專利名稱：：突變的青霉素g?；D(zhuǎn)移酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及原核生物青霉素G?；D(zhuǎn)移酶或其酶原(preenzyme)或前酶原(preproenzyme)的突變。這種突變導(dǎo)致突變的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶特性的改變。
背景技術(shù)：
：β-內(nèi)酰胺類抗生素主要由發(fā)酵獲得。青霉屬與頭孢屬(頂孢霉屬)的真菌用來產(chǎn)生一些β-內(nèi)酰胺抗生素的(如青霉素G、青霉素V和頭孢菌素C，這些發(fā)酵產(chǎn)物也分別稱作PenG，PenV和CefC)的原材料。幾乎所有的這些起始材料都以青霉素和頭孢菌素投放市場。一般來說在青霉素核的6-氨基或者頭孢菌素核的7-氨基位置上的酰基基團被稱為“側(cè)鏈”，相應(yīng)的酸被稱為“側(cè)鏈酸”。PenG，PenV和CefC的側(cè)鏈分別為苯乙酰、苯氧乙酰和氨基己二酰。通過切斷酰胺鍵(脫?；饔?可使側(cè)鏈從環(huán)上脫離，如果是青霉素分子，就產(chǎn)生6-氨基青霉酸(6-APA)，而對頭孢菌素而言產(chǎn)生7-氨基頭孢菌酸(7-ACA)。在這一點上，苯乙酰基-7-氨基去乙酸基(deacylation)頭孢菌酸(CefG)也應(yīng)被認(rèn)為是7-ADCA的前體，雖然其并非發(fā)酵產(chǎn)物。CefG通常是以化學(xué)方法用青霉素G為前體產(chǎn)生的。為了獲得活性范圍改變的β-內(nèi)酰胺化合物，增加對β-內(nèi)酰胺酶的抗性或改進β-內(nèi)酰胺化合物的臨床特性，6-APA，7-ACA以及7-ADCA被作為合成操作的起點用生產(chǎn)各種選擇的青霉素和頭孢菌素。至今這些半合成青霉素與頭孢菌素在β-內(nèi)酰胺抗生素中仍占有很重要的市場。這些半合成β-內(nèi)酰胺產(chǎn)物必須由發(fā)酵得到的青霉素與頭孢菌素的脫酰化獲得。雖然一些相當(dāng)有效的化學(xué)方法可用來脫?；?J.Verweij&Vroom，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas112(1993)66-81)，但現(xiàn)在這些酶促方法的高耗能以及化學(xué)方法導(dǎo)致的環(huán)境問題更加受到重視(Dunnill，P.，固定化細胞和酶技術(shù)，Philos，Philos，Trans.R.Soc.LondonB290(1980)409-420)?？梢酝瓿纱呋?內(nèi)酰胺化合物脫酰化的酶根據(jù)它們催化的化學(xué)反應(yīng)被歸為水解酶類。當(dāng)然，那些在β-內(nèi)酰胺化合物脫?；刑貏e有用的水解酶在本領(lǐng)域通常被稱作“?；D(zhuǎn)移酶”或“酰胺酶”。這些名稱在這種特定的情況下具有相同的含義。與β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)聯(lián)，這些?；D(zhuǎn)移酶通常被特稱為“β-內(nèi)酰胺?；D(zhuǎn)移酶”，因為并非所有的酰胺酶都可以以β-內(nèi)酰胺核作為?；鶊F的受體/供體。根據(jù)文獻記載，依據(jù)它們的底物特異性和分子結(jié)構(gòu)，β-內(nèi)酰胺?；D(zhuǎn)移酶可分為幾類(B.S.Deshpande等，微生物學(xué)和生物技術(shù)世界雜志，10(1994)129-138)。酰基轉(zhuǎn)移酶，命名及分類根據(jù)特異性分類酰基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性取決于酶上的側(cè)鏈結(jié)合位點。所述位點也就是酶識別β-內(nèi)酰胺分子的側(cè)鏈部分的識別位點。一般來說，酰基轉(zhuǎn)移酶對與氮原子相鄰的酰胺基團并沒有很強的特異性(該基團可能是cephem基團、penem基團、氨基酸、糖等)(J.G.Shewale等，國際生物化學(xué)方法，1990年6月，97-103)。對于青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶(苯甲基青霉素酰胺水解酶，也稱青霉素酰胺酶，EC3.5.1.11)而言，?；糠质欠浅Ｊ杷?，并且優(yōu)選的是苯乙?；?短的)烷基。青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在工業(yè)上用來水解PenG或CefG，從而產(chǎn)生苯乙酸和6-APA或7-ADCA，這些化合物是工業(yè)上生產(chǎn)半合成青霉素和頭孢菌素非常重要的中間體。除了以上所述的主要用途外，據(jù)報道這些酶也應(yīng)用在其它一些反應(yīng)過程中。如有機合成和肽化學(xué)中用于保護/脫保護敏感基團，立體特異性轉(zhuǎn)化，苯酰甘氨酸的光學(xué)轉(zhuǎn)變，carbinols的脫酯化，mono-bactams的?；?。在這些應(yīng)用中，這些酶或者以自然狀態(tài)使用，或者以固定化制品的方式使用。具有酶活性的微生物全細胞也可以以細胞懸液的方式或固定化細胞制品的方式使用。不能被青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶水解的底物的例子是具有荷電的?；糠值哪切?，二羧酸琥珀酰，戊二酰，己二酰以及氨基己二酰，CefC的側(cè)鏈。青霉素V?；D(zhuǎn)移酶對苯氧乙?；懈叨鹊奶禺愋?，而氨芐青霉素?；D(zhuǎn)移酶優(yōu)先選擇D-苯基甘氨酸作為側(cè)鏈。戊基(glutaryl)-?；D(zhuǎn)移酶使戊基7-ACA脫酰基，后者是在用D-氨基氧化酶使側(cè)鏈酶促脫酰氨基后接著用過氧化物(其在第一步中產(chǎn)生)化學(xué)脫羧形成酮基己二酰衍生物從CefC制備的。而且，已報道這些?；D(zhuǎn)移酶中的一些能夠水解以琥珀酰，戊二酰和己二酰為?；糠值念^孢菌酸(包括去乙酸基衍生物)，甚至在CefC很有限的情況下(綜述參見EP-A-322032，Merck)。迄今為止，這些?；D(zhuǎn)移酶僅在假單胞菌屬的一些種，巨大芽孢桿菌和粘節(jié)桿菌的一些菌株中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特性分類除了特異性外，也可以根據(jù)分子特點對?；D(zhuǎn)移酶進行分類(V.K.Sudhakaran等，方法-生物化學(xué)27(1992)131-143)-I型酰基轉(zhuǎn)移酶對青霉素V是特異性的。這些酶由四個分子量為35kDa的相同的亞單位組成。-II型?；D(zhuǎn)移酶具有以下共同的分子結(jié)構(gòu)這些酶都是由一個小的亞單位(α16-26kDa)和一大的亞單位(β54-66kDa)組成的異源雙體。根據(jù)結(jié)構(gòu)特異性，II型乙酰轉(zhuǎn)移酶還可以進一步分為兩組-IIA型?；D(zhuǎn)移酶包括青霉素G?；D(zhuǎn)移酶；-IIB型?；D(zhuǎn)移酶包括戊二酰酰基轉(zhuǎn)移酶。-III型?；D(zhuǎn)移酶是氨芐青霉素?；D(zhuǎn)移酶，已報道它們是由分子量為72kDa的兩個相同的亞單位組成的二聚體。蛋白質(zhì)工程在篩選/化學(xué)修飾方面的優(yōu)點已開發(fā)或發(fā)現(xiàn)了幾種改進酶特性的方法，如，經(jīng)典的篩選方法，對已存在的蛋白質(zhì)進行化學(xué)修飾或者現(xiàn)代基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)。可以篩選具有所需酶促活性的有機體或微生物，例如，從某種微生物或一些微生物的培養(yǎng)液中分離和純化酶，然后確定該酶的化學(xué)特性和這些化學(xué)特性是否符合應(yīng)用的需要?，F(xiàn)收集到的?；D(zhuǎn)移酶都是一些靈敏的篩選方法的結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶已在許多生物。如真菌，酵母，放線菌，以及細菌中發(fā)現(xiàn)。如果已鑒別的酶不能從它的天然產(chǎn)生有機體獲得，則就可以用重組DNA技術(shù)分離編碼酶的基因，然后在其它生物體中表達該基因，并且分離純化所表達的酶和檢測該酶是否適合應(yīng)用意圖?？梢蕴貏e用化學(xué)修飾方法實現(xiàn)對現(xiàn)有的酶的修飾。通常，這些方法特異性太低，以致會修飾具有共同側(cè)鏈的酶的所有可接近的殘基，或者這些方法依賴于存在合適修飾的氨基酸。而且，化學(xué)修飾法不能對一些不易接觸到的氨基酸進行修飾，除非酶分子不發(fā)生折疊。此外，化學(xué)修飾法還需要一些制備酶的額外的步驟和化學(xué)藥品。通過用編碼基因進行誘變的方法進行酶修飾不會遇到這些問題。因此，這種方法更為優(yōu)越。除了選擇一種?；D(zhuǎn)移酶之外，隨后的高產(chǎn)青霉素?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的構(gòu)建和篩選以及純化和固定的工業(yè)方法的開發(fā)是一個艱巨的過程。就突變體產(chǎn)生以及隨后的形成而言，通常可以遵循野生型方案。因此，一旦某種?；D(zhuǎn)移酶的這種開發(fā)成功，擴大這種選擇的?；D(zhuǎn)移酶的應(yīng)用就比繼續(xù)從其它來源篩選酶更具吸引力。因而，通過對具有編碼功能的野生型基因進行誘變而進行酶修飾的辦法被認(rèn)為是優(yōu)越的，尤其在需要酶特性的小的改造時。所需特性可以包括改變的特異性，對某種底物的改變的特殊活性，改變的pH依賴性或改變的穩(wěn)定性。誘變可以通過隨機誘變和定向誘變來實現(xiàn)。隨機誘變方法通過化學(xué)誘變劑或誘變照射對微生物全細胞進行處理，當(dāng)然可以導(dǎo)致酶的修飾，但在誘變后必須經(jīng)過大量的篩選步驟才能找到具有所需特性的突變體。通過克隆編碼的酶，在體外或體內(nèi)對其進行誘變，然后再將該突變基因亞克隆到合適的宿主細胞中來表達該基因所編碼的酶的方法可以大大提高隨機誘變后純化所需突變酶的可能性。在這種情況下，用來篩選篩選突變酶的合適的生物篩選方法必須是有效的。定點誘變是獲得修飾的最特異的方法。這種方法可以用任何其它的所需氨基酸來特異性地取代一個或多個氨基酸?？梢酝ㄟ^化學(xué)法和酶法將β-內(nèi)酰胺中間體轉(zhuǎn)化為所需的半合成抗生素。假如一種合適的酶是可用的，則酶學(xué)途徑是比較好的。這是因為-可以立體有擇性地進行反應(yīng)。-反應(yīng)物不需要象硅烷化之類的側(cè)鏈保護。-對有機溶劑的需要更少，比如可以省去引起環(huán)境問題的二氯甲烷之類的有機溶劑。-與化學(xué)方法相比，所需步驟通常要少一些。-不需高溫高壓。-通常，副產(chǎn)物含量較低。各種選擇的青霉素和頭孢菌素的的合成操作基本上都分別從6-APA，7-ACA以及7-ADCA開始。酶促轉(zhuǎn)化利用了在合適的條件下所有的酶反應(yīng)都是可逆的這一點。這在應(yīng)用上的重要性已在以前的綜述中被闡明。文獻列舉一些青霉素?；D(zhuǎn)移酶在生物合成路線中應(yīng)用的例子(J.G.Shewale等，國際方法生物化學(xué)，1990年6月，91-103)。6-APA，7-ADCA，7-ACA，3-氨基-4-α-甲基monobactamic酸和肽的?；苌镆呀?jīng)通過各種結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈部分制備。除了6-APA和7-ADCA外，青霉素?；D(zhuǎn)移酶也用于生產(chǎn)一些抗生素中間體，如6-氨基-2，2-二甲基-3-(四唑-5基)penam，甲基-6-氨基青霉酸，3-甲基-7-氨基-2-cephem-4-羧酸和3-氨基諾卡氏菌酸。水解反應(yīng)在堿性pH(4.0-7.0)條件下被催化而酸性條件則促進?；磻?yīng)。在生物轉(zhuǎn)化過程中，許多因素都會影響?；D(zhuǎn)移酶的特性-反應(yīng)介質(zhì)pH，離子強度，溫度，有機溶劑等；-對處理條件而言的穩(wěn)定性；-反應(yīng)物的穩(wěn)定性；-酶的催化活性。除了非酶性質(zhì)的穩(wěn)定性外，其它因素都可以是通過蛋白質(zhì)工程進行的酶修飾的目標(biāo)。為了使生物合成過程經(jīng)濟可行，已探討了這些因素的各種。甲基酯(與側(cè)鏈酸的游離酸相比其是高級?；w)以用于反應(yīng)。為了有利于?；?，經(jīng)用某些溶劑改變酶分子周圍的水活性已移動了反應(yīng)平衡，例如聚乙二醇，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇和丙酮被用于提高青霉酸G，青霉酸V和氨芐青霉素的產(chǎn)量。?；磻?yīng)(尤其是用6-APA，7-ADCA和7-ACA的)產(chǎn)生重要的臨床抗生素。然而，反應(yīng)需要在嚴(yán)格的動力學(xué)參數(shù)控制下監(jiān)測。盡管在某些文獻中推測蛋白質(zhì)工程工具可以開發(fā)來獲得定制的酶分子，以可以與現(xiàn)存的化學(xué)方法相競爭的量給出半合成青霉酸和頭孢菌素，但不存在任何這樣的技術(shù)，既不知道如何進行或制作哪一種工程酶，也不知道哪一個氨基酸殘基應(yīng)被取代或取代種類和所需底物之間有何關(guān)系。給定的青霉素?；D(zhuǎn)移酶的合成潛力是有限的，這是因為酶的特異性。因此，人們對開發(fā)在脫酰/?；磻?yīng)中高效產(chǎn)生所需化學(xué)物質(zhì)的酶具有極大的興趣。特別的興趣是β-內(nèi)酰胺(尤其是PenG，PenV，CefC和它們的衍生物)脫?；a(chǎn)生6-APA和7-ACA和衍生物，后者?；a(chǎn)生目標(biāo)青霉酸和頭孢菌素。此外，增加更具極性的側(cè)鏈或荷電側(cè)鏈(如丁二酰，戊二?；蛘呒憾?的活性是所需的。具體地說，用能夠催化CefC(和衍生物)轉(zhuǎn)化成為7-ACA(和衍生物)的有效酶處理是非常重要的。合成中酶應(yīng)用的理論方面青霉素G?；D(zhuǎn)移酶是水解酶，其催化各種β-內(nèi)酰胺化合物的脫?；?。此外，由于酶以兩個方向催化反應(yīng)，所以這些酰基轉(zhuǎn)移酶也用作為轉(zhuǎn)移酶來催化產(chǎn)物(諸如β-內(nèi)酰胺抗生素，多肽，低聚糖或甘油酯)的縮合合成。酶催化的合成可以以平衡控制或動力學(xué)控制的反應(yīng)進行。在平衡控制過程中，酶僅加速建立熱力學(xué)平衡的速率。酶的動力性質(zhì)不影響平衡濃度。然而，熱力學(xué)平衡依賴反應(yīng)條件如pH值，溫度，離子強度，或溶劑組合。有利于以獲得所需產(chǎn)物最佳產(chǎn)量的方式移動熱力學(xué)平衡的反應(yīng)條件通常對酶功能不是最佳的。在這種情況下，用酶工程改造酶使其適應(yīng)接近熱力學(xué)最佳反應(yīng)的條件可能是所需的。在這一方面，穩(wěn)定性，最適溫度以及pH值可以是有用的目標(biāo)。在動力學(xué)控制反應(yīng)中，以使所需產(chǎn)物在非平衡條件下的反應(yīng)期間產(chǎn)生大量積累的方式選擇反應(yīng)條件。在這種情況下，除已經(jīng)論及的參數(shù)之外，酶的動力性質(zhì)在獲得可以與現(xiàn)存的化學(xué)方法有利地競爭的產(chǎn)物中也是重要的因素。青霉素C?；D(zhuǎn)移酶的動力學(xué)與經(jīng)?；?酶媒介的催化過程一致。如圖1所示，這一媒介在酶機制中起關(guān)鍵作用。在這一方案中，?；D(zhuǎn)移酶充當(dāng)水解酶(此時酰基基團轉(zhuǎn)移到水中)和轉(zhuǎn)移酶(此時?；鶑募せ畹牡孜镛D(zhuǎn)移到親核試劑被催化)。由?；D(zhuǎn)移酶的特異性確定化合物X-CO-NH-Y(其是特定?；D(zhuǎn)移酶的底物)中化學(xué)基團X和Y的性質(zhì)。X代表側(cè)鏈，而Y代表?；荏w基團。例如，對于PenG的脫酰作用，X-CO-代表苯基-乙?；鶄?cè)鏈，-NH-Y代表6-氨基青霉酸。對給定的某些酶促機制而言，由X和Y結(jié)合位點的體系結(jié)構(gòu)和氨基酸組成確定特異性。在所述機制的第一個步驟中，底物結(jié)合到酶上形式-非共價Michaelis-Menten復(fù)合物。在爾后的步驟中，共價的媒介在底物的酶和酰基部分之間形成(E-CO-X)。可以通過酰胺鍵(X-CO-NH-Y的酰胺水解)或酯鍵(X-CO-O-R的之水解)的裂解可以發(fā)生?；?酶的形成，在低的pH值下，其也可以直接從X-COOH形成。在脫酰作用之前親核試劑YNH結(jié)合到酰基-酶上。在有利于脫?；臈l件下(酶充當(dāng)脫酰酶或酰胺酶)，水分子水解?；?酶，進而釋放出第二種產(chǎn)物X-COOH，并且使酶再生用于新的催化循環(huán)。在有利于形成化合物X-CO-NH-Y的條件下，親核試劑Y-NH與酶而不是與水(氨解)反應(yīng)。對PenG，所述機制由觀察到苯乙酸作為競爭性抑制物起作用，同時6-APA作為非競爭抑制劑起作用得到證實。然而，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈酯衍生物(X-CO-O-R)或僅僅酰胺(X-CO-NH2)時，與水解(V3)相比，?；?酶(V2)形成相對較快。結(jié)果是?；该浇槲锓e累。在具有游離伯氨基(一般由Y-NH2表示)的合適的化合物(例如，被?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合的6-APA，7-ACA，7-ADCA)存在時，可以形成酰胺，給出X-CO-N-Y(V-1氨解)。就化學(xué)基團X和Y的優(yōu)先選擇而言，在X和Y結(jié)合位點的殘基取代改變這一優(yōu)先選擇。在底物特異性方面變化包括所有Vmax和Km的增加和減少的組合，在某些情況下，需要更特異性酶，例如，在旋光對映體混合物的情況下，但酶對旋光選擇性地針對對映體中的一個時，其會是有用的。在其它情況之下，例如轉(zhuǎn)化相當(dāng)純的化合物時，在選擇的成本下的高轉(zhuǎn)化率是優(yōu)選的。在高底物濃度時，較高的Vmax是優(yōu)選的，而Km并不重要。用于底物激活和動力學(xué)控制的酰基轉(zhuǎn)移酶可以改變，其方式是就酰基轉(zhuǎn)移至非水受體親核試劑(V-1)比率V-1/V3相對于野生型增加而言，使其水解化合物(V3＝轉(zhuǎn)移?；了?的催化能力受到抑制。轉(zhuǎn)移酶對水解酶活性的比率是在縮合產(chǎn)物的動力學(xué)控制合成中影響產(chǎn)率的酶性質(zhì)?？梢詮挠甚；?酶形成X-CO-NH-Y和X-COOH的起始速率可以確定?；D(zhuǎn)移至YNH或H2OD表觀二級速率常數(shù)的比率?？梢酝ㄟ^改善親核試劑對?；?酶復(fù)合物與水的親和性改善轉(zhuǎn)移酶的活性。因為酰基的轉(zhuǎn)移與結(jié)合到?；?酶上的親核試劑的量是相稱的，所以增加酶-?；鶑?fù)合物的親和性將改善水解縮合產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外，可以通過降低獲得的所需產(chǎn)物(V1V3)的水解來獲得酶催化的生物合成中的較高產(chǎn)率。酰胺鍵相對于酯鍵的水解已降低的變體仍然可以從酯底物(V2)形成酰基酶，但具有對產(chǎn)物酰胺鍵的相對較弱的水解能力(相對于野生型的增加的比率V1/V3)。相關(guān)文獻幾種編碼IIA型青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的基因已被測序，即，來源于大腸桿菌(G.Schumacher等，核酸研究14(1986)5713-5727)，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(J.L.Barbero等，基因49(1986)69-80)，糞產(chǎn)堿菌(美國專利5,168,048Gist-brocades)，雷氏普羅威登斯菌(G.Ljubijankic等，DNA測序和作圖雜志3(1992)195-201)和粘節(jié)桿菌(Arthrobacterviscosis)(M.Konstantinovic等(1993)EMBL數(shù)據(jù)庫條目L04471)的基因。重組DNA方法的使用已使得可以增加商業(yè)上使用的青霉素?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生水平(Mayer等，生物技術(shù)進展，1(1982)83-86)，并且擴大了處理這些酶的視野(Schumacher等，核酸研究14(1986)5713-5723)。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的?；D(zhuǎn)移酶作為大前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其進一步被加工成由小(α)和大的(β)亞單位組成的周質(zhì)成熟蛋白質(zhì)。嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆和測序顯示從與大腸桿菌?；D(zhuǎn)移酶基因密切同源的?；D(zhuǎn)移酶基因(J.L.Barbero等，基因49(1986)69-80)。也描述了雷氏變形菌(G.O.Daumy等，細菌學(xué)雜志163(1985)1279-1281)和糞產(chǎn)堿菌(美國專利5,168,048和EP-A-453048，Gist-brocades)的青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶的小和大亞單位。這些出版物既未教導(dǎo)也未建議本發(fā)明的內(nèi)容。已描述了借助于蛋白質(zhì)-工程技術(shù)重新設(shè)計酶的比活(specificactivity)。專利申請EP-130756和EP-251445描述了為了改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，在某些組的絲氨酸蛋白酶中殘基的選擇和這些殘基中某些的誘變。由于這些專利申請具體地涉及絲氨酸蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶型)，因此這些出版物并未指出哪一個殘基調(diào)節(jié)IIa型青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的催化性質(zhì)。Wells等(Proc.Natl.Acad.Sci.美國84(1987)5167)顯示了枯草桿菌蛋白酶的例子。地衣芽孢桿菌和液解化淀粉桿菌絲氨酸蛋白酶不同之處在于蛋白質(zhì)序列中31％(86個殘基)的序列和在某些底物上的催化效率中的60因子。通過用相應(yīng)的地衣芽孢桿菌序列的殘基取代液解化淀粉桿菌序列的86個不同氨基酸中的3個，突變酶的催化活性改善接近69倍。Wilks等(科學(xué)242(1988)1541)描述了如何通過將102位谷氨酰胺突變成精氨酸來將乳酸脫氫酶改變成為蘋果酸脫氫酶。在絲氨酸蛋白酶以及乳酸脫氫酶兩種情況下，修正建議的靈感來源于與天然發(fā)生的酶(其已經(jīng)顯示所需的特異性)比較。用相同的方法，通過以Phe209代替Leu209，細胞色素p45015α的特異性被改變成為細胞色素p450coh的特異性(Lindberg和Negishi，自然339(1989)632)。專利申請WO93/15208描述了用于修飾脫氫酶特異性和或的效率而保持其催化活性的方法，該方法的特征在于它包括選擇酶，其三級結(jié)構(gòu)是實質(zhì)上已知的或可推測的；鑒別至少一個特異性和/或效率相關(guān)區(qū)；鑒別或者構(gòu)建結(jié)合在DNA編碼序列中鑒別的區(qū)的單一限制位點；除了隨機化至少一個密碼子上的核苷酸，或選擇鑒別的區(qū)的至少一部分的取代基(其自身同樣地可以隨機化)而外產(chǎn)生相應(yīng)于鑒別的區(qū)的至少一個部分的DNA序列；用產(chǎn)生的或取代的DNA序列替代原有序列；表達包括產(chǎn)生或取代的DNA序列的DNA；和選擇一種所需的修飾以便DNA編碼序列可被分離。脫氫酶與青霉素C酰基轉(zhuǎn)移酶毫不相關(guān)，這一專利申請沒有揭示出在?；D(zhuǎn)移酶中應(yīng)被取代與改變其動力性質(zhì)的殘基。Forney等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)55(1989)2550-2556；應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)55(1989)2256-2260)以用克隆和化學(xué)/UV隨機誘變技術(shù)分離到能夠在戊二酰-L-亮氨酸或D(-)-α-氨基-苯基-乙?；?(L)-亮氨酸上生長的的日益增長的大腸桿菌菌株。突變體產(chǎn)生的青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶在pH值5和6之間水解戊二酰-L-亮氨酸，在pH值6.5時水解D(-)-α-氨基-苯基-乙?；?(L)-亮氨酸。雖然推測青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的特異性變化之由于酰基轉(zhuǎn)移酶中的一個或多個突變，但沒有鑒別出涉及的殘基和突變的類別。J.A.WilliamsT.J.Zuzel(細胞生物化學(xué)(1985)補充9B，99)在摘要中報道了經(jīng)體外蛋氨酸誘變的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性修飾。盡管摘要中并沒有報道這一蛋氨酸的位置，但從其敘述中似乎可以得出結(jié)論，其涉及大腸桿菌?；D(zhuǎn)移酶Met168位置。然而，這一文獻沒有揭示與所觀察的特異性有關(guān)的甲硫氨酸有關(guān)的如何取代的任何細節(jié)。Prieto等(I.Prieto等，應(yīng)用微生物生物技術(shù)，31(1990)553-559)用丙氨酸，纈氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，酪氨酸取代嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌中蛋氨酸168(其影響PenG和PenV脫?；膭恿?shù))。此外，制備了幾乎不顯示出任何作用的突變體賴氨酸375天冬酰胺和組氨酸481酪氨酸。J.Martin等分析了嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶中突變體蛋氨酸168丙氨酸并報道了改變的動力學(xué)性質(zhì)(J.Martin&I.Prieto，BiochimicaetBiophysicaActa1037(1990)133-139)。這些參考文獻表明168位上的殘基在大腸桿菌和嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌?；糠痔禺愋陨系闹匾?。然而，這一文獻沒有揭示出有關(guān)轉(zhuǎn)化所需底物的特異性改變的蛋氨酸如何取代的任何細節(jié)。WangMin報道了在大腸桿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中誘變絲氨酸177成甘氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，精氨酸以獲得活性?；D(zhuǎn)移酶(WangMin等實驗生物學(xué)報24(1991)，1，51-54)。KyeongSookChoi等(細菌學(xué)雜志，174，(1992)，6270-6278)用蘇氨酸，精氨酸，甘氨酸和半胱氨酸取代大腸桿菌青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶中β-亞單位N-末端絲氨酸。只有當(dāng)N-末端殘基是半胱氨酸時酶才被正確的加工，并獲得成熟酶但是是失活酶。此外，β-亞單位N-末端絲氨酸的化學(xué)誘變也導(dǎo)致嚴(yán)格/幾乎完全喪失活性(Slade等，歐洲生物化學(xué)雜志197(1991)75-80；J.Martin等，生物化學(xué)雜志，280(1991)659-662)。Sizman等(歐洲生物化學(xué)雜志192(1990)143-151)把大腸桿菌中絲氨酸838取代成半胱氨酸，在翻譯后加工中和酶的催化活性上沒有任何作用。此外，Sizman等制備了青霉素?；D(zhuǎn)移酶的各種缺失突變體，其顯示?；D(zhuǎn)移酶的正確的成熟對誘變非常敏感。除了缺乏最后3個殘基的突變體(然而其非常不穩(wěn)定)之外，所有β-亞單位C-末端缺失突變體不被表達除了突變體都不被表達。在大腸桿菌中位置827插入4個殘基也不能給出活性酶。Prieto等在嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶中將甘氨酸310取代成谷氨酸。然而，沒有獲得活性酶。在EP-453048中描述了蛋白質(zhì)工程如何用于改變IIa型和IIb型?；D(zhuǎn)移酶的特異性。然而，所使用的方法被限制在產(chǎn)生隨機產(chǎn)生的?；D(zhuǎn)移酶突變體文庫，必須篩選所需的活性。盡管經(jīng)該專利申請中描述的方法，可以突變的氨基酸的數(shù)量被降低，但剩下的位置的數(shù)量仍然很大，因此位置定點誘變將是一種艱辛的工作。然而，本發(fā)明在更大程度上限制了可被突變的位置的數(shù)量。此外，這些位置的氨基酸與底物直接接觸，這意味著取代會影響與底物的直接的相互作用。而且，導(dǎo)致本發(fā)明的所述方法使得人們可以選擇特定的氨基酸取代，以獲得對特定底物的所需作用。發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有下列特征的分離的突變原核生物青霉素G?；D(zhuǎn)移酶或或其酶原或前酶原-在相應(yīng)于糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)青霉素G?；D(zhuǎn)移酶或其酶原或前酶原的以下一個或多個位置上具有氨基酸取代A139至A152，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480；和-具有相對于相應(yīng)的野生型未取代的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶來說的改變的底物特異性或者改變的比活。優(yōu)選地，所說的分離的突變原核青霉素G?；D(zhuǎn)移酶來源于糞產(chǎn)堿菌。此外，本發(fā)明也提供了編碼所說突變?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列，包含所說核酸序列的載體，以及用所述載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主菌株。按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了制備所說的分離的突變青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的方法，該方法包括-培養(yǎng)如上所限定的用包含編碼突變?；D(zhuǎn)移酶之核酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主菌株，由此產(chǎn)生所述的突變酰基轉(zhuǎn)移酶；和-分離所說的酰基轉(zhuǎn)移酶。最后，本發(fā)明提供了用于進行酰化或脫?；姆椒ǎf的方法包括使所說的分離的突變青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在適于發(fā)生所說的反應(yīng)的條件下與所說?；D(zhuǎn)移酶的底物接觸。優(yōu)選地，由所說的方法產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺化合物。特別是，本發(fā)明提供了用于使6-?；嗝顾帷?-?；?去乙酸基)頭孢菌酸或者它們的鹽或酯脫酰化，分別形成相應(yīng)的6-氨基青霉或7-氨基(去乙酸基)頭孢菌酸或它們的鹽或酯的方法，該方法包括在適于發(fā)生脫?；臈l件下使所說的6-?；幕蛘?-酰化的化合物與以上限定的突變?；D(zhuǎn)移酶接觸；本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生半-合成6-?；嗝顾?，7-酰化(去乙酸基)頭孢菌酸或者它們的鹽或酯的方法，該方法包括在適于發(fā)生?；臈l件下分別使相應(yīng)的6-氨基的或者7-氨基β-內(nèi)酰胺或者它們的鹽或酯與具有以上限定的突變?；D(zhuǎn)移酶的酰化劑接觸。附圖簡要描述圖1用于IIa型青霉素?；D(zhuǎn)移酶催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)方案。EH代表酶，其中H代表轉(zhuǎn)移到離去基團上的質(zhì)子，X代表?；糠只騻?cè)鏈。Y是待?；?酰化作用)或待脫?；?脫酰作用)的化合物?；衔颴-CO-OR也可以是簡單的酰胺X-CO-NH2。圖2IIa型青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶成熟酶的α(2a)與β(2b)亞單位的序列對比。糞產(chǎn)堿菌(afae)，大腸桿菌(ecol)，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(kcit)，粘節(jié)桿菌(avis)，雷氏普羅威登斯菌(pret)。鏈識別符A和B分別用于α和β鏈。星號指序列在那一位置包含與糞產(chǎn)堿菌序列相同的氨基酸。雷氏普羅威登斯菌酰基轉(zhuǎn)移酶的α亞單位的N末端和C末端未知。雷氏普羅威登斯菌的β亞單位的N末端與前體?；D(zhuǎn)移酶進行序列對比。圖3用于表2和3的涉及命名法的PenG原子命名。圖4糞產(chǎn)堿菌PenG?；D(zhuǎn)移酶苯乙酰部分周圍活性位點的立體圖。圖5具有糞產(chǎn)堿菌青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶基因，大腸桿菌ori“高拷貝”，Tac啟動子，F(xiàn)d-終止子，cap-，amp*fl起點的pMcAF誘變載體。圖6野生型糞產(chǎn)堿菌?；D(zhuǎn)移酶和突變體AM143V，BLS6K，AF147Y對各種底物的最大脫酰速度。各變體的速度是相對于PenG的Vmax(X)/Vmax(PenG)。X代表PenV，CefG，氨芐青霉素(Ampi)，(D)苯基甘氨酰胺((D)PGA)或NIPAB。圖7野生型糞產(chǎn)堿菌?；D(zhuǎn)移酶和突變體BL56G，BL56A，EL56V，BI177V，BI177S，BA67S，BA67G對各種底物的最大脫酰速度。各變體的速度是相對于PenG的Vmax(X)/Vmax(PenG)。X代表PenV，CefG，氨芐青霉素(Ampi)，(D)苯基甘氨酰胺((D)PGA)或NIPAB。發(fā)明的詳細描述水解/脫酰作用本發(fā)明涉及改變青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的動力性質(zhì)的殘基的鑒別。因而所形成的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶變體就伯氨基脫?；?例如，出現(xiàn)在青霉素和頭孢菌素中的)而言比前體青霉素G?；D(zhuǎn)移酶更有用。這些動力性質(zhì)包括比活，動力學(xué)參數(shù)的pH依賴性，底物特異性，立體-選擇性以及轉(zhuǎn)移酶對水解酶活性比率。合成/?；饔帽景l(fā)明涉及青霉素G?；D(zhuǎn)移酶變體，這些變體是經(jīng)由重組體DNA方法通過在前體中改變至少一個氨基酸殘基從所說前體青霉酸G酰基轉(zhuǎn)移酶衍生的，就伯氨基的酰化(例如，發(fā)生于β-內(nèi)酰胺核(P-arationsemi-合成)和肽類中的)而言，所說的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶變體比所說的前體青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶更有用。本發(fā)明涉及青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶變體，這些變體是經(jīng)由重組體DNA方法通過在前體中改變至少一個氨基酸殘基從所說前體青霉酸G酰基轉(zhuǎn)移酶衍生的，所說的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶變體的特征在于具有比所說的前體青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶更高的轉(zhuǎn)移酶對水解酶活性比率。作為本發(fā)明的目的的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶-是從原核生物分離的；-被轉(zhuǎn)錄為一個單肽鏈前體；-在轉(zhuǎn)錄之后被胞內(nèi)加工與小的N-末端結(jié)構(gòu)域(α結(jié)構(gòu)域)和大的C-末端結(jié)構(gòu)域(β鏈)形成異源雙體。N-末端結(jié)構(gòu)域的分子量范圍為16-28kDa。C-末端結(jié)構(gòu)域的分子量范圍為54-68kDa；-可以作為αβ異源雙體的多聚體出現(xiàn)在溶液中；-β-亞單位的N-末端有一個絲氨酸。產(chǎn)生這樣的?；D(zhuǎn)移酶的微生物是下列種的一些菌株大腸桿菌，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌，雷氏普羅威登斯菌，假單胞菌的種，糞產(chǎn)堿菌，巨大芽孢桿菌和粘節(jié)桿菌。幾種編碼青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的基因編碼已被測序，所說基因即來源于大腸桿菌，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌，糞產(chǎn)堿菌，雷氏變形菌和粘節(jié)桿菌的基因。青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的底物特異性的改變是以這樣一種方式完成的，即，使突變酶能夠裂解或者合成具有不是苯乙酰(其是青霉素G的天然側(cè)鏈)的側(cè)鏈的青霉素和頭孢菌素衍生物。不明顯受青霉素G?；D(zhuǎn)移酶影響的側(cè)鏈的例子是來源于二羧酸琥珀酸、戊二酸、脂肪酸、氨基脂肪酸的?；鶊F(后者是CefC的天然側(cè)鏈)。在另一方面，完成了青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶對側(cè)鏈(其已是所說的?；D(zhuǎn)移酶的底物)的特異性和活性的改變。利用蛋白質(zhì)工程，可以改變底物親和性(例如，增加的，由對所說底物的較低Km表達的)，可以改變催化周轉(zhuǎn)率(例如，增加的，由對所說底物的較高的Kcat表達的)，或者可以改變二級速率常數(shù)(例如，由改變的Kcat/Km比率表達的，一個經(jīng)常用于比較酶對不同底物特異性的參數(shù))。在這一方面相關(guān)的底物包括改變的β-內(nèi)酰胺衍生物青霉素V(PenV)，氨芐青霉素，阿莫西林，頭孢氨芐，羥氨芐頭孢菌素或氯氨芐頭孢菌素。此外?；糠值暮唵熙０泛王サ膭恿π再|(zhì)的改變對獲得增加的酰基酶媒介物(其可以改進生物合成方法的產(chǎn)率)的積累是有用的。在另一方面，完成青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的特異性與活性的改變，以增加青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的立體特異性，導(dǎo)致產(chǎn)生在手性化合物的外消旋混合物的轉(zhuǎn)化中顯示出改進的對映異構(gòu)體過量的酶。這種性質(zhì)使得青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶在從苯乙酰側(cè)鏈的外消旋混合物或激活的苯基-乙?；鶄?cè)鏈的衍生物(例如，苯基甘氨酸-酰胺或其酯，P-羥苯基甘氨酸-酰胺或其酯等)合成具有旋光純度的半合成抗生素上特別有用，所說衍生物包含手性α碳原子，這是因為其存在氨基基團(例如，氨芐青霉素，頭孢氨芐，阿莫西林，羥氨芐頭孢菌素，氯氨芐頭孢菌素)或羥基基團(頭孢羥芐唑)。除了對?；鵆α位的立體選擇性以外，青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶也顯示出對底物氨基部分的立體選擇性。在氨基酸的情況下，酰基轉(zhuǎn)移酶需要在Cα碳原子上的L構(gòu)型。在本發(fā)明的另一方面，所說酶對底物氨基部分的立體選擇性可被改變。在本發(fā)明的另一方面，野生型酶的產(chǎn)物抑制被降低。在形成較高產(chǎn)率的轉(zhuǎn)化期間，所需變體保持其起始高脫?；俾瘦^長時間。這樣的抑制產(chǎn)物的例子是苯乙酸酯，苯氧乙酸酯，苯基甘氨酸，p-羥基苯基甘氨酸等。在本發(fā)明的另一方面，相對水解酶活性而言，酶的轉(zhuǎn)移酶活性得到改善，這使得酶在生物合成轉(zhuǎn)化中更有用。特別是在酶促合成阿莫西林，氨芐青霉素，氯氨芐頭孢菌素，羥氨芐頭孢菌素，cefprozil，頭孢力新，和頭孢拉定中具有改進的性能的變體是優(yōu)選的具體例子。與前體?；D(zhuǎn)移酶比較，生物合成所需的變體更容易被β內(nèi)酰胺核(與水比較，氨解/水解比率)脫?；?。這可以由改善相對于水的對親核試劑的結(jié)合獲得。相對于前體酶來說，所需變體對特定的底物具有改變的酯酶/酰胺酶比率，即，對某些側(cè)鏈，與對相應(yīng)側(cè)鏈的酯的酯酶活性比較，所需酶顯示出對那些側(cè)鏈的酰胺衍生物的降低的酰胺酶活性。為了獲得酶分子中的改變，非常需要獲得所說酶的3D結(jié)構(gòu)。迄今還沒有?；D(zhuǎn)移酶的高分辨3D結(jié)構(gòu)出版。以可以獲得最高同源性的方式將已知的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶基因序列衍生的氨基酸序列進行序列對比。對基于相同性也基于類似性的序列對比而言，氨基酸的類別可以用作參數(shù)，例如，絲氨酸類似于蘇氨酸，天冬氨酸類似于谷氨酸等，結(jié)果在圖2中示出，圖2給出了得自大腸桿菌，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌，糞產(chǎn)堿菌，雷氏普羅威登斯菌和粘節(jié)桿菌的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的序列對比。5種氨基酸序列的序列對比揭示出青霉酸G酰基轉(zhuǎn)移酶之間的明顯的同源性(其給出類似的3D結(jié)構(gòu))。在本發(fā)明的一個實施方案中，其它青霉素C酰基轉(zhuǎn)移酶(其結(jié)構(gòu)上類似于糞產(chǎn)堿菌青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶)的相應(yīng)的位置可以被以與糞產(chǎn)堿菌相同的方式在類似于糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的位置上被取代。這些蛋白酶的相應(yīng)的位置可以從圖2所示的氨基酸對比獲得。在圖2中，各種?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與糞產(chǎn)堿菌(A.fae)酰基轉(zhuǎn)移酶的序列進行了對比。盡管本文將用糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的特定例子說明殘基的選擇，但明顯的是由于同源性，在得自其它物種的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中可以選擇取代位點。在來源于其它物種的青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶中氨基酸取代后，所述方法也產(chǎn)生類似的改變的動力學(xué)性質(zhì)?！邦愃频摹敝溉〈哂械膭恿W(xué)參數(shù)改變上的影響的種類。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼已知的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶(例如得自大腸桿菌，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌，糞產(chǎn)堿菌，雷氏普羅威登斯菌和粘節(jié)桿菌以及其它產(chǎn)生所述酶的生物體的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶)的基因被以使酶獲得對底物的改變的特異性的方式突變。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼結(jié)構(gòu)上類似的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶(例如得自大腸桿菌，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌，糞產(chǎn)堿菌，雷氏普羅威登斯菌和粘節(jié)桿菌的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶)的基因被以使酶獲得對底物的改變的特異性或新的特異性的方式突變。本發(fā)明所說明的底物特異性改變包括青霉素和頭孢菌素衍生物的Vmax和Vm的增加和減少的所有的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，這包括其它動力學(xué)參數(shù)的變化。此外，對其它底物的特異性也因此被改變。所提出的改變底物特異性的規(guī)則并不限于所提到的底物，它們可以用于其它底物，這些底物是氨基酸，氨基烷基膦酸，伯和仲醇，cefamicines，諾卡殺菌素，monobactams，核酸，碳水化物，肽類的苯乙?；虮窖跻阴Ｑ苌铩Ｇ嗝顾谿?；D(zhuǎn)移酶從一個肽鏈到活性二聚體的成熟機制也是本發(fā)明的隱含的另一方面，其說明取代青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中活性位點的殘基不影響?；D(zhuǎn)移酶的成熟是可能的。本發(fā)明提供了使IIa型青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶獲得新的特異性的方法。為引入點突變，采用了一種合理的方法，其依賴于蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)，分子模擬和計算方法，酶學(xué)以及動力學(xué)，分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。在青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶中的定向突變的鑒別策略是全新的，其意義是認(rèn)識到點突變可以同時影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的幾種不同性質(zhì)。特別是一些點突變可以阻止適當(dāng)折疊或正確加工，導(dǎo)致產(chǎn)生失活酶。因此，所描述的策略充分利用所建立的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，它們也提供一種合理的方法避免或更正不需要的二級性質(zhì)的改變。按照本發(fā)明，被取代的氨基酸位置已被鑒別為在糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶分子的可用的753位置，這些突變影響所述酶的特定性質(zhì)。就酶的酶促性質(zhì)而言，A139至A152，B1，B2，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480被鑒別為重要的位置。就底物的特異性而言，已鑒別了各種重要的特定的殘基，這些殘基包括A蛋氨酸143，A精氨酸146，A苯丙氨酸147，A蘇氨酸150，B脯氨酸22，B苯丙氨酸24，B甘氨酸25，B酪氨酸27，B酪氨酸31，B蘇氨酸32，B脯氨酸49，B酪氨酸52，B亮氨酸56，B苯丙氨酸57，8甘氨酸66，B丙氨酸67，B蘇氨酸68，B丙氨酸69，B甘氨酸70，B脯氨酸71，B色氨酸154，B纈氨酸157，B蛋氨酸173，B異亮氨酸175，B絲氨酸176，B異亮氨酸177，B色氨酸179，B天冬酰胺239，B色氨酸240，B蘇氨酸251，B蘇氨酸253，B酪氨酸254，B酪氨酸255，B色氨酸256，B精氨酸261，B蛋氨酸262，B天冬酰胺379，B脯氨酸380，B甘氨酸381，B絲氨酸382，B異亮氨酸383，B；天冬酰胺384，B賴氨酸390，B苯丙氨酸455，B蘇氨酸477，B谷氨酸478.。這些位置(包括已被突變的那些)的鑒別基于糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的3D模型(參見圖4a和4b)。改變所需性質(zhì)的殘基的選擇方法，所需性質(zhì)是改變的催化性質(zhì)，改變的特異性，改進的轉(zhuǎn)移酶活性為了改變酶的動力性質(zhì)的完成定點誘變的決定性的第一步是獲得與興趣β-內(nèi)酰胺化合物復(fù)合的目標(biāo)青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的3D結(jié)構(gòu)模型。這可由兩種方法完成，即經(jīng)直接實驗方法，以及經(jīng)利用分子模擬的間接方法。直接方法經(jīng)X光衍射確定在與興趣β-內(nèi)酰胺化合物的復(fù)合物中的目標(biāo)青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的3D結(jié)構(gòu)模型。然而，當(dāng)特殊β-內(nèi)酰胺化合物是特殊的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的底物時，在結(jié)構(gòu)測定實驗的時間過程中它將轉(zhuǎn)化成為反應(yīng)產(chǎn)物。在這種情況下cryo-結(jié)晶學(xué)中或十分快速的數(shù)據(jù)-收集技術(shù)可以利用。利用常規(guī)技術(shù)底物的結(jié)合片段可以揭示結(jié)合位點?？梢砸允沟孜镏幸浊袛嗟逆I不能被酶裂解的方式修飾替換性底物(例如，磷酰胺或膦酸酯鍵替代肽中的肽鍵，D.E.Tronrud等，科學(xué)235(1987)571-574)。然而，完善的方法是替換一個或多個催化殘基，形成不能轉(zhuǎn)化底物但是仍然能結(jié)合底物的的失活酶。例如，在青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中，β-亞單位N-末端絲氨酸可以突變成半胱氨酸。當(dāng)通過實驗獲得與所需的β-內(nèi)酰胺衍生物復(fù)合的目標(biāo)?；D(zhuǎn)移酶的3D結(jié)構(gòu)是不可能的時，可以使用常規(guī)計算機模擬技術(shù)?；瘜W(xué)修飾研究和定點誘變揭示β-亞單位的N-末端絲氨酸對酶促活性是關(guān)鍵的。令人驚奇地是，糞產(chǎn)堿菌青霉酸G?；D(zhuǎn)移酶模型中易接近的殘基的計算揭示出一個深的疏水腔，其接近β-亞單位N-末端絲氨酸，完善地調(diào)節(jié)青霉素G苯乙酰側(cè)鏈，而將β-亞單位N-末端絲氨酸置入一個供親核試劑在PenG的肽羰基進攻的理想的位置。在下一步驟中，置入β-內(nèi)酰胺部分而保持苯乙?；鶊F固定在其結(jié)合區(qū)。盡可能地避免底物和酶之間的原子重疊，此時正相互作用最大。由結(jié)合產(chǎn)生的正相互作用是氫鍵合，靜電相互作用，和有利的VanderWaals接觸。通過計算被酶底物掩蓋的可接近的非極性表面可以估計疏水相互作用的貢獻。除了底物的手工操作外，計算技術(shù)可以用來優(yōu)化底物-酶復(fù)合物。分子力學(xué)技術(shù)(如能量最小化作用和分子動力學(xué))十分有用?？梢允褂糜糜诘鞍踪|(zhì)的forcefields，如CVFF，AMBER，CHROMOS。最后模型用來考察PenG分子的環(huán)境。這一考察提供了在與PenG分子相互作用的的殘基中的至關(guān)緊要的考察結(jié)果(參見實施例1)。此外，它提供了殘基與底物哪一部分相互作用的考察結(jié)果。這一信息給分子生物學(xué)工作者提供了可用來調(diào)節(jié)青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的催化性質(zhì)的有限的一組殘基而不是完整的?；D(zhuǎn)移酶(753殘基)。這樣定點誘變的本領(lǐng)域技術(shù)人員只需把注意力集中在僅僅有限數(shù)量的殘基上，取代這些殘基，并且選擇所需改變的催化性質(zhì)。一般來說，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合到游離酶上時，產(chǎn)生酶中和底物中的某些張力(strain)。這種張力可以通過使原子相互變換位置的分子力學(xué)計算揭示。酶-底物復(fù)合物與游離酶的比較將指示出哪一個殘基被與底物結(jié)合影響最多。在這一方面重要的參數(shù)是相對于游離酶的殘基的RMS移動，相對于游離酶的殘基周圍的靜電環(huán)境的改變，氫鍵形成或殘基自由能的改變?？梢杂贸绦駾ELPKI(BiosymTechnologies)計算靜電勢能。受底物結(jié)合影響的殘基反過來影響底物的結(jié)合，考慮到在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氨基酸的取代的限制作用，這些殘基的取代是本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。應(yīng)該避免的取代是預(yù)料影響典型的結(jié)構(gòu)排列的那些取代，如鹽橋，單環(huán)(helices)包裝(packing)，在螺旋起始處保持陰性電荷的單環(huán)的穩(wěn)定作用，單環(huán)起始，例如，在螺旋起始處的脯氨酸，將插入的殘基的允許的區(qū)之外的Phi-psi角度。所提出的改變對某些底物的活性的規(guī)則并不限于PenG，它們也可以用于其它底物。例如，可以用于頭孢菌素分子而不是PenG，如CefG，其具有與PenG相同的苯乙酰側(cè)鏈。在這種情況下，可以重復(fù)以上所述的全模擬方法。然而，我們較喜歡在計算機中替代PenG分子的6-APA部分，其與7-ADCA部分的青霉素?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合，接著由分子力學(xué)推敲分子。青霉素G-?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與CefG-?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合物的比較將給出被底物修飾影響的殘基。被PenG修飾影響的殘基反過來調(diào)節(jié)修飾底物的結(jié)合。就PenG而言，為了改變這種修飾底物的動力學(xué)性質(zhì)，這樣的殘基取代是優(yōu)選的實施方案。對某些底物的修飾，對β-亞單位N-末端絲氨酸親核試劑而言，解除由修飾產(chǎn)生的張力而不影響易斷裂的肽鍵的位置被證明是不可能的。在這種情況下，從β-亞單位N-末端絲氨酸親核試劑到易斷裂的肽鍵的距離在能量最小化和分子動力學(xué)中被限制在2到3范圍內(nèi)。此外，完成了酰基轉(zhuǎn)移酶計算的誘變，以降低與底物的不需要的相互作用并增加有益的相互作用(相關(guān)的相互作用以上已描述過)。然而，當(dāng)修飾的底物的結(jié)合是不需要的并且應(yīng)被阻止時，經(jīng)定點突變甚至可以在這一位置上增加不需要的相互作用。這種方法確立有限數(shù)量的以所需方向改變動力學(xué)性質(zhì)的突變。其后，可以實施這些有限數(shù)量的突變，并試驗所需的性質(zhì)。所需的修飾意指PcnG側(cè)鏈苯環(huán)被五-或六-元碳環(huán)(例如，環(huán)己二烯基，環(huán)己烯基，環(huán)己基)取代，可被可不被包含1-4個雜原子(N，O或S)的五元雜環(huán)(例如噻吩基，呋喃基)取代，或可被可不被脂肪側(cè)鏈(例如，丙基，丁基，戊基，己基)取代。側(cè)鏈可以具有一個或多個取代基，所述啟動子包括但不限于羥基，鹵原子，烷基，烷氧基，羧基，硝基，氨基等。此外，苯乙酰側(cè)鏈也可以在α位被取代形成D-或L-立體異構(gòu)體，取代基可以包括但不限于羥基，鹵原子，烷基，烷氧基，羧基，硝基，氨基等。選擇影響?；D(zhuǎn)移酶立體異構(gòu)體選擇性的殘基是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。所需側(cè)鏈的例子是例如2-噻吩乙酰基，α-羥基苯乙?；琾-羥苯乙?；?，p-羥苯甘氨?；?，苯甘氨?；?，琥珀?；於；?，己二?；?，α-氨基己二?；取３诵揎棪?內(nèi)酰胺側(cè)鏈以外，β-內(nèi)酰胺部分本身也可以被修飾。如以上例證說明的，6-APA部分可以被7-ADCA替代，也可以采用7-ACA。此外，可以β-內(nèi)酰胺部分可以在一個或多個位置上取代。具體的說，頭孢菌素可以在硫原子，3位和4位上具有取代基。例如3位可以由鹵原子，甲氧基，甲基或亞甲基取代，所述亞甲基經(jīng)橋原子O，N，或S連接到有機部分或五-或六元(雜)環(huán)基團上，所述(雜)環(huán)基團可以是取代的。在4位，羧酸取代基可以被各種羧基保護基修飾。而且，給出的方法也使得可以分析可以轉(zhuǎn)化β-內(nèi)酰胺部分(如carbapenems，nacarcidines，monobactams或它們的衍生物)的酰基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)需要。為了生物轉(zhuǎn)化的目的，可以調(diào)節(jié)?；D(zhuǎn)移酶與所需側(cè)鏈的反應(yīng)性衍生物的相互作用。這些側(cè)鏈衍生物的有用的例子是烷基酯，酰胺和酰化的氨基酸。本發(fā)明的方法可以用來選擇II-型青霉素C?；D(zhuǎn)移酶中的那些位置，為了影響青霉素/頭孢菌素和它們的衍生物的相互作用產(chǎn)生具有改變的性質(zhì)的酶，在所述位置上的氨基酸是應(yīng)被取代的。位置定點誘變將提供有限數(shù)量的易于試驗對所需底物的改善的轉(zhuǎn)化的變體。這與隨機方法相反，后者形成大量的突變體，處理非常困難。材料和方法誘變?yōu)榱藰?gòu)建突變酰基轉(zhuǎn)移酶基因，基本上按Ho等(77(1989)51-59)的描述使用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)。突變的寡核苷酸用于與側(cè)翼寡核苷酸組合以產(chǎn)生具有所需突變的DNA擴增產(chǎn)物。將這一突變DNA片段與野生型基因的相應(yīng)的限制片段交換，例如pMcAF。突變寡核苷酸已設(shè)計來引入單一或多重突變。借助質(zhì)粒pMa/c系統(tǒng)，也可以按Stanssens(Stanssen等，核酸研究17(1989)4441-4454)的描述進行克隆DNA片段的定點誘變。構(gòu)建?；D(zhuǎn)移酶的合適的帶缺口的雙鏈體分子。用特定的錯配寡核苷酸，引入了定點誘變。在大腸桿菌中從同源表達信號或從大腸桿菌lac，tac或trp啟動子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國80(1983)21-25)獲得酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達。按EP-453048的描述進行缺口DNA的“穿刺(spiked)”寡核苷酸誘變和隨機誘變。PCR重疊延伸和帶缺口的雙鏈體兩者都與另一種類型的誘變結(jié)合定向隨機誘變(TRM)。它包括在寡核苷酸合成期間，包含在特定氨基酸的密碼子上的兩個或多個堿基。為此，可以合成能夠產(chǎn)生所有其它可能的選擇的密碼子的氨基酸的突變寡核苷酸。以這種方式可以突變單個氨基酸位置或幾個位置的組合。選擇培養(yǎng)基按Garcia(Garcia等，生物技術(shù)雜志3(1986)187-195)描述的方法制備苯乙酰L-亮氨酸選擇培養(yǎng)基(“fal”)?；酒桨迦缦翸63基本瓊脂，2g/l葡萄糖，1mg/l硫胺素，10mg/lL-脯氨酸和合適的抗生素(50μg/ml氯霉素(cap)或25μg/ml氨芐青霉素(amp))。為了選擇?；D(zhuǎn)移酶的側(cè)鏈特異性選擇(例如苯乙酰基，苯氧乙?；礁拾滨；琾-羥苯甘氨?；?，己二?；?，α-氨基己二?；?，將100μg/ml相應(yīng)的酰基L-亮氨酸添加進基本平板中。唯一的在?；鵏-亮氨酸存在下生長的大腸桿菌HB101(Leu-)的突變體和轉(zhuǎn)化體被認(rèn)為攜帶具有所需特異性的酰基轉(zhuǎn)移酶基因。除了亮氨酸外，選擇的底物的氨基酸部分也可以變化。在這種情況下，大腸桿菌的合適的營養(yǎng)缺陷突變體可以用于選擇。例如用大腸桿菌菌株P(guān)C2051(從Phabagen，Utrecht，荷蘭，獲得)作為宿主進行底物N-己二酰-L-亮氨酸上的選擇。所述的特定的篩選底物從LGSS，TransterbureauNijmegen，theNetherlands購得。將苯乙酰胺以終濃度15mM添加到基本M63培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補充有作為碳源的0.2％琥珀酸乙酯，甘油或葡萄糖，以及硫胺素(1μg/ml)，L-脯氨酸(10μg/ml)和合適的抗生素。所有基本培養(yǎng)基中的鹽都由包含鈉離子或鉀離子的相應(yīng)的鹽代替，以保證在酰胺上的選擇生長。具有所需側(cè)鏈的酰胺從化學(xué)品供應(yīng)商購得或按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。大腸桿菌菌株JM101，WK6，HB101，PC2051以及PC1243用作選擇具有對選擇的酰胺的特異性的突變基因的宿主。分離和純化野生型和突變?；D(zhuǎn)移酶經(jīng)離心收獲細胞，并重懸于包含140mMNaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中。經(jīng)超聲處理(6×20秒，100W，100毫米池，Labsonic1510；每隔20秒將細胞在冰上冷卻30秒)裂解細胞。接著離心懸液。用重懸的離心沉淀重復(fù)超聲處理過程，最后經(jīng)離心除去細胞碎片。經(jīng)超濾，用milli-Q水充分洗滌上清液，接著用Q-瓊脂糖凝膠的起始緩沖液洗滌20mMNaH2PO4H2OpH值7.0+迭氮化物。具有Verder泵的過濾器系統(tǒng)由Filtron供給。切下的過濾物是5Kda。超濾后用milli-Q稀釋樣品，直到導(dǎo)電率少于或等于開始的緩沖液。樣品上樣到Q-瓊脂糖凝膠柱上，所述柱用20mMNaH2PO4H2OpH值7.0+0.02％迭氮化物(導(dǎo)電率＝2.60mS)平衡，以20ml/min的流速洗脫，在用開始緩沖液充分洗滌后，開始梯度(50分鐘至100％20mMNaH2PO4H2O+0.5MNaClpH7.0+0.02％迭氮化物)洗脫。在280nm下檢測。在下一步中，將酰基轉(zhuǎn)移酶進一步在由10mMNaH2PO4H2O+10μMCaCl2+0.02％迭氮化物(pH6.8)平衡過的Hydroxylapetit(HA-ultragelIBF)上純化。以4ml/min的流速洗脫。用平衡緩沖液洗脫?；D(zhuǎn)移酶。用350mMNaH2PO4H2O+10μMCaCl2+0.02％迭氮化物(pH6.8)再生柱。在需要非常純的蛋白質(zhì)時，用更長的柱子重復(fù)第一柱步驟(Q-瓊脂糖凝膠)。蛋白質(zhì)濃度采用BSA標(biāo)準(zhǔn)用Bradford方法測定分離和純化期間的總蛋白質(zhì)含量。可以從280nm的摩爾消光系數(shù)計算純化的糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)濃度。用氨基酸組合計算摩爾消光系數(shù)。所計算的摩爾消光系數(shù)是161210M-1cm-1，其相應(yīng)于在1cm池中1毫克/毫升的1.87的光密度。野生型酶的催化中心的濃度用以不同的濃度溶解在異丙醇中的苯甲磺?；?PMSF)滴定青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶測定。此外，最終酰基轉(zhuǎn)移酶樣品的?；D(zhuǎn)移酶含量由分析型反向色譜法測定。柱RP3007micron20×2.1mm，注射體積5μl。梯度(用100％A(水)開始，45分鐘變成80％B(70％乙腈水溶液))洗脫蛋白質(zhì)。?；D(zhuǎn)移酶以相應(yīng)于α和β亞單位的兩個峰被洗脫。因為從活性位點滴定率實驗計算的樣品的酰基轉(zhuǎn)移酶含量與從HPLC數(shù)據(jù)計算的?；D(zhuǎn)移酶含量一致，所以用PMSF不能很好滴定的?；D(zhuǎn)移酶突變體用于RP-HPLC以便測定?；D(zhuǎn)移酶含量。用NIPAB作為底物測定青霉素?；D(zhuǎn)移酶活性。酶測定為了測定酶促活性，于室溫下將酰基轉(zhuǎn)移酶與底物一起在緩沖液中溫育。在預(yù)計β-內(nèi)酰胺酶雜質(zhì)存在于酶制劑中時，在測定中添加1.0mMβ-內(nèi)酰胺酶抑制劑6-溴-青霉酸。通過添加過量的PMSF終止反應(yīng)。對于對PMSF抑制不太敏感的一些突變體，提高添加0.5MHCl或0.5M醋酸直到pH值在3和4之間來終止反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)物接著用HPLC分析時，通過用相應(yīng)的洗脫溶劑(參見表1)稀釋終止反應(yīng)。此外，將底物在缺少酶的情況下在測定條件下溫育。如果需要，酶測定可以由非酶促水解校正。用高效液相色譜(HPLC)測定反應(yīng)混合物的組成(表1)。用已知的濃度標(biāo)準(zhǔn)確定濃度。表1用高效液相色譜(HPLC)分析反應(yīng)混合物的組成的方法。通過用右欄所示的合適溶劑稀釋反應(yīng)混合物終止反應(yīng)。檢測在214nm進行。流速1ml/min。SDS＝十二烷基硫酸鈉在低濃度時，經(jīng)用熒光胺滴定測定6-APA，7-ACA或7-ADCA的形成。經(jīng)在用390毫微米激發(fā)后測定在475毫微米的熒光確定濃度。此外用與p-二甲氨基苯甲醛的指示性反應(yīng)測定。接著在415毫微米測定席夫堿的形成(K.Balasingham等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報276(1972)250-256)。在繼續(xù)測定中，青霉素G?；D(zhuǎn)移酶用生色底物NIPAB(6-硝基-3-苯乙酰氨基-苯甲酸)經(jīng)分光光度法測定。通過在Kontron610動力學(xué)分光光度計測定在405毫微米的消光監(jiān)測6-硝基苯甲酸的釋放。為測量最大速率，測定在25℃下進行，采用20mMNaH2PO4H2O(pH7.5)及20mMNIPAB和100微升酶溶液(以合適的稀釋度)。用NIPAB的不同濃度進行起始速率的測定。用輻射計pH-stat也經(jīng)堿滴定研究PenG，PenV，CefG的酶促水解的動力學(xué)。所有實驗都在無緩沖液的介質(zhì)中進行。用超過酶的過量底物進行起始速率測定。催化參數(shù)來自根據(jù)Michaelis-Menten方程式為各種底物濃度作圖的測定的起始速率的最小矩形適配(squaresfitting)。經(jīng)溫育?；被岷兔高M行用于篩選的?；腖-氨基酸的脫酰作用。接著用基于與O-phthaldehyde和巰基-乙醇反應(yīng)的方法標(biāo)記脫?；陌被?，并用反向HPLC定量。在pH-stat或緩沖液中進行合成反應(yīng)。典型的使用的條件是10mMPGA，PH7.0，30℃和30mM6-APA。經(jīng)HPLC定量分析產(chǎn)物。試驗酰基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)條件取決于各種參數(shù)，特別是反應(yīng)試劑，反應(yīng)時間，溫度和酶濃度。優(yōu)選的條件可以容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，一般地，反應(yīng)溫度可以在0℃和40℃之間變化?？梢杂杀景l(fā)明的突變?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的半-合成β-內(nèi)酰胺的例子是阿莫西林，氨芐青霉素，氯氨芐頭孢菌素，頭孢羥氨芐，cefprozil，頭孢力新，以及頭孢拉定。所述的酰化劑可以是D(-)-苯基甘氨酸，D(-)-4-羥基苯基甘氨酸或D(-)-2，5-二氫-苯基甘氨酸的衍生物，如低級烷基(甲基，乙基，正丙基和異丙基)酯或在-CONH2基團上未取代的酰胺。一般地，本發(fā)明的方法的反應(yīng)溫度可以在0℃和35℃之間變化。實施例實施例1探討在青霉素G-?；D(zhuǎn)移酶PenG復(fù)合物中青霉素G的環(huán)境并鑒別影響青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的催化性質(zhì)的殘基位置用Connolly算法計算糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶活性位點的溶劑易接近的表面。探針大小是1.4。利用分子圖表的可接近性輪廓分析揭示出一個深的腔室，其鄰近β-亞單位N-末端絲氨酸，這種絲氨酸由溶劑易接近。計算機輔助分析顯示苯乙酸鹽非常適合在該腔室中。在將苯乙酸鹽置入該腔室后，β-亞單位N-末端絲氨酸便在親核試劑在PenG的肽羰基上進攻的最理想的位置上。在后續(xù)步驟中，β-內(nèi)酰胺部分將被置入，而保持苯基-乙酰基基團固定在其結(jié)合區(qū)中。盡量避免底物和酶之間的原子重疊，而使陽性相互作用最大化。對結(jié)合有貢獻的陽性相互作用是氫鍵合，靜電相互作用和有利的VanderWaals接觸。從被與底物的相互作用掩蓋的易接近的非極性表面估計疏水相互作用。在手工操作后，附加計算技術(shù)用于優(yōu)化底物-酶復(fù)合物。用CVFF力場(forcefield)(BiosymTechnologues)完成復(fù)合物的能量最小化和分子動力學(xué)。在一些分散的步驟中完成最小化。當(dāng)?shù)谝谎苌锏哪芰啃∮?.01kcal/mol時停止最小化。-首先，復(fù)合的PenG底物被最小化而保持?；D(zhuǎn)移酶原子固定，絲氨酸B1OG到PenG易裂開的羰基碳的距離限制在2和3.5之間。不考慮電荷。-然后，使?；D(zhuǎn)移酶的氫原子變化。-其后，使在PenG底物的12內(nèi)具有至少一個原子的側(cè)鏈變化，而保持骨架固定。絲氨酸B1OG到PenG易裂開的羰基碳的距離仍然限制在2和3.5之間。不考慮電荷。-在側(cè)鏈優(yōu)化之后，也使主鏈移動。由于連接主鏈原子，第一移動是受到限制的。約束力逐漸緩和。將由這一方法獲得的起始模型用于分析PenG分子的環(huán)境。圖4a顯示形成PenG底物的苯乙酸鹽部分的結(jié)合位點的殘基。所涉及的鏈區(qū)段包括A139至A152，B1，B2，B20至B25，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B478至B480。表2顯示了在從PenG苯乙酰部分8的范圍內(nèi)具有至少一個原子的殘基。其給出了與青霉素分子的側(cè)鏈部分相互作用的殘基的概況。催化作用必需殘基不應(yīng)被取代，因為取代基導(dǎo)致嚴(yán)重的降低或滅活?；D(zhuǎn)移酶。這些殘基包括B絲氨酸1，B谷氨酰胺23，B天冬酰胺241。糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中為結(jié)合青霉素側(cè)鏈之特別目標(biāo)的殘基是A蛋氨酸143，A苯丙氨酸147，B脯氨酸22，B苯丙氨酸24，B酪氨酸31，B蘇氨酸32，B脯氨酸49，B酪氨酸52，B亮氨酸56，B苯丙氨酸57，B甘氨酸66，B丙氨酸67，B蘇氨酸68，B丙氨酸69，B甘氨酸70，B脯氨酸71，B色氨酸154，B纈氨酸157，B蛋氨酸173，B異亮氨酸175，B絲氨酸176，B異亮氨酸177，B色氨酸179。此外，β-內(nèi)酰胺部分6-APA的環(huán)境被作圖。表3顯示了在從PenG6-APA部分中的原子8的范圍內(nèi)具有至少一個原子的殘基。表4b顯示了形成PenG底物的β-內(nèi)酰胺部分的結(jié)合位點的殘基。所涉及的鏈區(qū)段包括A146至A150，B21至B27，B71，B250至B263，B379至B387，B390，B454至B456，B474至B477。圖4b顯示了集中在β-內(nèi)酰胺部分殘基上的糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶活性位點。糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶中為結(jié)合青霉素β-內(nèi)酰胺部分之特別目標(biāo)的殘基是A精氨酸146，A苯丙氨酸147，A蘇氨酸150，B甘氨酸25，B酪氨酸27，B丙氨酸69，B脯氨酸71，B蘇氨酸251，B蘇氨酸253，B酪氨酸254，B酪氨酸255，B色氨酸256，B精氨酸261，B蛋氨酸262，B天冬酰胺379，B脯氨酸380，B甘氨酸381，B絲氨酸382，B異亮氨酸383，B天冬酰胺384，B蛋氨酸387，B賴氨酸390，B蘇氨酸477，B谷氨酸478。</tables></tables>實施例2?；D(zhuǎn)移酶誘變/表達載體的構(gòu)建使用已描述的質(zhì)粒pMcTANde(EP-453048)作為構(gòu)建組合誘變/表達載體的起始材料。這一載體從pMcTNde和pAF1構(gòu)建，包含完全的糞產(chǎn)堿菌青霉素?；D(zhuǎn)移酶基因。為了有利于方便插入雙分子的構(gòu)建，并且有利于交換PCR重疊延伸片段，插入三個新的不改變編碼信息的單一限制位點EcoRV(5239位)，Nsil(5972位)和Clal(6420位)。所形成的載體pMcAF示于圖5中，將其用于構(gòu)建突變的?；D(zhuǎn)移酶基因。突變的?；D(zhuǎn)移酶在大腸桿菌WK6或HB101laqIq中在規(guī)定的啟動子控制下產(chǎn)生。實施例3糞產(chǎn)堿菌?；D(zhuǎn)移酶的誘變用以前描述的PCR重疊延伸方法產(chǎn)生在選擇位置上的氨基酸的突變。表4中示出了各亞單位(A或B)中的氨基酸位置。也示出了用于構(gòu)建的寡核苷酸。需指出的是，在位置A143和B67，B68，B69上，使用具有隨機密碼子的寡核苷酸。實施例4用合適的營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌進行青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶的正確折疊和翻譯后加工的位點定向誘變的試驗在包含選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板上試驗鑒別的突變?；D(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌HB101laqIq細胞。按Garcia(同上)描述的方法制備苯乙酰L-亮氨酸(fal)選擇培養(yǎng)基?；酒桨迦缦翸9基本瓊脂，1mg/l硫胺素，10mg/lL-脯氨酸，0.2mMIPTG和合適的抗生素(50μg/ml氯霉素(cap)或25μg/ml氨芐青霉素(amp))。有關(guān)青霉素?；D(zhuǎn)移酶表達的文獻的可供使用的數(shù)據(jù)表明處理的鏈的適當(dāng)?shù)恼郫B和翻譯后加工是獲得催化上穩(wěn)定的青霉素?；D(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵因素。為了確定突變的青霉素?；D(zhuǎn)移酶是否作為?；幕钚怎；D(zhuǎn)移酶適當(dāng)?shù)乇槐磉_，將200微克/毫升酰基L-亮氨酸包含進基本培養(yǎng)基。唯一的在苯基-酰基-L-亮氨酸存在下生長的大腸桿菌HB101(Leu-)的轉(zhuǎn)化體和突變體被認(rèn)為攜帶活性的合適表達的?；D(zhuǎn)移酶基因。表5顯示了幾種選擇的突變體的結(jié)果。此外，這種方法可以用于初步篩選具有改變的特異性的?；D(zhuǎn)移酶。為了選擇?；孽；D(zhuǎn)移酶的側(cè)鏈特異性，將200微克/毫升所需的酰基L-亮氨酸包括進基本平板。在?；糠植荒鼙灰吧颓嗝顾仵；D(zhuǎn)移酶識別的情況下，唯一的在所需的?；鵏-亮氨酸存在下生長的大腸桿菌HB101(Leu-)的轉(zhuǎn)化體和突變體被認(rèn)為攜帶具有所需特異性的?；D(zhuǎn)移酶基因(例如戊二酰-L-亮氨酸)。這樣的選擇性底物的例子是α-D-氨基己二酰亮氨酸，己二酰-亮氨酸和戊二酰亮氨酸。這些化合物從LGSS(TransferbureauNijmegen，荷蘭)購買。表4用于PCR突變的合成DNA-寡核苷酸(X＝所有可能的氨基酸)(R＝A或者G；Y＝C或者T；S＝C或者G；W＝A或者T；B＝C，G或者T；V＝A，C，G；N＝A，C，G或者T)</tables>當(dāng)野生型具有對?；鶊F的低活性時，可以通過將突變體產(chǎn)生的暈圈的大小與野生型的比較用這一方法挑選出具有增加的活性的突變體。有用的側(cè)鏈?zhǔn)潜窖跻阴；?，p-羥苯基甘氨?；?，苯基甘氨?；１?突變的?；D(zhuǎn)移酶的體內(nèi)特異性。第一欄中A和B指α和β亞單位。++，可與野生型比較的生長率；+，與野生型比較生長率降低；-，在3周期間不生長。</tables>也可以變化選擇底物的氨基酸部分代之以亮氨酸。在這樣的情況下，將合適的營養(yǎng)缺陷型突變體大腸桿菌用于選擇。此外，?；糠值孽０穼x擇也是有用的化合物。將側(cè)鏈酰胺(例如，苯乙酰胺，戊二酰胺，己二酰胺，α-D-氨基己二酰胺)以15mM的終濃度添加到基本M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補加有作為碳源的0.2％琥珀酸、甘油或葡萄糖以及硫胺素(1微克/毫升)，L-脯氨酸(10毫克/毫升)，0.2毫米IPTG和合適的抗生素。所有基本培養(yǎng)基中的銨鹽都由包含鈉離子或鉀離子的相應(yīng)的鹽代替，以保證在酰胺上的選擇生長。具有所需側(cè)鏈的酰胺從化學(xué)品供應(yīng)商購得或按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。大腸桿菌菌株JM101，WK6和HB101用作選擇具有對選擇的酰胺的特異性的突變基因的宿主。實施例5試驗青霉素?；D(zhuǎn)移酶定向隨機突變體在TRM誘變的情況下，在DNA測序前，將突變體樣品平板接種到選擇平板上。僅確定在一種或多種選擇培養(yǎng)基中生長的菌落的特征。表6中顯示了2個TRM誘變實驗的結(jié)果。表6突變的?；D(zhuǎn)移酶的體內(nèi)特異性。第一欄中A和B指α和β亞單位。++，可與野生型比較的生長率；+，與野生型比較生長率降低；-，在3周期間不生長。</tables>實施例6增加的比活和改變的特異性測定糞產(chǎn)堿菌PenG酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對不同底物的催化參數(shù)。突變體改變的特異性在表7和8中以例說明。與野生型比較，突變體AM143V和BL56K顯示出對PenV和CefG的脫酰作用更高的周轉(zhuǎn)速率，當(dāng)用于D-苯基甘氨酰胺脫脫酰胺時，AF147Y與野生型比較活性更強。在高的底物濃度(在許多工業(yè)轉(zhuǎn)化過程中常見的情形)下，?；D(zhuǎn)移酶將被底物完全飽和，結(jié)果是轉(zhuǎn)化以最大速度進行。在圖6中，將一些底物的最大速度對野生型糞產(chǎn)堿菌?；D(zhuǎn)移酶和某些突變體作圖。相對于PenG(其Vmax設(shè)置為1)確定了速率的等級。如同所期待的，野生型PenG?；D(zhuǎn)移酶顯示出對PenG最高的活性。然而取代AM143V把酶轉(zhuǎn)變成為CefG?；D(zhuǎn)移酶，而取代AF147Y把酶轉(zhuǎn)變成為D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)的脫酰胺作用的強的酰胺酶。此外，AF147Y對氨芐青霉素和NIPAB的脫酰作用速度比對PenG的高。在圖7中，用與圖6類似的方式比較突變體BL56G，BL56A，BLS6V，B177V，BI177S，BA67S，BA67G對給定底物的測得的Vmax值和PenG的Vmax值。相對野生型而言，特異性發(fā)生變化。例如，突變體BI177S顯示出在氨芐青霉素上的減少的脫酰作用速率和在D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)上的提高的活性。一般來說，在兩個競爭性底物之間酶的特異性或者選擇性的區(qū)別通過比較兩個底物的比率Vmax/Km(Kcat/Km)確定。表9中比較了不同底物組合的比率。尤其是AF147Y突變體對(D)PGA的特異性的大量增加是非常顯著的。表9野生型酶與突變體比較對一些底物的選擇性</tables>表7測定的野生型糞產(chǎn)堿菌PenG?；D(zhuǎn)移酶的某些突變體的催化參數(shù)Km和Vmax。試驗條件NIPAB，0.1MNaH2PO4，pH7.5，25℃；PenG和PenV，40mMNaH2PO4，pH7.5，37℃；CefG，20mMNaH2PO4，pH7.5，37℃；阿莫西林，氨芐青霉素和D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)，20mMNaH2PO4，pH7.0，37℃。表8測定的野生型糞產(chǎn)堿菌PenG?；D(zhuǎn)移酶和某些突變體的催化參數(shù)Km和Vmax。試驗條件NIPAB，0.1MNaH2PO4，pH7.5，25℃。突變體BA67S和BA67GVmax以U/ml表示。實施例7PenG?；D(zhuǎn)移酶提高的特異性野生型糞產(chǎn)堿菌和大腸桿菌PenG酰基轉(zhuǎn)移酶顯示出對具有α-碳取代的側(cè)鏈的青霉素的D-對映異構(gòu)體的活性。例子是氨芐青霉素，頭孢氨芐，阿莫西林，羥氨芐頭孢菌素及氯氨芐頭孢菌素。為了獲得在轉(zhuǎn)化具有手性化合物的外消旋混合物時表現(xiàn)出提高的對映異構(gòu)體過量的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，青霉素G?；D(zhuǎn)移酶提高的立體特異性是所需的。這種性質(zhì)使得青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在從α-碳取代的苯乙酰側(cè)鏈的外消旋混合物或激活的α-碳取代的苯基-乙?；鶄?cè)鏈的衍生物(例如，苯基甘氨酸-酰胺或其酯，P-羥苯基甘氨酸-酰胺或其酯等)合成具有旋光純度的半合成抗生素上特別有用，所說衍生物包含手性α-碳原子，這是因為其存在氨基基團(例如，氨芐青霉素，頭孢氨芐，阿莫西林，羥氨芐頭孢菌素，氯氨芐頭孢菌素)或羥基基團(頭孢羥芐唑)。表10示出了對苯基甘氨酰胺而言，野生型PenG?；D(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出對D-對映異構(gòu)體的活性。對D和L苯基甘氨酰胺的外消旋混合物(1∶1)，VD/VL等于(Vmax/Vm)D-PGA/(Vmax/Vm)L-PGA，其中，VD和VL分別代表D和L對映異構(gòu)體的脫酰胺作用的速度，對野生型糞產(chǎn)堿茵，D異構(gòu)體的脫酰胺速度快于L異構(gòu)體的5倍。對突變體AP143Y，以(Vmax/Vm)D-PGA/(Vmax/Vm)L-PGA表示的立體選擇性從5.10增加至36.52。這意味著D異構(gòu)體脫酰胺速度比野生型的快36.52倍，而L異構(gòu)體僅快5.10倍。表10野生型糞產(chǎn)堿菌和大腸桿菌酶與突變體對DL-苯基甘氨酰胺(PGA)的立體選擇性。測定條件，DL-苯基甘氨酰胺20mMNaH2PO4，pH7.0，37℃<tablesid="table13"num="013"><tablewidth="794">(Vmax/Km)D-PGA/(Vmax/Km)L-PGA野生型大腸桿菌野生型糞產(chǎn)堿茵AM143VBL56KAF147Y3.325.105.703.2536.52</table></tables>實施例8降低的產(chǎn)物抑制性隨著在405nm吸收的增加，在20，50和100μMNIPAB時，NIPAB的完成轉(zhuǎn)化是時間的函數(shù)。這一轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物是苯乙酸和3-氨基-6-硝基苯甲酸。轉(zhuǎn)化在0.1MNaH2PO4緩沖液(pH7.5)中25℃下進行。當(dāng)考慮苯乙酸的產(chǎn)物抑制作用時，NIPAB的脫酰作用的進程曲線能吻合得很好。表11中示出了可從進程曲線中得出的苯乙酸的分解常數(shù)(通常指抑制常數(shù)Ki)。表12中示出了對產(chǎn)物抑制作用比較不敏感的突變體的帶來的益處。用突變體獲得的產(chǎn)量在一定的時間期限內(nèi)比用野生型的要高。此外，為了獲得一定的產(chǎn)率，要求突變體具有短的轉(zhuǎn)化時間。權(quán)利要求1.一種具有下列特征的分離的突變原核生物青霉素G?；D(zhuǎn)移酶或其酶原或前酶原-在相應(yīng)于糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)青霉素G?；D(zhuǎn)移酶或其酶原或前酶原的以下一個或多個位置上具有氨基酸取代A139至A152，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480；和-具有相對于相應(yīng)的野生型未取代的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶來說的改變的底物特異性或者改變的比活。2.按照權(quán)利要求1的突變的?；D(zhuǎn)移酶，其中所說的酰基轉(zhuǎn)移酶來源于糞產(chǎn)堿菌。3.按照權(quán)利要求2的突變的?；D(zhuǎn)移酶，其在以下一個或多個位置上具有氨基酸取代A143，A146，A147，A150，B22，B24，B25，B27，B31，B32，B49，B52，B56，B57，B66，B67，B68，B69，B70，B71，B154，B157，B173，B175，B176，B177，B179，B239，B240，B251，B253，B254，B255，B256，B261，B262，B379，B380，B381，B382，B383，B384，B390，B455，B477或B478。4.按照權(quán)利要求3的突變的?；D(zhuǎn)移酶，其中所說的氨基酸取代是下列一種A143(蛋氨酸)取代成精氨酸，賴氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸，纈氨酸，亮氨酸或任何其它氨基酸；A147(苯丙氨酸)取代成酪氨酸，組氨酸或者色氨酸；B24(苯丙氨酸)取代成精氨酸或賴氨酸；B56(亮氨酸)取代成精氨酸，賴氨酸，組氨酸，甘氨酸，丙氨酸或纈氨酸；B177(異亮氨酸)取代成精氨酸，賴氨酸，組氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，絲氨酸或蘇氨酸；B71(脯氨酸)取代成苯丙氨酸或酪氨酸或B67(丙氨酸)，B68(蘇氨酸)或B69(丙氨酸)取代成任何其它氨基酸。5.一種編碼以上權(quán)利要求之任一中限定的突變的?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列。6.一種包含權(quán)利要求5中限定的核酸序列的表達載體，其可操作連接到能指導(dǎo)其在宿主細胞中表達的啟動子上。7.一種用如權(quán)利要求6中限定的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物。8.按照權(quán)利要求7的微生物，該微生物是頭孢屬或青霉屬的微生物。9.一種制備按照以上權(quán)利要求1-4之任一中限定的分離的突變的?；D(zhuǎn)移酶的方法，該方法包括-培養(yǎng)如權(quán)利要求7或8中限定的微生物，從而產(chǎn)生所說的突變的酰基轉(zhuǎn)移酶；和-分離所說的?；D(zhuǎn)移酶。10.一種用于脫?；?-?；嗝顾?、7-?；?去乙酸基)頭孢菌酸或者它們的鹽或酯，分別形成相應(yīng)的6-氨基青霉或7-氨基(去乙酸基)頭孢菌酸或它們的鹽或酯的方法，該方法包括在適于發(fā)生脫?；臈l件下使所說的6-?；幕蛘?-酰化的化合物與權(quán)利要求1-4任一中限定的突變的?；D(zhuǎn)移酶接觸。11.用于產(chǎn)生半-合成6-酰化青霉酸，7-酰化(去乙酸基)頭孢菌酸或者它們的鹽或酯的方法，該方法包括在適于發(fā)生?；臈l件下分別使相應(yīng)的6-氨基的或者7-氨基β-內(nèi)酰胺或者它們的鹽或酯與具有權(quán)利要求1-4之任一中限定的突變的?；D(zhuǎn)移酶的?；瘎┙佑|。全文摘要本發(fā)明提供了顯示出改變的底物特異性的新的突變β-內(nèi)酰胺青霉素G?；D(zhuǎn)移酶。這些青霉素G?；D(zhuǎn)移酶是由表達編碼所說的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的基因獲得的，它們具有其中至少有一個氨基酸不同于野生型青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。文檔編號C12R1/80GK1158638SQ95195226公開日1997年9月3日申請日期1995年8月14日優(yōu)先權(quán)日1994年8月12日發(fā)明者J·M·宛德蘭,A·M·里門斯,W·J·奎克斯申請人:吉斯特·布里卡迪斯股份有限公司