專利名稱：干細(xì)胞因子和可溶性白介素－6受體在血細(xì)胞生成多能性細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用的制作方法
本申請是1994年11月16日提交的美國專利申請，序列號08/340559的部分繼續(xù)。發(fā)明背景本發(fā)明涉及白介素-6，可溶性白介素-6受體和干細(xì)胞因子在細(xì)胞擴(kuò)增中的組合應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及血細(xì)胞生成祖細(xì)胞/干細(xì)胞體外擴(kuò)增中這些因子的組合應(yīng)用。發(fā)明領(lǐng)域白介素-6(IL-6)的受體系統(tǒng)包括兩個(gè)功能上不同的鏈一個(gè)配體結(jié)合鏈(IL-6R)和一個(gè)非配體結(jié)合但傳導(dǎo)信號的鏈(gp130)。gp130鏈與IL-6R/IL-6復(fù)合物相連，導(dǎo)致高親和性IL-6結(jié)合位點(diǎn)和信號傳導(dǎo)(1-4)的形成。已證明一種細(xì)胞外的，可溶性形式的白介素-6受體(sIL-6R)可通過膜錨定的gp130介導(dǎo)IL-6信號傳導(dǎo)。sIL-6R和IL-6的復(fù)合物(sIL-6R/IL-6)可與在IL-6R陰性和IL-6R陽性細(xì)胞上都表達(dá)的gp130相連。該連接引起gp130的同源二聚體化和JAK-STAT通路的活化從而導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答(4-8)。
已表明IL-6可與IL-3和干細(xì)胞因子(SCF)一起協(xié)同作用增強(qiáng)人血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的擴(kuò)增并支持休眠小鼠血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的集落形成(9-11)。但是對gp130信號通路在人血細(xì)胞生成中的作用卻知之甚少。
最近由于各種臨床應(yīng)用的需要而對血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增極感興趣，這些臨床應(yīng)用包括基因治療，骨髓移植(BMT)的增強(qiáng)作用以及BMT的替換等。盡管還有以前應(yīng)用各種細(xì)胞因子或基底細(xì)胞的組合擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目的報(bào)道，祖細(xì)胞，特別是多能祖細(xì)胞所達(dá)到的擴(kuò)增程度仍是相當(dāng)?shù)偷?。這表明原始細(xì)胞的分化和耗盡發(fā)生在擴(kuò)增培養(yǎng)中(12-15)。最近的研究證明IL-6和sIL-6R的組合通過gp130信號過程的活化而支持多能胚胎干(ES)細(xì)胞的自我更新(16)。
IL-6的純化，克隆和應(yīng)用是已知的(EP220574,1987年5月6日公開；Revel等；WO88/00206,1988年1月14日公開，Clark等.)。對sIL-6R純化和克隆，以及它與IL-6在例如細(xì)菌感染，燒傷和創(chuàng)傷等疾病中的組合應(yīng)用也已有報(bào)道(EP413908,1991年2月27日公開，Novick等；JP 89271865；Yamasaki等，科學(xué)，241:825-828,1988)。SCF是一種早期作用血細(xì)胞生成因子。對SCF的純化，克隆和應(yīng)用已有報(bào)道(參見PCTWO91/05795，題目為“干細(xì)胞因子”)。SCF的應(yīng)用已被描述為可增強(qiáng)骨髓的移植作用和骨髓恢復(fù)以及對白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥的治療。還描述了IL-6與SCF的組合應(yīng)用，但以前未有SCF,IL-6和sIL-6R在血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的擴(kuò)增中的組合應(yīng)用的報(bào)道。
發(fā)明概述本發(fā)明證明了可溶性IL-6受體(sIL-6R)和IL-6與干細(xì)胞因子(SCF)一起的組合可支持人血細(xì)胞生成多能性細(xì)胞的體外擴(kuò)增。當(dāng)單獨(dú)與SCF組合時(shí)，sIL-6R或IL-6二者都不能有這種作用。
多能性細(xì)胞可從臍帶血，外周血或骨髓獲得。多能造血細(xì)胞包括通過CD34篩選得到的祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞或通過去除可增殖的細(xì)胞而功能性選擇的干細(xì)胞。
細(xì)胞因子可以以試劑盒的形式提供，其中試劑盒包括不同細(xì)胞因子的獨(dú)立的容器，或一種或多種細(xì)胞因子可以以裝在單一的容器中的混合物的形式提供。
另外，該細(xì)胞因子的組合可在缺乏促紅細(xì)胞生成素(EPO)時(shí)可支持來自純化的人血細(xì)胞生成干細(xì)胞的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖，分化和終端成熟。當(dāng)與SCF單獨(dú)組合時(shí)，sIL-6R和IL-6二者在缺乏促紅細(xì)胞生成素時(shí)都沒有這種作用。
研究證明sIL-6R,IL-6和SCF組合的方法可從血細(xì)胞生成干細(xì)胞(如CD 34+細(xì)胞)產(chǎn)生紅細(xì)胞樣細(xì)胞。細(xì)胞因子的效應(yīng)在無血清培養(yǎng)中也已得到了確證。sIL-6R,IL-6和SCF的組合在甲基纖維素培養(yǎng)中從CD34+細(xì)胞形成了含大量成熟紅細(xì)胞樣細(xì)胞的一定數(shù)目的紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇和紅細(xì)胞樣集落。向培養(yǎng)物中加入抗gp130單克隆抗體完全阻止了紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，其中加入抗促紅細(xì)胞生成素抗體不能影響從CD34+細(xì)胞產(chǎn)生紅細(xì)胞樣細(xì)胞。
該結(jié)果證明在缺乏促紅細(xì)胞生成素時(shí)，可從血細(xì)胞生成祖細(xì)胞產(chǎn)生成熟的紅細(xì)胞樣細(xì)胞。綜合前述的人血清含可檢測水平的sIL-6R,IL-6和SCF的報(bào)道(26-28)，很可能正常紅細(xì)胞生成在生理上是由兩個(gè)不同的通路調(diào)控的一種為促紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的信號通路和一種新的SCF信號通路結(jié)合gp130的機(jī)制。
附圖簡述

圖1示在指定的因子組合下培養(yǎng)的多能性細(xì)胞集落形成的結(jié)果。
圖2示IL-6存在(○)或不存在(●)下不同sIL-6R濃度下祖細(xì)胞的擴(kuò)增，以及在sIL-6R的存在(○)或不存在時(shí)(●)不同IL-6濃度下祖細(xì)胞的擴(kuò)增。
圖3示在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實(shí)心棒)補(bǔ)加鑒定的因子或因子組合的祖先細(xì)胞的擴(kuò)增。
圖4示在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實(shí)心棒)時(shí)在SCF的存在下補(bǔ)加有各種因子組合時(shí)含血清和無血清培養(yǎng)物中祖細(xì)胞的擴(kuò)增。
圖5示不同濃度的抗人gp130單克隆抗體(A)和抗人IL-6R單克隆抗體(B)對總的祖細(xì)胞(○)和CFU-Mix(●)擴(kuò)增的影響。
圖6示在IL-6和SCF存在下不同量的sIL-6R的作用。
圖7示在sIL-6R和SCF存在時(shí)不同量的IL-6的作用。
圖8示SCF，IL-6/SCF和sIL-6R/IL-6/SCF在無血清和有血清培養(yǎng)中的作用。
圖9示產(chǎn)生的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的特征。
圖10示在第7,14和21天培養(yǎng)時(shí)由不同的因子組合產(chǎn)生的總細(xì)胞數(shù)，成紅細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)。IL-3是白介素-3,G-CSF是粒細(xì)胞集落刺激因子，和GM-CSF是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
圖11示抗gp130MAbs(μg/ml)對加入了sIL-6R/IL-6/SCF或EPO/SCF組合的懸浮培養(yǎng)物的作用。
圖13示抗EPO抗體(μg/ml)對加入EPO,EPO/SCF或sIL-6R/IL-6/SCF組合的懸浮培養(yǎng)物的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明來自對gp130信號通路的潛在作用的觀察結(jié)果，該通路可在人血細(xì)胞生成干/祖細(xì)胞中啟動(dòng)sIL-6R和IL-6的復(fù)合物的活性。本文的結(jié)果表明包含sIL-6R和IL-6的gp130信號通路，可在SCF的存在下，極大的刺激人原始血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
gp130,IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體組分，與IL-6配體和IL-6受體(IL-6R)和復(fù)合物組合并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。為了檢測gp130信號通路在血細(xì)胞生成祖細(xì)胞擴(kuò)增中的作用，而測定了重組可溶性人IL-6受體(sIL-6R)和/或IL-6與各種細(xì)胞因子的組合對CD 34+細(xì)胞的作用。
發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞因子(SCF)的存在下，sIL-6R和IL-6的組合(sIL-6R/IL-6)極大地刺激了血細(xì)胞生成祖細(xì)胞/干細(xì)胞以及CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增。sIL-6R和SCF的組合或IL-6和SCF的組合二者都沒有這種結(jié)果。在加入sIL-6R/IL-6/SCF之后懸浮培養(yǎng)發(fā)生了明顯的多能血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的產(chǎn)生達(dá)三周之久。在添加了組合的細(xì)胞因子的含血清和無血清培養(yǎng)中都觀察到了有效的集落的形成，特別是多系(multilineage)和未成熟(blast)細(xì)胞的形成。最初的血細(xì)胞生成祖/干細(xì)胞可從任何適應(yīng)的細(xì)胞來源獲得，其中包括胎兒，胎盤，臍帶血，外周血或骨髓。這些多能血細(xì)胞生成細(xì)胞包括通過CD34+篩選得到的祖和/或干細(xì)胞?？扇芜x地，多能血細(xì)胞生成細(xì)胞可以是通過去除可增殖的細(xì)胞而功能性選擇或分離的細(xì)胞(Berardi等.,科學(xué)，267:104-108,1995)。
本發(fā)明證明兩種信號通路，分別由sIL-6R/IL-6和SCF啟始的gp130信號通路和c-Kit信號通路協(xié)同增強(qiáng)人血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增。已有報(bào)道sIL-6R在IL-6的存在下在一些例如BAF-ml30細(xì)胞，gp130cDNA-轉(zhuǎn)染細(xì)胞和小鼠破骨細(xì)胞中加強(qiáng)激動(dòng)劑效果(6-8,25)。但是本發(fā)現(xiàn)證明在SCF的存在下sIL-6R/IL-6對人原始血細(xì)胞生成祖細(xì)胞是有效的刺激劑。以前的對體外擴(kuò)增的報(bào)道沒能證明sIL-6R/IL-6/SCF組合對人原始血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的刺激的激動(dòng)人心的協(xié)同效應(yīng)。
血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增對于制備適于包括基因治療和細(xì)胞替換的潛在的臨床應(yīng)用的血細(xì)胞生成細(xì)胞來說是一個(gè)有吸引力的方法。已有報(bào)道各種細(xì)胞因子的組合可用于祖細(xì)胞的擴(kuò)增(12-15)。一般是將SCF,IL-3和IL-6做為對原始血細(xì)胞生成細(xì)胞具有最大作用的細(xì)胞因子的，并且已將這些因子的組合廣泛地用做血細(xì)胞生成祖細(xì)胞擴(kuò)增的基本的和有效地細(xì)胞因子序列。但是本發(fā)明證明，對原始祖細(xì)胞包括CFU-Mix或CFU-Blast的擴(kuò)增速率來說，sIL-6R,IL-6和SCF的組合(sIL-6R/IL-6/SCF)是優(yōu)良的(Superior)。
已前的研究是在IL-3,IL-6和SCF與其它一些細(xì)胞因子如G-CSF,GM-CSF,IL-1或EPO組合的存在為基礎(chǔ)，培養(yǎng)來自外周血的CD34+細(xì)胞。這類研究表明該組合可用于在含血清的懸浮培養(yǎng)物中產(chǎn)生祖細(xì)胞(12,13)。盡管以前的與IL-3的組合使CFU-GM大約增加了60倍，但是CFU-Mix沒有擴(kuò)增且在培養(yǎng)的第14天時(shí)，CFU-Mix或BFU-E都未檢測到。這樣的發(fā)現(xiàn)表明在這些培養(yǎng)中相對晚期的祖細(xì)胞優(yōu)先擴(kuò)增。相反地，應(yīng)用本發(fā)明，可在懸浮培養(yǎng)中對多能血細(xì)胞生成祖細(xì)胞進(jìn)行有效擴(kuò)增以及在甲基纖維素培養(yǎng)中大量形成Mix和Blast集落，這表明sIL-6R/IL-6刺激了較早期的原始血細(xì)胞生成細(xì)胞或甚至是多能干細(xì)胞。
向上面的培養(yǎng)物中加入抗gp130單克隆抗體(mAb)或抗IL-6RmAb發(fā)現(xiàn)可劑量依賴性抑制懸浮培養(yǎng)中祖細(xì)胞的擴(kuò)增?？贵w還完全阻斷了甲基纖維素培養(yǎng)中多系集落的形成。該發(fā)現(xiàn)清楚地證明了所觀察到的sIL-6R/IL-6的效應(yīng)是通過IL-6結(jié)合的sIL-6R分子與靶細(xì)胞上膜錨定的gp130的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。
最近的研究表明gp130在細(xì)胞上廣泛表達(dá)，并且ES細(xì)胞通過sIL-6R/IL-6復(fù)合物不需要LIF即可維持自我更新(6,16,18)。但形成是不完整的，因?yàn)榧?xì)胞因子受體通常在人CD34+血細(xì)胞生成干/祖細(xì)胞上表達(dá)。當(dāng)然，SCF地c-Kit受體是存在的，在我們的研究之中，通過免疫染色發(fā)現(xiàn)gp130出現(xiàn)在所有的CD34+細(xì)胞上，而IL-6R只存在于一小部分CD34+細(xì)胞群體上。在IL-6R陽性細(xì)胞中sIL-6R/IL-6復(fù)合物可增強(qiáng)IL-6信號并且，更重要的是，可通過gp130在通常對IL-6不應(yīng)答的IL-6R陰性細(xì)胞中介導(dǎo)信號。如本研究所揭示的，由于sIL-6R/IL-6只有在SCF的存在下才起作用，gp130和c-Kit在祖細(xì)胞上的共表達(dá)和對這些信號的共活化導(dǎo)致有潛在臨床應(yīng)用的血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的大量增殖。
實(shí)施例實(shí)施例1sIL-6R,IL-6和SCF對甲基纖維素培養(yǎng)中CD34+細(xì)胞的集落形成的影響。材料方法細(xì)胞制備人臍帶血是在正常的，成熟分娩(full-term)中獲得的并根據(jù)常規(guī)程序收集。在用Silica((IBL,Fujioka,Japan)去除巨噬細(xì)胞通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離單核細(xì)胞(MNC)。用攜帶抗CD34抗體的磁性珠(DynabeadsM-450CD34；Dynal,Oslo,Norway)與CD34+細(xì)胞結(jié)合從MNC中純化CD34+細(xì)胞，用Dynal Magnetic Particle Concentrator從MNC中分離細(xì)胞，以及用DETACHa Bead CD34(Dynal)從珠子中分離所選擇的細(xì)胞。根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行篩選和分離操作。FACS分析確認(rèn)所分離細(xì)胞的85～95％是CD 34陽性的(Ortho Diagnostics Systems,Westwood,MA)。
受體和細(xì)胞因子。
如前所述，重組人IL-6和sIL-6R的克隆，表達(dá)和純化已被很好的特征描述(17,18)。人SCF(Amgen；Thousand Oaks,CA)，人IL-3，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)(Kirin Brewery Co.Ltd.；Tokyo,Japan)，和人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(Chugai Pharmaceutical Co.；Tokyo,Japan)被用于評價(jià)各種細(xì)胞因子組合對細(xì)胞的作用。所有的細(xì)胞因子都是純的重組分子并使用其可在人血細(xì)胞生成細(xì)胞的甲基纖維素培養(yǎng)中的最優(yōu)應(yīng)答的濃度。其濃度是SCF 100ng/ml,IL-3200U/ml,EPO 2U/ml，和G-CSF和GM-CSF 10ng/ml。
懸浮培養(yǎng)應(yīng)用已知技術(shù)將純化的CD34+細(xì)胞培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)物中(21,22)。培養(yǎng)混合物包含2000CD34+細(xì)胞，α-培養(yǎng)基(ICN FlowiICN BIOMEDICALS,Inc.,Costa Mesa,CA)，20％胎牛血清(FBS；Hy Clone,UT)，1％結(jié)晶的和去離子化的級分V牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和不同的細(xì)胞因子的組合。在37℃在充滿5％CO2,5％O2和90％N2的飽和濕度的空氣中將1ml培養(yǎng)混合物培養(yǎng)在24孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中(Nunc,Kamstrup,Denmark)。無血清懸浮培養(yǎng)物由2％純化BSA(Sigma),10μg/ml胰島素，200μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma),10-5M巰基乙醇(Eastman)和40μg/ml低密度脂蛋白(Sigma)代替了FBS和BSA(22)。
每隔一周，去掉一半培養(yǎng)體積減少培養(yǎng)物，然后用重新配制的含同樣的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基替代。洗滌并計(jì)數(shù)所收集的培養(yǎng)基中的細(xì)胞(12-15)。通過在克隆甲基纖維素測試中進(jìn)一步培養(yǎng)一部分?jǐn)U增細(xì)胞而對在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上培養(yǎng)物中產(chǎn)生的血細(xì)胞生成祖細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行了評測。對實(shí)施例3的阻斷研究，在培養(yǎng)的最開始時(shí)加入了抗gp130mAb或抗IL-6RmAb。
克隆培養(yǎng)將在懸浮培養(yǎng)中的接種的CD34+細(xì)胞和其后代以對CD34+細(xì)胞500細(xì)胞/ml和對培養(yǎng)的細(xì)胞2×103～10×103細(xì)胞/ml的濃度在甲基纖維素培養(yǎng)中平行培養(yǎng)三份(23)。培養(yǎng)混合物含細(xì)胞，α-培養(yǎng)基，0.9％甲基纖維素(Shinetsu.Chemical.CO.,Tokyo,Japan)，30％FBS,1％BSA,5×105M硫基乙醇和各含或不含sIL-6R的細(xì)胞因子組合。將1ml含細(xì)胞的培養(yǎng)混合物接種在每個(gè)35mm Lux標(biāo)準(zhǔn)的非組織培養(yǎng)皿中并在充有5％CO2的飽和濕度的空氣中在37℃下培養(yǎng)。除了用1％純BSA,300μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白，160μg/ml刀豆卵磷脂(Sigma)和96μg/ml膽固醇(NacalaiTesque Inc.,Kyoto,Japan)代替BSA和FBS之外，無血清甲基纖維素培養(yǎng)物含與管血清的培養(yǎng)相同樣的成份(11)。
SCF,IL-3,IL-6,EPO和G-CSF的組合被用于確定在懸浮培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)生的各種祖細(xì)胞。根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)，所有培養(yǎng)都平行進(jìn)行三份并在第14天時(shí)收獲(10,11,23)。
結(jié)果圖Ⅰ示在所示因子組合存在下，來自培養(yǎng)的多能性細(xì)胞的結(jié)果。在第14天獲取集落。集落數(shù)是三次平行培養(yǎng)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。(用于克隆類型的縮寫如下GM，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落；Meg，巨核細(xì)胞集落；B，紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇；Blast，未成熟細(xì)胞集落；Mix，混合血細(xì)胞生成集落；和GEMM，粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落)。將每種細(xì)胞因子與1280ng/mlSIL-6R,50ng/mlIL-6和/或100ng/mlSCF組合使用。
在含血清的培養(yǎng)中，sIL-6R,IL-6,sIL-6R/IL6或SCF單用僅誘導(dǎo)小數(shù)目的集落。與IL-6或SCF單獨(dú)添加相比，IL-6和SCF的組合增強(qiáng)GM和Blast集落的形成。在所觀察到的添加sIL-6R,IL-6和SCF的培養(yǎng)中最大的集落的產(chǎn)生達(dá)到接種率的50％。向IL-6和SCF組合中添加sIL-6R使總集落形成數(shù)目增加了4.2倍。sIL-6R/IL-6/SCF誘導(dǎo)的集落數(shù)目比用IL-3大11.3倍，比用GM-CSF大5.2倍，比用G-CSF大5.4倍。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培養(yǎng)中除了一定數(shù)目的Meg集落和紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇之外，還形成了相當(dāng)數(shù)目的大尺寸的Blast集落和Mix集落，其中主要是GEMM。多于60％的sIL-6R/IL-6/SCF誘導(dǎo)的集落是GEMM和Blast集落，其中IL-3,GM-CSF和G-CSF誘導(dǎo)的集落是GM集落。
為了排除FBS中一些未知因子的可能影響，還進(jìn)行了無血清培養(yǎng)。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培養(yǎng)中再次看到很明顯的集落形成。向IL-6和SCF的組合中加入sIL-6R使總集落數(shù)增加了17.5倍。除了Meg集落和紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇(erythroid burst)之外，該組合還刺激了大量的Mix和Blast集落的形成。在其它因子組合時(shí)，沒有集落或僅有很少GM集落形成。
如圖Ⅰ所示當(dāng)sIL-6R/IL-6與其它因子一起被組合測試時(shí)，在有血清培養(yǎng)中觀察到了sIL-6R/IL-6和IL-3,GM-CSF或G-CSF之間輕微的協(xié)同作用。但在無血清培養(yǎng)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)sIL-6R/IL-6和這些因子之間的協(xié)同作用。該結(jié)果提示sIL-6R/IL-6與SCF特異地協(xié)同刺激CD34+祖細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例2sIL-6R,IL-6和SCF對懸浮培養(yǎng)中血細(xì)胞生成多能性細(xì)胞的作用。
在各種濃度的sIL-6R與SCF單用或IL-6/SCF組合進(jìn)行組合之下，對CD34+細(xì)胞在含血清的懸浮培養(yǎng)中進(jìn)行了研究。在培養(yǎng)14天之后對來源于培養(yǎng)物的祖細(xì)胞進(jìn)行了評測。圖2示應(yīng)用sIL-6R/IL-6/SCF組合時(shí)2000含840個(gè)祖細(xì)胞(SCF10ng/ml)CD34+細(xì)胞在含血清的懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)14天后，祖細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果。圖2A示在IL-6(50ng/ml)存在(○)或不存在(●)時(shí)不同濃度下的sIL-6R下祖細(xì)胞的增加。圖2B示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存在(●)下不同濃度的IL-6時(shí)祖細(xì)胞的增加。如圖1A所表明的，對應(yīng)于sIL-6R的濃度總的祖細(xì)胞急劇增加。當(dāng)應(yīng)用低至80ng/ml的濃度的sIL-6R時(shí)，仍可檢測得到這種增加。當(dāng)應(yīng)用1280ng/ml濃度的sIL-6R時(shí)，這種增加達(dá)到大約70倍的平臺。
但當(dāng)缺乏IL-6時(shí)，sIL-6R不能擴(kuò)增全部祖細(xì)胞?？磥碜婕?xì)胞的最佳擴(kuò)增依賴于IL-6的濃度。當(dāng)在sIL-6R的存在下使用大于50ng/ml的IL-6濃度時(shí)，得到了祖細(xì)胞的最大擴(kuò)增(增加63倍)(圖2B)。相反地，在缺乏sIL-6R時(shí)，使用甚至當(dāng)IL-6的濃度大于50ng/ml時(shí)的IL-6與SCF的組合；也僅有大約10倍的祖細(xì)胞的增加。這些結(jié)果證明sIL-6R只有在與IL-6組合時(shí)，才是功能性的并能在CD34+細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號。這些結(jié)果還表明1280μg/mlsIL-6R和50ng/mlIL-6在含有SCF的懸浮培養(yǎng)中是祖細(xì)胞擴(kuò)增的最佳濃度。
為了更詳細(xì)地檢測sIL-6R/IL-6對血細(xì)胞生成祖細(xì)胞擴(kuò)增的作用，而進(jìn)行了三個(gè)星期的含血清和無血清的懸浮培養(yǎng)(與其它因子組合添加有sIL-6R和IL-6)，其中每周分析一次祖細(xì)胞的擴(kuò)增。在添加了單因子或因子組合的懸浮培養(yǎng)在第7天(空白棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實(shí)心棒)時(shí)從含684祖細(xì)胞的2000CD34+細(xì)胞的總的祖細(xì)胞的產(chǎn)生的結(jié)果。數(shù)據(jù)來自單一的一次實(shí)驗(yàn)。在另外4個(gè)實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果。
在只添加了IL-6或sIL-6R的培養(yǎng)中，祖細(xì)胞的數(shù)目慢慢減少，且在第14天或21天時(shí)已基本檢測不到祖細(xì)胞。sIL-6R/IL-6或SCF單用對祖細(xì)胞的擴(kuò)增都沒有顯著的效果。在添加了SCF和IL-6的細(xì)胞中在第7天，14天，21天時(shí)祖細(xì)胞總數(shù)分別增加了8.5倍，14倍，和12倍。相反地，sIL-6R,IL-6和SCF的組合極大地增加了祖細(xì)胞的擴(kuò)增。動(dòng)力學(xué)研究表明祖細(xì)胞總數(shù)的增加直到第14天，接著減少直到第21天。當(dāng)與預(yù)擴(kuò)增(Pre-expansion)值相比較時(shí)，在第7,14，和21天時(shí)祖細(xì)胞的總的增加分別是44倍，61倍和33倍。FACS分析觀察到第14天總的CD34+細(xì)胞大約增加了80倍。
對甲基纖維素測試中不同亞型的擴(kuò)增的祖細(xì)胞的每周的分析表明，在sIL-6R,IL-6和SCF的存在下，所有類型的祖細(xì)胞包括GM集落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇形成單位(BFU-E),CFU-Blast和CFU-Mix在三周的培養(yǎng)中持續(xù)不斷的產(chǎn)生，盡管在其它因子的組合時(shí)很難檢測得到Mix集落。CFU-Mix在第7天和14天分別大約增加了60倍和80倍。有趣的是，在sIL-6R,IL-6和SCF的存在下在無血清懸浮培養(yǎng)的第21天仍獲得了相當(dāng)數(shù)目的CFU-Mix，增加了40倍。
這些結(jié)果揭示sIL-6R/IL-6與SCF在血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的擴(kuò)增中協(xié)同作用。在后面的實(shí)驗(yàn)中，測試了在SCF的存在下，sIL-6R/IL-6與其它包括IL-3和G-CSF的早期作用細(xì)胞因子的組合。
本研究還將sIL-6R,IL-6和SCF的組合與以前用做擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)的研究的IL-3,IL-6和SCF組合進(jìn)行了對比。應(yīng)用sIL-6R/IL-6/SCF的總的祖細(xì)胞的擴(kuò)增是應(yīng)用IL-3,IL-6,SCF組合的擴(kuò)增的1.5倍。
圖4描述了在含血清和無血清兩種培養(yǎng)中不同細(xì)胞因子組合的CFUMix的產(chǎn)生。最初的培養(yǎng)混合物中包括包含786祖細(xì)胞和188CFU-Mix的2000CD34+細(xì)胞。在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)，第21天(實(shí)心棒)在SCF的存在下向培養(yǎng)物中添加不同的因子組合。數(shù)據(jù)示一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在另兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到了類似的數(shù)據(jù)。
sIL-6R,IL-6和SCF組合使CFU-Mix在含血清的培養(yǎng)中，在第7天，14天分別大約增加了60倍和80倍，而在無血清培養(yǎng)中分別使其在第7,14天增加了大約49倍和68倍。由IL-3,IL-6和SCF組合產(chǎn)生的祖細(xì)胞主要是粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞系，而CFU-Mix在有血清培養(yǎng)中的第14天只擴(kuò)增了約30倍，而在無血清培養(yǎng)的第14天只擴(kuò)增了約10倍。向sIL-6R,IL-6和SCF的組合中加入IL-3不增加CFU-Mix的擴(kuò)增。奇怪地是，向組合中加入G-CSF看來對擴(kuò)增有負(fù)影響。這些結(jié)果證明sIL-6R,IL-6和SCF的組合是一個(gè)有新的擴(kuò)增組合，特別是對原始祖細(xì)胞的擴(kuò)增。
實(shí)施例3抗gp130mAb和抗IL-6RmAb對多能性細(xì)胞擴(kuò)增的影響。
為了證明了gp130參與了sIL-6R/IL-6復(fù)合物介導(dǎo)的血細(xì)胞生成祖細(xì)胞擴(kuò)增，而測評了小鼠抗人gp130mAb和抗人sIL-6RmAb對祖細(xì)胞擴(kuò)增的作用。
抗體的制備抗人gp130單克隆抗體(例如GPX7,GPX22和GPZ35)的制備是已知的(2,19)。這三個(gè)抗體識別gp130受體上不同的表位并且是已知可通過抑制IL-6誘導(dǎo)的gp130與IL-6受體的連接而抑制IL-6介導(dǎo)的生物反應(yīng)。還制備了抗人IL-6RmAb(PM1)(20)。已知PMl可通過抑制IL-6R與IL-6的結(jié)合而抑制IL-6介導(dǎo)的生物反應(yīng)。
已發(fā)現(xiàn)在含血清的懸浮培養(yǎng)中加入抗gp130mAbs可劑量依賴性地抑制總的祖細(xì)胞的擴(kuò)增。圖5示當(dāng)向培養(yǎng)物中加入不同濃度的抗人gp130mAb(A)和抗人IL-6R mAb(B)時(shí)，在含sIL-6R,IL-6和SCF的培養(yǎng)中所得到的總祖細(xì)胞(○)和CFU-Mix(●)的擴(kuò)增，以及在含IL-3和SCF的組合(△)時(shí)總祖細(xì)胞數(shù)。將不含mAb的培養(yǎng)做為對照實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)示在每個(gè)用mAb處理的培養(yǎng)中產(chǎn)生的祖細(xì)胞數(shù)時(shí)對照中產(chǎn)生的祖細(xì)胞數(shù)的比例，并以對照的百分?jǐn)?shù)(％)表示。
在1μg/ml的抗gp130mAb濃度時(shí)，CFU-MTX的擴(kuò)增被完全阻斷了，其中看來mAb對IL-3和SCF組合洗導(dǎo)的擴(kuò)增有很少或無影響。向培養(yǎng)物中加入抗IL-6RmAb引起同樣的抑制表現(xiàn)，除了較低的效率之外，在所觀察的10μg/ml(圖5B)的濃度完全取消了CFU-Mix的擴(kuò)增?？笽L-6R抗體還對IL-3和SCF組合的刺激的擴(kuò)增無影響。相反地，抗EPO抗體抑制了SCF和EPO誘導(dǎo)的擴(kuò)增，但對IL-6R,IL-6和SCF誘導(dǎo)的擴(kuò)增無影響(數(shù)據(jù)未示出)。在無血清的懸浮培養(yǎng)和甲基纖維素培養(yǎng)中獲得了同樣的結(jié)果。
紅細(xì)胞樣細(xì)胞的生產(chǎn)研究還進(jìn)一步對gp130信號通路對人造血生祖細(xì)胞紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生的影響進(jìn)行檢測。正常人血細(xì)胞生成祖/干細(xì)胞是從臍帶血單核細(xì)胞分離的并在IL-6和SCF以及各種濃度的sIL-6R的一起存在下培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)總細(xì)胞數(shù)以劑量依賴的方式增加。這種增加在sIL-6R的濃度低至80ng/ml時(shí)即可檢測得到并在1280ng/ml時(shí)出現(xiàn)平臺。圖6示在IL-6和SCF的存在下應(yīng)用各種量的sIL-6R的一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
總細(xì)胞數(shù)的分析表明，在sIL-6R的濃度超過1280ng/ml時(shí)，在培養(yǎng)的第7,14，和21天總細(xì)胞數(shù)分別增加了30倍，650倍和900倍。但在缺乏IL-6時(shí)，sIL-6R不能使總細(xì)胞數(shù)增加。這些結(jié)果清楚地表明只有在與IL-6組合時(shí)，sIL-6R才是有功能的并能在CD34+細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號。
IL-6的劑量反應(yīng)研究也表明總細(xì)胞數(shù)劑量依賴性地增加。在1280ng/mlsIL-6R的存在下應(yīng)用50-100ng/ml濃度的IL-6得到了最大的細(xì)胞數(shù)(圖7)。但在缺少sIL-6R時(shí)，IL-6只產(chǎn)生小的細(xì)胞數(shù)目的增加，甚至其用量大于50ng/ml時(shí)也是如此。這些結(jié)果提示在帶有SCF的含血清的培養(yǎng)中，1280ng/ml的sIL-6R和50ng/ml的IL-6對來自純化干細(xì)胞的總細(xì)胞的擴(kuò)增來說可能是一個(gè)有效的組合。當(dāng)使用純化自人骨髓的CD34+細(xì)胞時(shí)，也觀察了sIL-6R,IL-6和SCF組合時(shí)總細(xì)胞數(shù)的擴(kuò)增(未示出數(shù)據(jù))。
有可能在含血清的培養(yǎng)中所觀察的到的sIL-6R/IL-6組合的作用是由于其與污染胎中血清(FBS)的未知因子結(jié)合作用的結(jié)果，而只僅僅是sIL-6R/IL-6/SCF單獨(dú)組分的結(jié)果。為了排除這種可能性，對無血清懸浮培養(yǎng)的CD34+臍帶血細(xì)胞進(jìn)行了研究。令人奇怪地是當(dāng)與有血清培養(yǎng)相比較時(shí)，觀察到了sIL-6R,IL-6和SCF之間比含血清時(shí)更大的協(xié)同作用(圖8)。用sIL-6R,IL-6和SCF的組合的無血清培養(yǎng)使總細(xì)胞數(shù)在第7,14和21天時(shí)分別增加了38倍，530倍和2200倍。已證明SCF采用，或其與IL-6組合應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞甚至到第21天時(shí)也只擴(kuò)增2.2或7.5倍。這些結(jié)果清楚地排除了未知因子的可能影響并證明了在SCF的存在下，sIL-6R確實(shí)誘導(dǎo)了血細(xì)胞生成干細(xì)胞的擴(kuò)增。
對擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞離心制品進(jìn)行了各種細(xì)胞化學(xué)和免疫化學(xué)染色。這些細(xì)胞的分化細(xì)胞計(jì)數(shù)表明主要存在的是未成熟細(xì)胞，例如CD34+臍帶血細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)結(jié)果(圖9a)。有意思的是，當(dāng)應(yīng)用sIL-6R,IL-6和SCF組合時(shí)，在培養(yǎng)的第14天，在含血清和無血清的懸浮培養(yǎng)中都觀察到了一定數(shù)目的紅血母細(xì)胞。通過聯(lián)苯胺染色和應(yīng)用抗血型糖蛋白A(圖9b)和血紅蛋白a(圖9c)的免疫染色對紅細(xì)胞樣細(xì)胞的特征進(jìn)行了確定。一些紅細(xì)胞樣細(xì)胞分化到了幼紅細(xì)胞和有核紅(ennucleated)細(xì)胞階段。在培養(yǎng)的第21天，大多數(shù)紅細(xì)胞樣細(xì)胞分化到了幼紅細(xì)胞階段，并且觀察到了許多有核紅細(xì)胞。
通過對細(xì)胞離心甩片上血型糖蛋白A陽性細(xì)胞出現(xiàn)率和總細(xì)胞數(shù)的計(jì)算而得到了紅細(xì)胞樣細(xì)胞的絕對數(shù)目。在圖10中出示了對加入了不同的細(xì)胞因子組合的無血清培養(yǎng)中紅細(xì)胞樣細(xì)胞的絕對數(shù)目的每周的分析結(jié)果。
sIL-6R,IL-6和SCF組合不僅與其它組合相比顯著地刺激了總細(xì)胞數(shù)的產(chǎn)生，而且刺激了紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生。在培養(yǎng)2周之后，該組合產(chǎn)生的大約79％的細(xì)胞是紅細(xì)胞樣細(xì)胞(即E-未成熟細(xì)胞和紅細(xì)胞)。在培養(yǎng)3周之后，該組合產(chǎn)生的大約69％的細(xì)胞是紅細(xì)胞樣細(xì)胞。在含sIL-6R和IL-6與IL-3或GM-CSF的組合的培養(yǎng)中觀察到了小數(shù)目的紅細(xì)胞樣細(xì)胞，這提示gp130信號傳導(dǎo)在紅細(xì)胞樣細(xì)胞體外產(chǎn)生中起了作用。
除了這些包含促紅細(xì)胞生成素的組合之外，在加入了其它組合的培養(yǎng)物中檢測不到紅細(xì)胞樣細(xì)胞。與促紅細(xì)胞生成素單用相比，sIL-6R,IL-6和SCF所產(chǎn)生的紅細(xì)胞樣細(xì)胞在培養(yǎng)的第14天大約是它的5倍，在培養(yǎng)的第21天時(shí)大約是它的115倍(圖10)。與促紅細(xì)胞生成素，sIL-6R和IL-6的組合相比，sIL-6R/IL-6/SCF組合所生產(chǎn)的紅細(xì)胞樣細(xì)胞總數(shù)是在培養(yǎng)的第14天時(shí)它的大約4.1倍，而在培養(yǎng)的第21天時(shí)是大約38.3倍。在CD34+骨髓細(xì)胞的含血清和無血清培養(yǎng)中部觀察到了sIL-6R/IL-6/SCF組合對紅細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的作用(數(shù)據(jù)未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的組合的懸浮培養(yǎng)中，大量紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生可能來自于CD34+骨髓細(xì)胞的含血清和無血清培養(yǎng)中部觀察到了sIL-6R/IL-6/SCF組合對紅細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的作用(數(shù)據(jù)未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的組合的懸浮培養(yǎng)中，大量紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生可能來自于CD34+細(xì)胞群體中未成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞的增殖，分化和成熟。為了確證這種可能性，而對CD34+細(xì)胞的甲基纖維素克隆培養(yǎng)進(jìn)行了研究。向培養(yǎng)物中加入了單獨(dú)的促紅細(xì)胞生成素，組合的促紅細(xì)胞生成素/IL-6或促紅細(xì)胞生成素/sIL-6R/IL-6組合。表1示將500個(gè)CD34+臍帶血細(xì)胞培養(yǎng)14天得到的結(jié)果。
表1紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇混合紅細(xì)胞樣集落EPO 57.7±14.8 0EPO/IL-6 63.0±3.5 0EPO/sIL-6R/IL-665.0±7.6 9±6.1sIL-6R,IL-6和SCF的組合，在缺乏促紅細(xì)胞生成素時(shí)，不僅刺激了紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇，而且還刺激產(chǎn)生了大量的大的混合紅細(xì)胞樣集落。在所有的混合紅細(xì)胞樣集落中都含有許多包含紅細(xì)胞的成熟紅細(xì)胞樣細(xì)胞(圖9f和和圖9g)。sIL-6R/IL-6/SCF組合從500個(gè)CD34+臍帶血細(xì)胞中產(chǎn)生了27.2±5.8紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇和122.3±21.8混合紅細(xì)胞樣集落。相反，在只加入SCF或SCF與IL-6的組合的培養(yǎng)中既沒有觀察到紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇，也沒有觀察到混合紅細(xì)胞樣集落。還在無血清培養(yǎng)中對應(yīng)用sIL-6R/IL-6/SCF組合時(shí)臍帶血和骨髓干細(xì)胞中紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇和混合紅細(xì)胞樣集落的產(chǎn)生進(jìn)行了確證(數(shù)據(jù)未出示)。當(dāng)用sIL-6R/IL-6/SCF組合培養(yǎng)含成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞的骨髓單核細(xì)胞(即集落形成單位一紅細(xì)胞樣的)時(shí)，觀察到了一定數(shù)目的紅細(xì)胞樣集落。這些結(jié)果強(qiáng)有力的提示sIL-6R/IL-6/SCF不僅可支持CD34+細(xì)胞群體中未成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞而且可支持骨髓單核細(xì)胞中成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞的增殖，分化，和終端成熟。
為了進(jìn)一步檢測調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的替代通路的可能性，我們測定了不同的抗體對細(xì)胞發(fā)育的影響。對下面的抗體的作用進(jìn)行了研究阻斷sIL-6R/IL-6復(fù)合物和細(xì)胞表面gp130相互作用的抗gp130mAb(GPX7,GPX22和GPX35)(19,29)；阻斷IL-6和IL-6R之間相互作用的抗IL-6RmAb,(20)；和阻斷CD34+細(xì)胞紅細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)育的抗促紅細(xì)胞生成素中和抗體。向含sIL-6R/IL-6/SCF組合的懸浮培養(yǎng)中加入抗gp130mAb完全阻止了紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生(圖11)。但是抗gp130抗體對促紅細(xì)胞生成素依賴的紅系細(xì)胞的產(chǎn)生無影響。
向含sIL-6R/IL-6/SCF組合的培養(yǎng)中加入10mg/ml濃度的抗IL-6RmAb導(dǎo)致了對紅細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的幾乎完全的抑制(圖12)?？笽L-6RmAb的低效率可以用可干擾體與IL-6和細(xì)胞表面IL-6R之間中和作用的sIL-6R的過量來解釋。相反，盡管抗促紅細(xì)胞生成素抗體幾乎全部抑制了促紅細(xì)胞生成素依賴的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，它卻不影響sIL-6R/IL-6/SCF組合的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生(圖13)。
血細(xì)胞生成干細(xì)胞的甲基纖維素克隆培養(yǎng)還表明抗gp130mAb，而不是抗促紅細(xì)胞生成素抗體，全部阻斷了由sIL-6R/IL-6/SCF組合誘導(dǎo)的紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇和混合紅細(xì)胞樣集落形成的發(fā)育。這些結(jié)果清楚地表明所觀察到的白介素-6配體和可溶性受體之間作用來自IL-6和sIL-6R之間的作用，和所得到的IL-6/sIL-6R復(fù)合物與靶祖細(xì)胞上膜錨定的gp130相連接的結(jié)果。該結(jié)果還表明通過gp130信號通路與SCF組合來自未成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生與促紅細(xì)胞生成素的存在是不相關(guān)的。
據(jù)信在生理上紅細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖和終端分化是通過促紅細(xì)胞生成素受體信號通路而調(diào)節(jié)的。本發(fā)明gp130信號通路與SCF組合可刺激未成熟紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞，在缺乏促紅細(xì)胞生成素時(shí)增加紅血母細(xì)胞和紅細(xì)胞。這就提示促紅細(xì)胞生成素信號通路對正常人紅細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖，分化和終端成熟不是專一性的。sIL-6R/IL-6/SCF組合顯著地紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，以及未加入sIL-6R的干細(xì)胞此類產(chǎn)生的缺乏，可以聯(lián)想到以前的報(bào)道，sIL-6R賦于IL-6對缺少跨膜IL-6R但卻表達(dá)gp130的細(xì)胞的應(yīng)答。該理論受到免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)的支持，實(shí)驗(yàn)證明所有的CD34+細(xì)胞和可增殖細(xì)胞都表達(dá)gp130，但卻有約90％的接受了sIL-6R/IL-6/SCF組合的CD34+細(xì)胞對IL-6R染色是陰性的。
已有報(bào)道在人血清中對sIL-6R的檢測表明了其生理意義(26)。血清中的sIL-6R就其與IL-6結(jié)合并最終刺激gp130的能力來說是有生物活性的(30)。在320ng/mlsIL-6R和25ng/mlIL-6濃度時(shí)觀察到了sIL-6R和IL-6組合時(shí)使外CD34+細(xì)胞紅細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的半最大效應(yīng)。這看來是在生理范圍之內(nèi)的。IL-6和SCF也可在人血清中檢測得到。與IL-6一樣，可溶性和膜結(jié)合形式的SCF都是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，該細(xì)胞可固著血細(xì)胞生成干細(xì)胞并未成熟祖細(xì)胞并支持其在骨髓中的增殖(27,28,31,32)。綜合起來，本結(jié)果表明，SCF與gp130信號通路相組合，在正常體內(nèi)促紅細(xì)胞生成中起到了重要的作用。
實(shí)施例4sIL-6R和IL-6對人血細(xì)胞生成干細(xì)胞的增殖活性。
方法人臍帶血的獲得是根據(jù)常規(guī)的指導(dǎo)，從正常成熟分娩中收集的。在用Silica(IBL,Fujioka,Japan)去除巨噬細(xì)胞之后用Ficoll-Hypaque密度梯度離心對單核細(xì)胞進(jìn)行了分離。在洗滌之后，以珠子細(xì)胞為1∶1的比例將單核細(xì)胞與攜帶抗CD34抗體的磁性顆粒(Dynabeads M-450CD34；Dynal,Oslo,Norway)混合。將細(xì)胞珠子懸浮液懸浮起來并在4℃培養(yǎng)30分鐘使細(xì)胞與珠子結(jié)合。在Dynal Magnetic Particle Concentrator中收集得到的珠子/玫瑰花結(jié)細(xì)胞。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，從用DETACHaBead CD34(Dynal)陽性選擇的細(xì)胞上解離下珠子；必釋放選擇的CD34+細(xì)胞。FACS分析分離的CD34+細(xì)胞的純度為85-95％(Ortho,USA)。
添加有SCF,IL-3,IL-6，促紅細(xì)胞生成素和G-CSF的甲基纖維素培養(yǎng)中的克隆效率是45-55％。應(yīng)用前述的技術(shù)并經(jīng)過如下的修飾將純化的CD 34+細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(21,22)。培養(yǎng)培養(yǎng)基含2000CD34+細(xì)胞，α-培養(yǎng)基，1％結(jié)晶的去離子化的牛血清白蛋白(BSA,Sigma)。將1ml培養(yǎng)混合物和不同的重組的人sIL-6R,IL-6和SCF(100ng/ml)的組合在37℃5％CO2,5％O2培養(yǎng)在24孔組織培養(yǎng)板中(Nunc,Kamstrop Denmark)。如前所述產(chǎn)生和應(yīng)用重組sIL-6R,IL-6和SCF。無血清懸浮培養(yǎng)由2％純的BSA(Sigma),10mg/ml胰島素，200mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，10-5M巰基乙醇(Eastman)和40mg/ml低密度脂蛋白(Nakarai Tesque Inc.,Tokyo)來代替FBS來組成(10)。每隔一周，用含同樣的一系列細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。然后收集一部分細(xì)胞，洗滌，在血球計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)，細(xì)胞離心并染色。
結(jié)果如上所述，研究的結(jié)果被出示于圖10到圖12中。圖10示在IL-6(150ng/ml)的存在(○)或不存在(●)時(shí)應(yīng)用不同濃度的sIL-6R和SCF在培養(yǎng)的第14天，在含血清的懸浮培養(yǎng)中干細(xì)胞的生長。圖11示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存時(shí)(●)應(yīng)用不同濃度的IL-6和SCF在培養(yǎng)的第14天，在含血清的懸浮培養(yǎng)中干細(xì)胞的生長。圖12示含單獨(dú)的SCF，或者SCF和IL-6(50ng/ml)的組合，或者SCF/IL-6和sIL-6R(1280ng/ml)的組合時(shí)在含血清和無血清培養(yǎng)中在第7天(空心柱)，第14天(斜線柱)和第21天(實(shí)心柱)時(shí)干細(xì)胞的生長。結(jié)果來自三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)方差以誤差棒的方式表達(dá)。
實(shí)施例5含組合的細(xì)胞因子的培養(yǎng)中血細(xì)胞生成干細(xì)胞紅細(xì)胞樣細(xì)胞的發(fā)育。
方法在第7天和14天用常規(guī)方法對懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞離心制品進(jìn)行May-Grunwald-Giemsa染色。在第14天，還根據(jù)前述的方法(23)用抗血型糖蛋白A(Immuotech Co Marseilles,France)和抗血紅素α-鏈(CosmoBio Co,Tokyo,Japan)的mAb使用堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)方法進(jìn)行免疫染色。陽性細(xì)胞被微紅色顆粒染色。如上所述進(jìn)行甲基纖維素培養(yǎng)(23,24)。培養(yǎng)培養(yǎng)物含500CD34+臍帶血細(xì)胞，a-培養(yǎng)基，0.9％,30％FBS,1％BSA,5×105M巰基乙醇，1280ng/mlsIL-6R,80ng/mlIL-6和100ng/mlSCF。將1ml培養(yǎng)混合物培養(yǎng)在每個(gè)35mm Lux標(biāo)準(zhǔn)非組織培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞在含5％CO2的空氣中在37℃進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果研究結(jié)果被出示于圖9中。在第7天(圖9a)和14天(圖8d)將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞離心制品用May-Grunwald-Giemsa染色。圖9b和9c分別是用抗血型糖蛋白AmAb或抗血紅素αmAb在第14天的對細(xì)胞離心制品的免疫染色。在圖9e和9f中分別圖示在用sIL-6R,IL-6和SCF在第14天在甲基纖維素培養(yǎng)中從紅細(xì)胞樣細(xì)胞中產(chǎn)生的代表性紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇和混合紅細(xì)胞樣集落。
實(shí)施例6對紅細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的抗體效果方法下面的試驗(yàn)檢測了抗人gp130mAb，抗人IL-6RmAb和抗人促紅細(xì)胞生成素抗體對紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生的作用。如上所述制備了抗人gp130 mAb抗體制品(GPX7,GPX22和GPX35)(2)。簡言之，用重組人可溶性gp130免疫小鼠，并建立了產(chǎn)生抗人gp130mAbGPX7,GPX22和GPX35的雜交瘤。這三個(gè)抗體識別gp130上不同的表位，并通過抑制IL-6誘導(dǎo)的gp130與IL-6受體的結(jié)合而抑制了IL-6介導(dǎo)的生物應(yīng)答(2,19)。制備了抗人IL-6R(PMI)mAb(20)。PMI通過抑制IL-6和IL-6受體的結(jié)合而抑制了IL-6介導(dǎo)的生物反應(yīng)。兔抗人促紅細(xì)胞生成素抗體(2gGK-5)由Kirin Co.；Japan提供?？勾偌t細(xì)胞生成素抗體(24mg/ml)中和2U/ml的促紅細(xì)胞生成素(34)。
如圖11所示，向人臍帶血干細(xì)胞(2000CD34+細(xì)胞)中添加了預(yù)先確定的最佳濃度的sIL-6R/IL-6/SCF的組合(○)或促紅細(xì)胞生成素(2U/ml)和SCF(100ng/ml)的組合(●)。如實(shí)施例4所述，觀察了加入或未加入了抗人gp130mAb(圖11)，小鼠抗人IL-6RmAb(PMI)(圖12)或兔抗人促紅細(xì)胞生成素抗體(圖13)的含血清的懸浮培養(yǎng)。在培養(yǎng)的開始加入梯度濃度的抗體。將未加入抗體的孔作為對照。在培養(yǎng)14天后，收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并離心。以總細(xì)胞數(shù)和離心甩片確定的紅細(xì)胞樣細(xì)胞的比例為基礎(chǔ)對總的紅細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)算(包括紅血母細(xì)胞，幼紅細(xì)胞和紅細(xì)胞)。所得到了數(shù)據(jù)代表了在每個(gè)用抗體處理了的紅細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)對照孔中的細(xì)胞的比例，并以對照的百分比來表示(％)。
權(quán)利要求
1．一種體外擴(kuò)增多能血細(xì)胞生成細(xì)胞的方法，它包括用含可溶性白介素-6受體，白介素-6，和干細(xì)胞因子的細(xì)胞因子組合培養(yǎng)細(xì)胞。
2．權(quán)利要求1的方法，其中將被擴(kuò)增的細(xì)胞得自臍帶血，外周血或骨髓。
3．權(quán)利要求3的方法，其中多能血細(xì)胞生成細(xì)胞是通過CD 34選擇得到的祖和/干細(xì)胞。
4．權(quán)利要求3的方法，其中的多能血細(xì)胞生成細(xì)胞是通過去除了可增殖的細(xì)胞而功能性選擇的干細(xì)胞。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所說的可溶性白介素-6受體的使用濃度為至少80ng/ml到1280ng/ml。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所說的白介素-6的使用濃度為至少50ng/ml到100ng/ml。
7．一種物品，它包括根據(jù)權(quán)利要求1的用于多能血細(xì)胞生成細(xì)胞擴(kuò)增的可溶性白介素-6受體，白介素-6和干細(xì)胞因子。
8．一種包含如下細(xì)胞的細(xì)胞群體粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落，巨核細(xì)胞集落，紅細(xì)胞樣細(xì)胞簇，半成熟細(xì)胞集落，混合血細(xì)胞生成集落和，粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落，這些集落是通過用包括可溶性白介素-6受體，白介素-6和干細(xì)胞因子的細(xì)胞因子組合培養(yǎng)多能血細(xì)胞生成細(xì)胞而產(chǎn)生的。
9．一種產(chǎn)生分化的血細(xì)胞集落的方法，它包括一種將多能血細(xì)胞生成細(xì)胞與包含第一種細(xì)胞因子，第一種細(xì)胞因子的可溶性受體和第二種細(xì)胞因子的細(xì)胞因子組合組合的體外方法，其中所說的第一和第二種細(xì)胞因子通過不同的信號通路刺激細(xì)胞的應(yīng)答。
全文摘要
干細(xì)胞因子和可溶性白介素－6受體,白介素－6組合起來,通過gp130信號傳導(dǎo),支持來自正常人血細(xì)胞生成多能性細(xì)胞的血細(xì)胞的增殖,分化和終端成熟。
文檔編號C12N5/00GK1224461SQ95194868
公開日1999年7月28日 申請日期1995年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月16日
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