)利要求14的特定的結(jié)合測(cè)定，其中與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的特定的結(jié)合試劑是一種對(duì)靶抗原特異的抗體。
16.權(quán)利要求14或15的特定的結(jié)合測(cè)試，其中捕獲抗體與可將光傳向光測(cè)量裝置的光導(dǎo)向裝置結(jié)合。
17.權(quán)利要求16的特定的結(jié)合測(cè)試，其中光導(dǎo)向裝置是光導(dǎo)纖維。
18.權(quán)利要求14或15的特定的結(jié)合測(cè)試，其中一個(gè)光探測(cè)裝置被用于同時(shí)監(jiān)測(cè)一維或二維探測(cè)器陳列表面幾個(gè)不同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域具有固定化的分別對(duì)不同的抗原或抗體特異的抗體或抗原；從而可通過(guò)對(duì)所探測(cè)光發(fā)射的位置的檢測(cè)而檢測(cè)特定的抗原的存在。
19.權(quán)利要求18的測(cè)試，其中的光探測(cè)器裝置是電荷耦聯(lián)器件。
20.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)要求的方法的與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的特定的結(jié)合試劑。
21.一種測(cè)試試劑盒，其特征在于它包含一種與活性蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的抗體。
22.權(quán)利要求21的檢測(cè)試劑盒，其特征在于結(jié)合的蟲(chóng)熒光素酶具有用于制備標(biāo)記抗體的蟲(chóng)熒光素酶活性的10％或更多的活性。
23.權(quán)利要求21或22的檢測(cè)試劑盒，其特征在于它包括在其上固定了抗體，抗原或核酸的光導(dǎo)向裝置或光探測(cè)器陳列。
24.一種將蟲(chóng)熒光素酶與化學(xué)本體結(jié)合的方法，這包括(a)將蟲(chóng)熒光素酶與D-蟲(chóng)熒光素或鎂離子和腺苷三磷酸的結(jié)合物相混合和(b)用共價(jià)偶聯(lián)試劑在蟲(chóng)熒光素酶和化學(xué)本體之間進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，其中D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸的量足以保護(hù)蟲(chóng)熒光素酶活性免受共價(jià)偶聯(lián)試劑的抑制。
25.一種將蟲(chóng)熒光素酶與化學(xué)本體結(jié)合的方法，它包括(a)將蟲(chóng)熒光素酶與一種或多種D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和腺苷三磷酸混合和(b)用共價(jià)偶聯(lián)試劑進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶和化學(xué)本體之間的共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，其中D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸的量足以保護(hù)蟲(chóng)熒光素酶活性免受共價(jià)偶聯(lián)試劑的抑制，前提是D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和腺苷三磷酸都存在時(shí)，必須將反應(yīng)中的氧去除。
全文摘要
提供了一種將蟲(chóng)熒光素酶與一種化學(xué)本體結(jié)合的方法，具體地是與一類(lèi)特異的結(jié)合劑如抗體，抗原或核酸，以及更具體地說(shuō)是一種抗體結(jié)合的方法，它包括(a)將蟲(chóng)熒光素酶與一種或多種D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和腺苷三磷酸混合以及(b)用共價(jià)偶聯(lián)劑在蟲(chóng)熒光素酶和結(jié)合劑之間進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，其中D-蟲(chóng)熒光素，鎂離子和/或腺苷三磷酸的量足以保護(hù)蟲(chóng)熒光素酶的活性免受共價(jià)偶聯(lián)劑的抑制。優(yōu)選步驟(a)的操作是將蟲(chóng)熒光素酶與其底物在溶液中混合并優(yōu)選鎂和腺苷三磷酸二者以腺苷三磷酸鎂的形式存在(Mg
文檔編號(hào)C12Q1/66GK1161746SQ9519577
公開(kāi)日1997年10月8日 申請(qǐng)日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月1日
發(fā)明者D·斯奎勒爾, M·J·墨菲 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部