專利名稱：產(chǎn)生海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及在植物內(nèi)導(dǎo)入海藻糖合成能力的基因工程。具體地說，本發(fā)明涉及增加了海藻糖含量的植物及生產(chǎn)這些植物的方法。本發(fā)明還涉及提高植物對冷和干燥等環(huán)境壓力之方法，以及由植物生產(chǎn)海藻糖的方法。
發(fā)明的背景海藻糖(α-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖)是通過其還原基團(tuán)連接的葡萄糖分子的二聚體。由于與其他糖相比，其具有缺少還原基團(tuán)、水解慢及能夠形成不易潮解的玻璃體等不尋常的性質(zhì)，所以它是一種蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和其他生物學(xué)化合物的最有效的已知體外防腐劑、另外，含有大量海藻糖的活生物體常常是以暴露于滲透壓、脫水及熱應(yīng)激狀態(tài)下為特征，例如昆蟲、某些淺海動物及包括酵母和細(xì)菌在內(nèi)的許多微生物。有間接證據(jù)(見WiemkenAntonie van Leeuwenhoek 58，209-217的綜述)表明海藻糖在面包酵母中的主要作用是提供對抗這些環(huán)境壓力的抗性。但也有人提示(Nwaka et al(1994)FEBS Letters 344，225-228；Van Dijk et al(1995)Applied Environ.Microbiol.61，109-115)，海藻糖在面包酵母中的積聚本身并不足以提供對環(huán)境壓力的耐受性。
在所謂更蘇植物如蕨類植物(Selaginella lepidophylla)中存在有高水平的海藻糖，使之可在干燥和熱環(huán)境下長期存活(參見Avigad(1982)在Encyclopedia of Plant Research(new series)13A，pp 217-347中所作的評述)。然而，大多數(shù)維管植物并不能合成海藻糖。這些植物往往通過降低細(xì)胞內(nèi)水分的利用性來對干燥等環(huán)境壓力作出反應(yīng)，常常積聚其他一些“相容的”溶質(zhì)，例如甘氨酸三甲內(nèi)銨鹽、脯氨酸及各種多元醇(參見McCue and Hanson(1990)Trends in Biotechnology 8，358-362)。
有關(guān)被子植物中海藻糖的報導(dǎo)十分有限，并且報導(dǎo)中所述的小量海藻糖可能反映存在有微生物的污染(例如參見Kandler&Senser(1965)Z.Pflanzenphysiol.53，157-161；Qesch&Meier(1967)Phytochemistry 6，1147-1148)。已有人提示海藻糖對許多植物組織是有毒性的(Veluthambi et al.，(1981)Plant Physiol.68，1369-1374)，特別是對那些只有很小或沒有海藻糖酶活性的植物(海藻糖酶是一種將海藻糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的酶)。但至少有一種被子植物即Myrothamnus flakellifolia。(另一種“更蘇”植物)積聚有較大量的海藻糖(Bianchi et al.(1993)Physiologia Plantarun 87，223-226)表明海藻糖和被子植物間沒有絕對的相容性屏障。
大多數(shù)被子植物中沒有海藻糖，并且還報導(dǎo)其在某些植物中是有毒性的，此表明在這些植物內(nèi)導(dǎo)入海藻糖合成途徑有時可能對植物帶來不利影響。另一方面，在植物中成功地產(chǎn)生海藻糖將會具有明顯的好處。例如在糖甜菜、馬鈴薯、洋蔥等的儲藏器官中積聚的海藻糖經(jīng)商業(yè)生產(chǎn)后，可得到在某些應(yīng)用中有與蔗糖價值相媲美的海藻糖。這些應(yīng)用包括制造干燥食品(奶和蛋粉、湯料及果泥等)，因為海藻糖可通過在商業(yè)上有吸引力的干燥工藝來保持許多食品原料的風(fēng)味和組織特征，并且在這方面比蔗糖要優(yōu)越得多(例如參見Roser(1991)Trends in Food Science&Technology，July issue，pp.166-169；Roser&Colaco(1993)NewScientist，May issue，pp.25-28)。因為海藻糖不產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)可能對健康不利的果糖，所以在許多情況下(如制作湯料、蛋粉)海藻糖比蔗糖有更多的優(yōu)點(diǎn)。但海藻糖的高價格又使之在干燥食品工業(yè)中的應(yīng)用成本太高以致難以承受。其次，在某些植物的可食用部分中產(chǎn)生海藻糖可延長產(chǎn)品例如番茄的貨架期。第三，海藻糖在敏感組織中的積聚可增加植物對霜凍、干燥、高鹽及相似壓力的耐受性。
發(fā)明的概要基于上述事實，本發(fā)明的一個目的是提供具有新的合成海藻糖能力的植物。具體地說，本發(fā)明的一個目的是提供海藻糖在作為海藻糖之商業(yè)來源的植物組織中的可控制性積聚，或提供環(huán)境壓力耐受性或兩者，同時最大限度地減小海藻糖對植物生長的不利影響。
本發(fā)明是基于用處于適當(dāng)?shù)闹参飭幼涌刂葡碌呢?fù)責(zé)海藻糖合成的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)闹参铮援a(chǎn)生增加了海藻糖含量的轉(zhuǎn)基因植物這一概念。具體地說，即按照本發(fā)明于特異性的植物啟動子的控制下，在植物中表達(dá)編碼能產(chǎn)生海藻糖-6-磷酸或海藻糖本身的酶的多肽一個或多個基因的編碼序列。
因此，至少用與植物啟動子適當(dāng)融合的海藻糖-6-磷酸合成酶(Tre6P合成酶)基因的編碼序列轉(zhuǎn)化的有用的植物，只有在植物成熟時或當(dāng)其遭遇到特殊的環(huán)境條件時才能實現(xiàn)基因的表達(dá)。因此，啟動子最好是非組成性的，且選擇能在基因表達(dá)過程中得以時序性(如按晝夜進(jìn)行的)控制、按局部分布(如組織特異性的)的控制或壓力激活性(或“壓力誘導(dǎo)性”)控制。也可以用一個或多個編碼海藻糖-6-磷酸酶(Tre6Pase)或與Tre6P合成酶或與Tre6Pase相互作用的調(diào)節(jié)性多肽或這兩者的基因來轉(zhuǎn)化植物。
可用本領(lǐng)域已知的任何一種方法轉(zhuǎn)化植物，這些方法包括用被轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacter tumefaciens)進(jìn)行感染，或經(jīng)微量注射、電穿孔或顆粒轟擊，以及DNA直接攝入來直接導(dǎo)入外來DNA。結(jié)構(gòu)基因最好選自分別編碼56 KDa Tre6P合成酶、酵母海藻糖合成酶的102 KDaTre6Pase和123KDa調(diào)節(jié)亞基的酵母基因TPS1、TPS2及TSL1。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)增加了海藻糖含量之轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括用海藻糖合成的結(jié)構(gòu)基因，特別是如上所述的Tre6P合成酶的基因轉(zhuǎn)化有用的植物，并在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡卤磉_(dá)這些基因，以允許在基因表達(dá)過程中進(jìn)行時序性、按局部分布性、或壓力誘導(dǎo)性控制。
本發(fā)明的第三個目的是提供生產(chǎn)海藻糖的方法，該方法包括—用至少一個Tre6P合成酶的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，—于可誘導(dǎo)海藻糖合成酶基因在該植物中表達(dá)的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因植物，以及—從植物的組織中提取海藻糖。
本發(fā)明的第四個目的是提供使植物免受干旱、高鹽堿、極端溫度及其他壓力等不良條件影響的方法，該方法包括用至少一個與植物啟動子適當(dāng)融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的編碼序列轉(zhuǎn)化植物，只有當(dāng)植物遭遇到不利條件時才實現(xiàn)基因的充分表達(dá)。也可用一個或多個編碼海藻糖-6-磷酸酶和與海藻糖-6-磷酸合成酶或海藻糖-6-磷酸酶相互作用的調(diào)節(jié)蛋白或兩者的基因可操作地共轉(zhuǎn)染。例如，本發(fā)明提供一種防止帶漿果或其他果實植物在開花期免于霜凍損害的方法，該方法包括用與植物啟動子適當(dāng)融合的海藻糖-6-磷酸酶的基因轉(zhuǎn)化植物，只有在植物遭遇到低溫時才實現(xiàn)基因的充分表達(dá)。
本發(fā)明的第五個目的是提供一種生產(chǎn)被轉(zhuǎn)化的，不需要象未被轉(zhuǎn)化的植物那樣進(jìn)行細(xì)致地和專門地照料的觀賞植物的方法，該方法包括用與植物啟動子適當(dāng)融合的編碼海藻糖-6-磷酸合成酶的基因轉(zhuǎn)化植物，從而使植物的某些組織中含有海藻糖。
附圖的簡要說明

圖1圖解顯示含有融合了A.thaliana 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動子(pats1A)的與編碼Tre6P合成酶亞單位的TPS1酶母基因及根瘤農(nóng)桿菌之胭脂堿合成酶基因(nos)的轉(zhuǎn)錄終止信號的嵌合基因構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。其中只顯示出帶嵌合基因之質(zhì)粒pKOH51的一部分。顯示了用于嵌合基因構(gòu)建的獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)。
圖2給出對轉(zhuǎn)基因煙草植物所作Western印跡分析的結(jié)果，其中以箭頭指示56KDa TPS1產(chǎn)物。從含有圖1所示構(gòu)建體(泳道1，3，4，5，6，8，10，12，15，16和19)，或(GUS)另一個帶有在同樣載體中與β-葡糖苷酸酶基因(UIDA)融合之花椰菜花葉病毒35S啟動子的嵌合基因的煙草轉(zhuǎn)化植株中，或從未被轉(zhuǎn)化的煙草植株(SR1)中提取蛋白質(zhì)。各泳道加入等量的蛋白質(zhì)。所使用的抗血清是抗酵母之56KDa Tre6P合成酶亞單位的抗血清。
圖3顯示對海藻糖的層析鑒定結(jié)果。按照一般“材料和方法”所述的以HPLC法分析煙草葉的水提取物樣品(20μl)。提取物A和B含有192mg/ml鮮重溫室生長的轉(zhuǎn)化體19ml-1，(A)為用海藻糖酶處理前的，(B)為用海藻糖酶處理后的。提取物C和D含有149mg/ml(C)轉(zhuǎn)化株4或(D)用缺少TPS1基因的質(zhì)粒pDE1001轉(zhuǎn)化的對照植株的葉片，兩者均生長于無菌條件下。T指示海藻糖峰值。在大約25分鐘洗脫時間出現(xiàn)的兩個大峰是葡萄糖和蔗糖。
圖4顯示對ats1-TPS1轉(zhuǎn)化系4中TPS1亞基之組織定位的蛋白質(zhì)免疫印跡分析結(jié)果。用野生型煙草(SR1)的葉作為陰性對照，并使用0.1μg從酵母(TPS1)中純化的Tre6P合成酶亞單位作為陽性對照。在免疫印跡上方以mg/g干重表示同樣組織中的海藻糖含量。nt代表未檢測到。使用了下列縮寫符號FB代表花蕾，UL代表上部葉，ML代表中部葉，LL代表下部葉，US代表上莖，R代表根，EC代表酶對照物。
圖5顯示產(chǎn)海藻糖植物提高了的對干燥的耐受性。將試管內(nèi)繁殖的6至8周令植物處于同一發(fā)育階段的離體葉片暴露于空氣干燥的環(huán)境(25％RH)。(A)在所述的時間將葉片稱重，并將結(jié)果作為在各時間點(diǎn)上葉子的相對鮮重示于圖中。將葉子于+60℃干燥48小時后得到各葉片的干重。SR1指示野生型對照煙草，產(chǎn)海藻糖轉(zhuǎn)基因系1、4和8，分別由它們的系號指示。(B)顯示在環(huán)境壓力處理期間的選定的時間點(diǎn)上得自轉(zhuǎn)基因系4和對照植物的離體葉片之外觀。
圖6顯示對照組和產(chǎn)海藻糖組煙草植物的干旱存活性。(A)顯示6至8周令試管內(nèi)繁殖的全植株在空氣干燥(D)條件下暴露的時間。環(huán)境壓力處理17小時后，將未被轉(zhuǎn)化的對照植株(SR1)和系4與8的產(chǎn)海藻糖轉(zhuǎn)基因植物放在水中重新水化(R)。(B)將3周令轉(zhuǎn)基因系8及未被轉(zhuǎn)化的(SR1)和載體轉(zhuǎn)化的(C)對照植株的籽苗在空氣干燥(D)條件下暴露指定的時間。環(huán)境壓力處理7小時后，將籽苗放在水中使之重新水化(R)。
圖7顯示對含有第一次肝素-Sepharose柱上洗脫的M.SmegmatisTre6P合成酶的組分所作SDS-PAGE分析的結(jié)果。泳道1至4分別含有H33(7.0mU)、H35(20mU)、H36(21mU)和H37(12mU)的樣品(表3)。在8％丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE后，用考馬斯亮蘭染色。泳道5中以KDa數(shù)示出分子量標(biāo)準(zhǔn)品的分子量大小。用箭頭指示55KDa Tre6P合成酶多肽的位置。
圖8顯示對從第二次肝素-Sepharose柱上洗脫的M.SmegmatisTre6P合成酶之組分峰的SDS-PAGE分析的結(jié)果。在Centricon 10試管中濃縮組分T21(表3)，然后與半量體積之3倍濃縮的SDS-PAGE樣品緩沖液混合。總體積濃縮6倍。在8％丙烯酰胺凝膠上對含有(泳道1)2.9mU和(泳道3)8.7mU Tre6P合成酶的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并用考馬斯亮蘭染色。泳道2中所示的分子量標(biāo)準(zhǔn)從頂部到底部分別為109、84、47、33、24和16KDa。
圖9顯示對從M.Smegmatis中純化的Tre6P合成酶所作Western印跡分析的結(jié)果。將預(yù)染色的分子標(biāo)志(泳道1200、117、80和47KDa；泳道10只可看到84KDa的分子量標(biāo)志)、從組分T21(表3)得到的純Tre6P合成酶(泳道7和82.9mU；泳道3、4和98.7mU)以及得自G100 Sephadex層析柱(表3)的合并的活性部分(泳道67.8μg總蛋白質(zhì)；泳道2和523μg總蛋白質(zhì))。電泳并轉(zhuǎn)印跡到硝酸纖維素膜上之后，在泳道3和4之間及泳道7和8之間切開硝酸纖維素膜。用考馬斯亮蘭染泳道1至3，用抗純化的酵母56KDa Tre6P合成酶亞基的抗57血清探查泳道4至7，并用預(yù)免疫血清探查泳道8至10。按照制造商提供的使用說明用購自Promega的羊抗兔LgG-堿性磷酸酶偶聯(lián)物顯現(xiàn)免疫活性帶，在兩者情況下顯色時間均為2.8分鐘?？缭接镜?至7的斜線是由于在轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上時膜意外形成的皺褶所致。
圖10顯示對Arabidopsis thaliana的8個轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行的Western印跡分析結(jié)果。提取從初始轉(zhuǎn)化體的種子生長成的植物，并基本上按圖2所示用抗酵母56KDa Tre6P合成酶亞基的抗血清分析之。使用從酵母中純化的Tre6P合成酶亞基(0.1μg)作為陽性對照。未被轉(zhuǎn)化的A.thaliana呈陰性反映。
發(fā)明的詳細(xì)描述在下文描述中，術(shù)語“組成性植物啟動子”是指造成它們的相關(guān)編碼序列的連續(xù)性和普遍性表達(dá)，從而在這些植物株的所有細(xì)胞中及生長的各個階段中均可發(fā)現(xiàn)這些序列的表達(dá)產(chǎn)物。相反，非組成性啟動子則是通過特異的內(nèi)部或外部過程激活的，例如隨著植物發(fā)育和成熟細(xì)胞分化形成不同的組織，或者植株的環(huán)境發(fā)生改變等。已知許多種環(huán)境改變都激活特定啟動子是的。其例子包括光誘導(dǎo)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶之小亞基啟動子(Krebbers et al.(1988)Plant Mol.Biol.11，745-759)，例如實施例1-3中使用的ats1A啟動子，以及可由各種環(huán)境壓力誘導(dǎo)的啟動子例如LTI78(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&PalVa(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)。但本發(fā)明不只限于這些舉例的非組成性啟動子。相反，本發(fā)明的一個重要的和新穎的部分是基于這樣一個概念，即由植物組成性合成海藻糖總是不經(jīng)濟(jì)并且有時是有害的，從而最好通過使用非組成性啟動子體現(xiàn)本申請中公開的海藻糖生產(chǎn)方法的好處。借助這些非組成性啟動子，可以對轉(zhuǎn)基因植物中海藻糖的生物合成進(jìn)行時序控制(即其只發(fā)生在某些時間)、局部分布控制(即其只限于植物的某些部位)或同時進(jìn)行這兩方面的控制。
本說明書中使用的植物器官的名稱都是普通蔬菜水果店和其客戶通常使用的。例如，“果實”包括蘋果或草莓植物的可食用實體部分，但這些含有種子的儲存組織并不是嚴(yán)格的植物學(xué)意義上的果實本身。
已經(jīng)提到幾乎所有的維管植物似乎都缺乏合成海藻糖的能力，所以對術(shù)語“產(chǎn)海藻糖”植物并不需要進(jìn)行定量定義。然而，似乎還沒有研究某些常規(guī)植物(而不是所謂的更蘇植物)在經(jīng)受環(huán)境壓力期間產(chǎn)生海藻糖的可能性。本發(fā)明涉及外源導(dǎo)入海藻糖合成能力(本文中也稱為“新的”海藻糖合成能力)的植物遺傳工程。與在相同條件下生長的未被轉(zhuǎn)化的植物相比，所期望的海藻糖含量的增加在于其可引起對環(huán)境壓力耐受性的有益改善，或者可以有利地從植物中提取之，以用于商業(yè)目的。
許多微生物都有產(chǎn)生海藻糖-6-磷酸(Tre6P)并進(jìn)而將其水解成海藻糖的酶系統(tǒng)。例如，啤酒酵母即具有包括56、102和123KDa亞基的海藻糖合成酶復(fù)合物(Londesborough&Vuorio(1993)Eur.J.Biochem.216，814-848)，該酶復(fù)合物首先將尿苷二磷酸葡糖(UDPG)和葡萄糖-6-磷酸(Glc6P)縮合成Tre6P(Tre6P合成酶反應(yīng))，然后再水解成游離海藻糖(Tre6Pase反應(yīng))。Tre6P合成酶和Tre6Pase活性分別存在于56和102KDa亞基中，123KDa亞基則使復(fù)合物具有調(diào)節(jié)特性并起到穩(wěn)定作用。其他微生物系統(tǒng)包括產(chǎn)朊假絲酵母(Soler at al.(1989)FEMS Microbiol Letters 61，273-278)、大腸桿菌(Glaever et al.(1988)J.Bacteriol.170，2841-2849)、盤狀網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)(Killick(1979)Arch.Biochem.Biophys.196，121-133)和包皮垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis)(Lapp et al.(1971)J.Biol.Chem.246，4567-4579)的酶系統(tǒng)，后兩個系統(tǒng)可使用腺苷二磷酸葡糖(ADPG)代替UDPG。有關(guān)后者提到的這些微生物酶系統(tǒng)之亞基結(jié)構(gòu)的資料很少。也可以推想包括線蟲、昆蟲和更蘇植物在內(nèi)的產(chǎn)生海藻糖的多細(xì)胞生物體含有聚Tre6P合成酶和Tre6Pase活性的酶。
原則上，將這些Tre6P合成酶中的任何一種轉(zhuǎn)移到植物內(nèi)，均可得到有新的合成Tre6P能力的植物。已揭示某些植物，例如煙草，具有將Tre6P轉(zhuǎn)化成海藻糖的固有能力，從而令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)用編碼Tre6P合成酶的基因轉(zhuǎn)化例如煙草即可有效地產(chǎn)生海藻糖。但如果Tre6P向海藻糖的內(nèi)源性轉(zhuǎn)化很慢或缺乏這樣的能力，則也可以轉(zhuǎn)移得自任何適當(dāng)來源的Tre6Pase。例如在使用其中Tre6P合成酶和Tre6Pase均為海藻糖合成酶之亞基的酵母酶系統(tǒng)時，用得自同一來源的Tre6P合成酶和Tre6Pase基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化可能是有利的，因為這樣便可形成天然酶復(fù)合物。不管酶的來源如何，均可提取轉(zhuǎn)基因植物中生成的海藻糖，或者可賦予植物以對某些環(huán)境壓力的更高的耐受性。已經(jīng)描述過在以這種方式用某些酵母基因轉(zhuǎn)化的植物中生產(chǎn)海藻糖的方法(PCT/FI93/00049)。
雖然可期望海藻糖在某些時間(例如在植物接觸到環(huán)境壓力期間或在成熟的植物中)或某些組織中(例如在儲存器官中，或在適當(dāng)時間于霜凍敏感性組織中)的積聚對植物有益，或者至少對植物無害，但也存在相反的可能性，即在其他時間和其他組織中海藻糖的積聚可能是對植物有害的(Veluthambi et al.(1971)，文獻(xiàn)同上)。因此，使用在植物成熟或遇到干旱和低溫等環(huán)境壓力之前不能導(dǎo)致海藻糖之基因充分表達(dá)的植物啟動子(其作為促成編碼序列轉(zhuǎn)錄之基因的一部分)將是有利的，在這種情況下海藻糖對植物的好處超過其可能對植物帶來的不利。這類非組成性植物啟動子的一些實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中包括驅(qū)動RUBISCO小亞基之光誘導(dǎo)表達(dá)的小亞基核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)啟動子(Krebbers et al.(1988)Plant Mol.Biol.11，745-759)。
公開了用正確融合到Rubisco小亞基基因啟動子上之酵母TPS1基因的編碼序列(開放閱讀框架，ORF)轉(zhuǎn)化的煙草和擬南芥屬植物。TPS1編碼酵母海藻糖合成酶的56KDa亞基。被轉(zhuǎn)化的植物是健康和可育的，并且在其葉子含有海藻糖。未被轉(zhuǎn)化的煙草和用缺少TPS1基因的相似載體轉(zhuǎn)化的煙草則不含海藻糖。已公開的轉(zhuǎn)基因植物是使用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化而得到的，但也可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中包括經(jīng)微量注射、電穿孔或顆粒轟擊以直接導(dǎo)入DNA(Gasser&Fralev(1989)Science 244，1293)。
這些被轉(zhuǎn)化的煙草植物中有一株(轉(zhuǎn)化體4)顯示出含有Tre6P合成酶活性。已經(jīng)知道，游離的56KDa亞基從酵母的完整海藻糖合成酶復(fù)合物中分離出來時是不穩(wěn)定的(Londesborough&Vuorio(1993)，文獻(xiàn)出處同上)。描述了本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的共轉(zhuǎn)化植物的方法，即使用處于植物啟動子，例如ats1A啟動子或某些組成性便利啟動子控制下的TPS1基因和其他酵母海藻糖合成酶基因(TPS2和TSL1)之一或兩者進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。由于由TPS2和TSL1編碼的亞基可穩(wěn)定56KDa亞基，所以與只含有TPS1的植物相比，這種共轉(zhuǎn)化可增加植物的海藻糖含量。
在用處于可誘導(dǎo)的啟動子控制下的Tre6P合成酶基因與處于組成性啟動子控制下的Tre6Pase或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(例如TSL1產(chǎn)物)的一個或多個基因共轉(zhuǎn)化的植物中，由于Tre6P合成酶催化海藻糖生物合成的第一個唯一步驟，所以其中海藻糖的產(chǎn)生將受到可誘導(dǎo)性啟動子的調(diào)節(jié)。
公開了被轉(zhuǎn)化的產(chǎn)海藻糖煙草植物被證明具有提高干旱耐受性。這一點(diǎn)通過用離體的葉片和全植株進(jìn)行的實驗得以證實。成熟的植物和轉(zhuǎn)化株自花授粉之子代的幼小籽苗表現(xiàn)有改善的干旱耐受性。在這些子代中，如根據(jù)子代的綠色組織中存在52KDa Tre6P合成酶亞基所表明的，干旱耐受性與TPS1+特性共分離。
已公開的轉(zhuǎn)基因植物對水環(huán)境壓力的耐受性是令人驚奇的，因為存在于其組織中的海藻糖的量實在太小以致難以對細(xì)胞內(nèi)容物提供滲透緩沖作用?？赡苁呛Ｔ逄峭ㄟ^保護(hù)特異性部位例如膜而起作用，或者可能是海藻糖或其前體(Tre6P)擾亂了植物的代謝而阻止細(xì)胞發(fā)生對這種壓力的次級改變。
公開了見于含嵌合TPS1基因之初級轉(zhuǎn)化株中的輕微形態(tài)學(xué)改變，例如小刀形葉，主要在仍產(chǎn)生海藻糖的子代中消失的降低了頂尖生長優(yōu)勢和減低了植株高度。這些改變似乎主要是由于組織培養(yǎng)而人工造成的。但在最適條件下生長8周后，包括自花傳粉的子代在內(nèi)的產(chǎn)海藻糖煙草植物生長均有所減慢，較對照植物遲后1至2周。這表明在植物中合成海藻糖即使是處于ats1A啟動子的控制下，也可以延緩生長。因此，可以使用環(huán)境壓力誘導(dǎo)的啟動子入LT178(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)以進(jìn)一步有利于在非環(huán)境壓力條件下保持植物的正常生長速率和產(chǎn)率，但同時如實施例5中所解釋的，尚可在壓力條件下提供海藻糖誘導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制。
雖然只用編碼Tre6P合成酶的酵母TPS1基因而不用編碼Tre6Pase的TPS2基因轉(zhuǎn)化植物，但這些轉(zhuǎn)基因植物仍合成海藻糖。由此可見，某些植物具有將Tre6P轉(zhuǎn)變成海藻糖的內(nèi)源性能力。在某些情況下用例如編碼Tre6Pase的TPS2基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，以提高Tre6P向海藻糖轉(zhuǎn)化的速率也是可行的。再者，用得自酵母以外之生物體的Tre6P合成酶(和Tre6Pase)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化顯然可以得到相似的結(jié)果。這些基因許多都是與TPS1(和TPS2)同源的，并且可以使用或衍生于酵母系統(tǒng)之酶和基因的免疫學(xué)和寡核苷酸探針很容易地克隆之。例如，已報導(dǎo)來自包皮垢分支桿菌的Tre6P合成酶是一種可與抗純化的酵母海藻糖合成酶56KDaTre6P合成酶亞基的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)的約55KDa多肽。公開了包皮垢分支桿菌Tre6P酶之胰酶解肽的氨基酸序列，揭示出其與酵母酶的密切序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地使用這些手段從許多生物體中克隆Tre6P合成酶和Tre6Pase的基因。本發(fā)明包括用得自任何實用生物體的并融合到適當(dāng)?shù)闹参飭幼由系腡re6P合成酶和Tre6Pase基因轉(zhuǎn)化植物。
可按幾種方式使用以一個或多個海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)化植物所得到的含海藻糖植物。例如，可以在商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上從植物中提取海藻糖。這些海藻糖能夠以足夠便宜的價格大批量應(yīng)用，如用于在干燥期間保持食品原料的風(fēng)味和結(jié)構(gòu)。為了這一應(yīng)用目的，海藻糖最好是積聚在儲存器官中，例如馬鈴薯的塊莖、糖甜菜或蕪菁的根或洋蔥的鱗莖中。已描述了轉(zhuǎn)化這些舉例的植物及許多其他農(nóng)作物植物的方法(Lindsey(1992)J.Biotechnol.26，1-28)，但本發(fā)明不只限于這些分子生物學(xué)家經(jīng)常用來作為實驗?zāi)Ｐ偷闹参?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將發(fā)展模型植物的方法應(yīng)用于其他植物。因此，也可以在例如被轉(zhuǎn)化的甘蔗莖或葉或香蕉的果實中實現(xiàn)本發(fā)明。致使在儲藏器官中特異性表達(dá)的植物啟動子是本領(lǐng)域已知的(例如patatin啟動子)。在本發(fā)明一個方面，將Tre6P合成酶基因例如TPS1的編碼序列以如TPS1編碼序列融合到ats1A啟動子上的同樣方式融合到這樣的啟動子上，并用這些DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)闹参?。然后提取在儲藏器官中積聚的海藻糖。
在本發(fā)明的另一個方面，在植物組織中積聚的海藻糖可改善收獲后的儲藏特性。因此，被轉(zhuǎn)化煙草的離體葉片水分散失比未被轉(zhuǎn)化的煙草更慢，甚至在丟失水分后也不會逐漸褪色(圖5)。這個方面的優(yōu)點(diǎn)可適用于食用植物及觀賞植物。就可食植物而言，特別是對于零售市場各種商品生菜類植物于收獲后出現(xiàn)的枯萎和褪色將帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。損失最后被加在消費(fèi)者身上。產(chǎn)海藻糖生菜將為消費(fèi)者提供更便宜和更吸引人的沙拉。相似的考慮也涉及其他一些食用植物，特別是葉用產(chǎn)品例如甘藍(lán)、嫩莖花椰菜、蒔蘿、菠菜或荷蘭芹及其他綠色蔬菜如豌豆和紅花菜豆。許多觀賞植物如玫瑰、郁金香、黃水仙等都是在切下后運(yùn)輸?shù)?。既使用高成本運(yùn)輸方式(冷藏、空運(yùn))也會失去較多水分。較好地保留其水分含量并且對褪色的敏感性較小的產(chǎn)海藻糖觀賞植物則以較低價格為消費(fèi)者提供更喜愛的產(chǎn)品。在本發(fā)明的這個方面，Tre6P合成酶基因融合到所選用的植物啟動子上，從而使海藻積聚在待收獲的植物部分中。例如，ats1A啟動子使Tre6P合成酶在煙草的葉、上部莖及花芽中表達(dá)，并且使海藻糖積聚在這些部位中。但本發(fā)明人揭示，煙草等植物可將海藻糖從其合成部位運(yùn)輸?shù)讲⒉缓铣珊Ｔ逄堑慕M織中。因此，雖然非組成性ats1A啟動子并不能使Tre6P合成酶在根中表達(dá)，但在這些轉(zhuǎn)基因煙草植物的根中也可見到小量的海藻糖。
在本發(fā)明的一個相關(guān)方面中，含有海藻糖的轉(zhuǎn)化植物的可食部分如番茄、漿果及其他果實，由于含有海藻糖，所以可被加工成更新鮮更富有風(fēng)味的果泥、糊、果凍和果醬。已顯示(WO89/00012)向這些食品原料中加入海藻糖可有利于保存其風(fēng)味，特別是在進(jìn)行包括干燥步驟的加工時。本發(fā)明通過提供已含有海藻糖的植物而不必再加入海藻糖。在本發(fā)明的這個方面，使用指導(dǎo)海藻糖主要在把植物的儲藏器官中合成的啟動子例如patatin啟動子可能是有益的。
本發(fā)明公開的產(chǎn)生海藻糖的轉(zhuǎn)化煙草提高了對干旱的耐受性。一般說來，含有海藻糖的被轉(zhuǎn)化植物對干旱、霜凍、高鹽及其他環(huán)境壓力可以比未被轉(zhuǎn)化的植物有更大的抗性。因此，干旱、霜凍和滲透壓力基本上都因從細(xì)胞內(nèi)排出水分，損傷細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)而破壞植物，已知海藻糖會在體外減緩這些損害(Crowe et al.(1992)Annu.Rev.Physiol.54，579)。在本發(fā)明的這個方面，所使用的植物啟動子可以是環(huán)境壓力誘導(dǎo)的啟動子。這樣的啟動子是本領(lǐng)域中已知的，例如有LTI78(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&PalVa(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)。使用這些啟動子將防止在尚不需要合成時合成海藻糖。對于生長良好而又含有海藻糖的植物來說，可以不需要壓力誘導(dǎo)的啟動子來實現(xiàn)本發(fā)明的這個方面。但是使用壓力誘導(dǎo)的啟動子防止在有所需要前合成海藻糖還有另外一些優(yōu)點(diǎn)，其中包括避免應(yīng)按其他方式轉(zhuǎn)換光合成能力來合成海藻糖所造成的產(chǎn)量損失，并且避免如攜帶pats1A-TPS1嵌合體之煙草所出現(xiàn)生長延遲。這個方面的優(yōu)點(diǎn)不僅可用于食用植物，而且也可用于在花園或室內(nèi)展示的觀賞植物。被轉(zhuǎn)化的壓力耐受性觀賞植物只需要比相應(yīng)的未被轉(zhuǎn)化植物較少的照護(hù)。致使在初始轉(zhuǎn)化株中觀察到的某些產(chǎn)海藻糖植物生長較慢和很小的形態(tài)學(xué)改變并不是觀賞植物的缺點(diǎn)特別是對于室內(nèi)觀賞植物來說，生長較慢和新的外觀可能是具有吸引力的特征。
在本發(fā)明的另一個方面，Tre6P合成酶基因被適當(dāng)?shù)厝诤系接龅教厥馐录颦h(huán)境條件(例如干旱或寒凍壓力)時得以被激活的植物啟動子(例如LTI78或RAB18)上，從而可促進(jìn)植物積聚商業(yè)上可提取量海藻糖的過程發(fā)生在收獲前不久的成熟植物中，以避免海藻糖對某些植物之早期發(fā)育過程的任何不利影響。
基于如上的公開，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是玉米、燕麥、粟、小麥、稻米、大麥、高粱、莧菜、洋蔥、蘆筍或甘蔗等單子葉植物，或苜蓿、大豆、矮牽牛花、棉花、甜菜、向日葵、胡蘿卜、芹菜、甘藍(lán)、黃瓜、胡椒、番茄、馬鈴薯、小扁豆、亞麻、嫩莖花椰菜、煙草、菜豆、萵苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘藍(lán)、洋薊、豌豆、秋葵、南瓜、散葉甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、茶或咖啡等雙子葉植物。
酵母基因TPS1和其表達(dá)產(chǎn)物是煙草的生物化學(xué)機(jī)制相適應(yīng)的基因得以高表達(dá)并且56KDa亞基導(dǎo)致海藻糖的顯現(xiàn)。但本領(lǐng)域已知的是，與例如微生物相比植物基因常常有較低的A+T比例，并且可通過改變密碼子使用，特別是改變靠近編碼序列開始部分的密碼子使之成為見于植物中的密碼子來提高異源基因在植物中的表達(dá)水平(Perlak et al.(1991)88，3324-3328)。我們設(shè)想對基因進(jìn)行這些和相似的修飾可適用于本發(fā)明。
已知在基因中發(fā)生天然突變。DNA序列中的這些改變及其他人工改變可導(dǎo)致所編碼之多肽的氨基酸序列改變。本文所使用的術(shù)語“TPS1”(或TPS2或TSL1)包括所有與TPS1(或TPS2或TSL1)同源的DNA序列，后者編碼具有酵母海藻糖合成酶56KDa(或102KDa或123KDa)亞基之預(yù)期功能或結(jié)構(gòu)特征的多肽。同樣，術(shù)語“編碼Tre6P合成酶(或Tre6Pase或調(diào)節(jié)性多肽)的基因”不僅包括可從天然生物體中很容易分離(例如使用根據(jù)TPS1或TPS2或TSL1的已知序列設(shè)計的核苷酸探針)的基因，而且包括天然或人工變異體，這些變異體編碼的多肽與原始分離的基因編碼的多肽有相同功能和結(jié)構(gòu)特征。
實施例一般材料和方法材料。所使用的植物是Nicotiana tabacum cv.SR1和Arabidopsisthaliana L.Heynh.生態(tài)型C-24。
從Vuorio等人((1993)Eur.J.Biochem.216，849-861)所述的質(zhì)粒pALK752和pALK754中得到編碼海藻糖合成酶之56KDa Tre6P合成酶亞基的酵母基因TPS1(以前稱為TSS1)和編碼海藻糖合成酶之123KDa調(diào)節(jié)亞基的TSL1。酵母基因TPS2得自由Drs Claudio De Virgilio和Andres Wiemken(Botaniches Institut der Universitt Basel，Switzerland)提供的并含有克隆到質(zhì)粒YCplac111之SacI位點(diǎn)中的TPS2基因的質(zhì)粒。該基因(如Virgilio er al.(1993)Eur.J.Biochem.212，315-323所描述的)編碼如Vuorio等人(1993，文獻(xiàn)出處同上)的表1中所示的衍生于102KDa亞基的氨基酸序列。所制備的抗血清為抗酵母海藻糖合成酶的抗血清(抗TPS/P)和抗56KDa亞基的抗血清(抗57K)，通用生物化學(xué)方法參見Vuorio等人的上述文獻(xiàn)。液泡海藻糖酶是按照Londesborough和Varimo((1984)Biochem.J.219，511-518)所述的方法從suc-gal-mel-mal-酵母菌株(ALKO2967)中部分純化的，并且它不能水解蔗糖、麥芽糖及密二糖。
DNA操作。所有的DNA操作均按照已建立的實驗室方法(Sambrooket al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork)進(jìn)行。使用大腸桿菌菌株DH5α和MC1061進(jìn)行質(zhì)粒制備。用于控制TPS1表達(dá)的啟動子來自A.thaliana的編碼Rubisco之小亞基的ats1A基因(Krebbers et al.(1988)，文獻(xiàn)出處同上)。
為了構(gòu)建ats1A-TPS1基因嵌合體，經(jīng)PCR從質(zhì)粒pGSFR401擴(kuò)增缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)肽之編碼序列的ats1A啟動子片段。使用合成的寡核苷酸引物在擴(kuò)增之片段的5′端造成一個EcoRI位點(diǎn)并在3′端造成一個XbaI位點(diǎn)。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶疨CR擴(kuò)增產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠上純化后連接到用EcoRI和MluI消化的pUC19質(zhì)粒中。從上述的質(zhì)粒pALK752中擴(kuò)增酵母TPS1基因。所得到的片段即含有5′MluI酶切位點(diǎn)及3′XbaI酶切位點(diǎn)。經(jīng)酶消化和瓊脂糖膠純化后將所得片段連接到pUC19中pats1A的后面。用EcoRI和XbaI切割帶有啟動子-TPS1構(gòu)建體的片段，然后將其插入到pBluescript II SK+(Stratagene)衍生質(zhì)粒中，其中該衍生質(zhì)粒攜帶有包括其聚腺苷酸化信號和T-DNA右側(cè)邊緣之T-DNA基因GF的3′末端。最后，將整個嵌合基因作為EcoRI-SacI片段插入到嵌合有選擇性標(biāo)記卡那霉素抗性基因pNOS-NEO-3′OCS的載體pDE1001(Denecke et al.(1992)EMBO J.11，2345-2355)中。這樣得到的質(zhì)粒pKOH51攜帶有嵌合的pats1A-TPS1-3′GF基因。通過轉(zhuǎn)化將所得構(gòu)建體轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5α中，然后經(jīng)電穿孔(Dower，Miller&Ragsdale(1988)Nucl.Acids Res.16，6127-6145)將其轉(zhuǎn)移到含有非致癌性Ti質(zhì)粒pGV2260(Deblare et al.(1995)Nucl.Acids Res.13，2777-2788)的根瘤農(nóng)桿菌(C58C1rifR)中。
以相似方法制得其他構(gòu)建體。
植物材料的生長。為了進(jìn)行純性培養(yǎng)，將經(jīng)過滅菌的Nicotiana tabacum(SR1)的外植體植于含有添加了2％蔗糖的MS(Murashige&Skoog(1962)Physiol.Plant 15，473-497)固體培養(yǎng)基(SM-2)的玻璃罐中。然后將這些罐放在控制培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室中，使植物于22℃光照生長16小時。按時將外植體移至新的加有MS-2培養(yǎng)基的罐中繼續(xù)培養(yǎng)純性材料。使溫室植物生長于盒內(nèi)的土壤中并每天灑水。首先按上述培養(yǎng)煙草的方法使被轉(zhuǎn)化的A.thaliana植物在受控制的環(huán)境中于小型食物罐內(nèi)純性生長，然后轉(zhuǎn)移到溫室內(nèi)，使之在盛有土壤的盆中產(chǎn)生種子。將由初始轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的種子直接植入土壤中產(chǎn)生新的種子，或者經(jīng)表面滅菌后使之在24孔組織培養(yǎng)板上純性生長，以進(jìn)行分子分析。
植物轉(zhuǎn)化。按照下述方法用被切下的煙草葉和A.thaliana的根轉(zhuǎn)化煙草和A.thaliana。基本上按照Valvekens等人((1988)Proc.Natl.Acad.Sci，USA，85，5536-5540)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)，但對方法作了如下改動。將分離的根或葉在愈傷組織誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基(CIM)上預(yù)培養(yǎng)4天，將根切成小段(1-2mm)并將葉切成較大的碎片(10-20mm)，然后移入20ml CIM液體培養(yǎng)基中。加入3′，5′-二甲氧基-4′-羥基乙酰苯(0.2mg/L)后進(jìn)行農(nóng)桿菌(C58C1 rifR)感染。將用于感染的細(xì)菌加在含有適當(dāng)抗生素的YEβ培養(yǎng)基(Vervliet et al.(1975)J.Gen.Virol.26，33-48)中28℃增殖過夜，并離心收集之。然后將細(xì)菌沉淀物重新懸浮在10mM MgSO4中，加至植物組織中并輕輕混合約15分鐘。倒掉過量的液體并將根轉(zhuǎn)印在無菌濾紙上。在固體CIM上共培養(yǎng)2天后，用液體CIM將植物組織淋洗3-4次以洗掉細(xì)菌，并轉(zhuǎn)移到選擇的生芽培養(yǎng)基(SIM)上。生長7天后，將形態(tài)發(fā)生分化的外植體部分轉(zhuǎn)移到新鮮SIM中。
提取蛋白質(zhì)用以Westem分析。在含有100μl蛋白質(zhì)提取緩沖液(50mM Tris/HCl pH7.2，250mM蔗糖、5mM EDTA、10mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM β-巰基乙醇、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、30μM胃酶抑制劑、50μM亮抑蛋白酶肽和15μM抑蛋白酶肽)的1.5ml微量離心管中，用玻璃勻漿100-200mg鮮重的植物樣品。經(jīng)兩次離心(13,000g，10分鐘)除去不溶性材料。按照Bradford((1976)Anal.Biochem.72，248-254)的方法，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將等量的可溶性蛋白質(zhì)加于SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)研究。
SDS-PAGE和免疫學(xué)技術(shù)。以SDS-PAGE法(Laemmli(1970)Nature 227，680-685)分離蛋白質(zhì)。為了檢測蛋白質(zhì)，用抗57的抗血清(1/1000稀釋)和偶聯(lián)了堿性磷酸酶的抗兔第二抗體進(jìn)行免疫印跡分析。為了進(jìn)行Western印跡反應(yīng)，將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上并用加在5％乙酸中的0.5％麗春紅(Ponceau Red)染色，以確保有相等的上樣量并且已轉(zhuǎn)移成功。然后用5％脫脂干奶粉封閉濾膜，并用標(biāo)準(zhǔn)方法探查和染色。
Tre6P合成酶檢測法。稱取約500mg冷凍的植物材料，然后在固態(tài)CO2上用研缽和研杵將其研磨成細(xì)粉末。將粉末轉(zhuǎn)移到0.7ml含有1mM芐脒、2mM MgCl2、1mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇(其中還含有1mM PMSF和各10μg/ml胃酶抑制劑A和亮抑蛋白酶肽)的50mMHEPES/KOH(pH7.0)(HBMED)中，并使之逐漸溶解。以17,000×g將所得勻漿液離心10分鐘并基本上按照Lapp等人((1971)J.Biol.Chem.246，4567-4579)所述的方法檢測上清液中的Tre6P合成酶。將樣品(10μl)加到90μl含有40mM HEPES/KOH(pH7.0)、10mMMgCl2、10mM葡萄糖-6-磷酸、5mM果糖-6-磷酸、5mM尿苷二磷酸葡糖(UDPG)和1mg/ml牛血清白蛋白的反應(yīng)混合物中，并于30℃保溫所需的時間。到2分鐘時加熱至100℃終止反應(yīng)。加入50μl 0.6M HCl并于100℃加熱5分鐘，然后加入50μl 8％NaOH并于100℃加熱15分鐘，以破壞除海藻糖和海藻糖-6-磷酸外的糖衍生物(包括所生成的蔗糖)。然后用蒽酮檢測法(Trevelyan&Harrison(1956)Biochem.J.63，23-33)檢測保留的碳水化合物(即海藻糖和海藻糖-6-磷酸)。
海藻糖檢測法?？焖俜Q量約500mg冷凍的植物材料加到玻璃試管中。加入熱蒸餾水后將混合物煮沸20分鐘，用圓頭玻璃棒將葉子搗碎。用吸管收獲液相并用0.5ml水再次提取固形物。離心澄清合并的液相。于107℃干燥合并的固態(tài)殘留物使之達(dá)到恒重(葉子的干重平均為鮮重的5.1％)。使用配有Dionex脈沖電化學(xué)檢測器(PED-2)的DionexDX-300液相層析儀分析上清液。通過Carbopac PA-1(4×50mm)前置柱將樣品(20μl；一式三份)注射到Carbopac PA-1(4×250mm)柱上并以1ml/分鐘的流速用水洗脫。將洗脫物與后置柱試劑(流速為0.6ml/分鐘的0.3M NaOH)混合。海藻糖出現(xiàn)在約3分鐘時，遠(yuǎn)在約20分鐘時出現(xiàn)的葡萄糖和蔗糖峰之前。實施例1用處于ats1A啟動子控制下的酵母TPS1基因轉(zhuǎn)化煙草植物并由之產(chǎn)生海藻糖使煙草轉(zhuǎn)化株和對照植物生長于無菌的“試管內(nèi)”條件下和溫室中。與未被轉(zhuǎn)化的對照組和用載體pDE1001(缺少TPS1)轉(zhuǎn)化的對照組相比，成熟的轉(zhuǎn)化株沒有明顯的表型改變。于0900小時收集葉片、冷凍并儲存于-70℃或-70℃以下備分析時使用。
試驗了26個卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化株，結(jié)果當(dāng)用抗純化的酵母海藻糖合成酶56 KDa Tre6P合成酶亞基的抗血清探查時，發(fā)現(xiàn)有20株產(chǎn)生可檢測水平有預(yù)期大小的免疫反應(yīng)性多肽。實例示于圖2中。表1中總結(jié)了葉片的海藻糖含量。
表1 煙草之TPS1轉(zhuǎn)化株的海藻糖含量煙草植株 特殊處理海藻糖(mg/新鮮葉)試管內(nèi)植株未被轉(zhuǎn)化的SR1 - ≤0.002pDE1001對照- ≤0.002轉(zhuǎn)化株1 - 0.02轉(zhuǎn)化株3 - 0.009轉(zhuǎn)化株4 - 0.067轉(zhuǎn)化株8 - 0.075轉(zhuǎn)化株8 乙醇提取代替水提取 0.055溫室植株pDE1001對照 - ≤0.002轉(zhuǎn)化株1 - 0.16轉(zhuǎn)化株4 - 0.16轉(zhuǎn)化株4 堿性磷酸酶a0.13轉(zhuǎn)化株5 - 0.052轉(zhuǎn)化株6 - 0.044轉(zhuǎn)化株8 - 0.039轉(zhuǎn)化株8 特異性海藻糖0.021轉(zhuǎn)化株19 - 0.053轉(zhuǎn)化株19 堿性磷酸酶a0.060轉(zhuǎn)化株19 特異性海藻糖0.016轉(zhuǎn)化株25 - 0.036轉(zhuǎn)化株26 - 0.11a在使載體[14C]海藻糖-6-磷酸去磷酸化的條件下用堿性磷酸酶處理提取物。
這些結(jié)果揭示，當(dāng)酵母TPS1基因的啟動子被ats1A啟動子取代時，其可在煙草中得以有效地表達(dá)。在Westem印跡上觀察到的特定信號具有正確的分子量。加到凝膠上的每單位蛋白質(zhì)的最強(qiáng)信號(例如得自生長于試管內(nèi)的轉(zhuǎn)化株4的信號)只比得自靜止期酵母的信號稍弱些。TPS1的表達(dá)伴隨葉組織中出現(xiàn)海藻糖，后者則是根據(jù)其HPLC行為和它可被高特異性海藻糖酶降解而認(rèn)定的(也參見圖3)。基于尚未明確的原因，不同的轉(zhuǎn)化株以不同的水平表達(dá)TPS1產(chǎn)物，并且(就轉(zhuǎn)化株8的表觀表達(dá)來說)見于葉片中的海藻糖量大致與Western印跡中的56KDa信號的強(qiáng)度相關(guān)(比較圖2和表1)。雖然這些轉(zhuǎn)化株并不攜帶編碼重組Tre6Pase的基因，但并沒有證據(jù)表明植物中積聚了比海藻糖更多的TreP。很明顯，煙草具有能夠?qū)re6P轉(zhuǎn)變成海藻糖的磷酸酶，表明至少對于這種植物來說為導(dǎo)入海藻糖合成途徑所必需的關(guān)鍵酶是Tre6P合成酶，并且盡管不一定是最佳的，單獨(dú)導(dǎo)入該酶也是足夠的。
檢測56KDa Tre6P合成酶亞基在轉(zhuǎn)基因植物系4中的組織分別顯示，可在除植物下部莖和根以外所有綠色部分中見有相當(dāng)量的這種多肽(參見圖4)。這一分布是與ats1A基因表達(dá)的組織特異性相符合的(DeAlmeida et al.(1989)Mol.Gen.Genet.218，78)。圖4也顯示表達(dá)Tre6P合成酶的組織中也含有海藻糖。此外，在根中可見有較小量的海藻糖，表明轉(zhuǎn)基因煙草可從其合成部位向其他組織輸送海藻糖。
結(jié)果還揭示，表達(dá)處于ats1A啟動子控制下的TPS1并在光照期間在其綠色組織中積聚海藻糖的煙草植物是健康的并且外觀是正常的。雖然含有嵌合TPS1基因的初始轉(zhuǎn)化株有某些小的形態(tài)學(xué)改變，例如呈現(xiàn)小刀形葉片、降低了頂端優(yōu)勢并減低了高度(見圖5和6)，但大多數(shù)改變并沒有出現(xiàn)于仍產(chǎn)生海藻糖的自花授粉的TPS1陽性子代中。因此，初始轉(zhuǎn)化株的形態(tài)學(xué)改變似乎是因組織培養(yǎng)而人為造成的，而不是因產(chǎn)生海藻糖造成的。但與未被轉(zhuǎn)化的對照組相比，產(chǎn)生高水平Tre6P合成酶亞基并存在海藻糖沒有致使轉(zhuǎn)基因植物在正常條件下的生長速度明顯(20～50％)降低。這些轉(zhuǎn)基因植物的顯然正常的表型與已報導(dǎo)的外源加入海藻糖對某些植物的毒性相反(Veluthambi et al.(1981)，文獻(xiàn)出處同上)。這些結(jié)果揭示，雖然在sts1A啟動子控制下于植物內(nèi)產(chǎn)生海藻糖可能使植物的生長速度有些減慢，但對煙草植物并沒有毒性。可使用由干旱或寒冷等特定過程激發(fā)的可誘導(dǎo)性啟動子，通過只在需要時才引起海藻糖產(chǎn)生來盡可能地減小生長速度的降低。
基于蛋白質(zhì)含量，表1中所示的最好轉(zhuǎn)化株的海藻糖含量(例如≥16mg/g轉(zhuǎn)化株4的蛋白質(zhì))已經(jīng)是在酵母中觀察到的使熱耐受性有明確改善之含量水平的至少20％(De Virgilio et al.(1990)FEBS Letters273，107-110)。
檢測某些TPS1轉(zhuǎn)化株和對照植物中的Tre6P合成酶活性。表2中所示的結(jié)果是從一式兩份0和15或30分鐘檢測所得到的平均值±最大范圍。就對照組來說，Tre6P合成酶活性幾乎等于零。就轉(zhuǎn)化株4來說，在UDPG和G1c6P存在下積聚了酸和堿穩(wěn)定性碳水化合物。這種積聚需要G1c6P，但不需要6-磷酸果糖(Fru6P；該磷酸己糖激活酵母的天然海藻糖合成酶復(fù)合物)，并且當(dāng)用ADPG代替UDPG時可抑制這種積聚(從酵母中純化的酶也不能使用ADPG)。因為其他可能的產(chǎn)物均被水解破壞，所推測其中積聚的碳水化合物是海藻糖或Tre6P。因此，在這些體外檢測條件下，由轉(zhuǎn)化株4的提取物合成Tre6P要比將其轉(zhuǎn)變成海藻糖更快。這表明可以用編碼Tre6Pase亞基的TPS2共轉(zhuǎn)化來增加葉子中海藻糖合成的總速率。
用表2中所示方法測知的酵母提取物的Tre6P合成酶活性與按Londesborough和Vuorio((1991)J.Gen.Microbiol.137，323-330)所述檢測UDP出現(xiàn)的方法測知的活性相一致。此外，在煙草植物提取物存在下檢測的酵母提取物沒有受到抑制。因此，表2中對照植物沒有測得活性并不是由于受煙草植物中所存在的某些因子的干擾所致。
表2 TPS1轉(zhuǎn)化的煙草葉和對照組煙草葉的Tre6P合成酶活性(所有結(jié)果都是用在無菌條件下試管內(nèi)生長的植物得到的)轉(zhuǎn)化株 檢測混合物 Tre6P合成酶活性(mU/g新鮮葉)15min 30min未被轉(zhuǎn)化的對照組全部 3±47 3±21PDE1001對照組 全部22±35 7±8轉(zhuǎn)化株4，實驗1 全部 259±147 60±6轉(zhuǎn)化株4，實驗2 全部 128±39 155±22較少Glc6P 12±19-1±12較少Fru6P 153±10 144±3ADPG代替UDPG 0±52 4±21
見于轉(zhuǎn)化株4中的Tre6P合成酶活性是不穩(wěn)定的。某些提取物在冰上存放幾個小時活性便會消失。但見于Western分析中的特異性帶仍以其差不多原有的強(qiáng)度存在于室溫下儲存了24小時的提取物中。因此，有可能是在煙草提取物的儲存期間發(fā)生了Tre6P合成酶亞基構(gòu)象的改變。這些結(jié)果表明，可同時用TPS1和一個或多個酵母海藻糖合成酶的其他亞基基因轉(zhuǎn)化煙草，以提高Tre6P合成酶亞基的構(gòu)象穩(wěn)定性，從而達(dá)到提高Tre6P合成酶活性的目的。實施例2轉(zhuǎn)基因Arabidopsis thaliana以上述構(gòu)建煙草轉(zhuǎn)化株的同樣方法構(gòu)建含有處于ats1A啟動子控制下之TPS1的A.thaliana植物。這些被轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植物也是健康的并有正常的外觀，而且產(chǎn)生了能育的種子。對從初始轉(zhuǎn)化株的種子長出的植物進(jìn)行Western分析，顯示它們含有酵母海藻糖合成酶的56KDa亞基(圖10)。顯然可以預(yù)略的是，這些植物可在其綠色組織中積聚海藻糖。實施例3產(chǎn)海藻糖煙草植物的干旱抗性為了檢測是否轉(zhuǎn)基因煙草中所產(chǎn)生之海藻糖的量足以提高它們的干旱耐受性，對試管內(nèi)增殖的對照組和轉(zhuǎn)基因系植物的離體葉片進(jìn)行風(fēng)干(25％相對濕度，RH)(圖5)。對照植物的離體葉片迅速丟失水分并在施加環(huán)境壓力3小時后顯示出變?yōu)楹稚恼飨螅a(chǎn)海藻糖植物的葉片在長達(dá)24小時后仍呈綠色，同時明顯降低了水分丟失。因此，海藻糖的保護(hù)作用看來是兩方面的首先，合成海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物的離體葉片似乎最初就有改善了的保水作用。只是在延長了干燥處理后產(chǎn)海藻糖植物和對照組植物之間的這種差異才消失。第二，對照組葉片表現(xiàn)出明確的標(biāo)志和變褐色的征象。相反，含海藻糖植物的葉片只是24小時后仍呈綠色，并且只有在延長干燥環(huán)境下的暴露時間后(例如幾天)才出現(xiàn)變褐色的征象。甚至在同樣水含量情況下產(chǎn)海藻糖植物和對照植物之間也有清楚可見的差異。因此，海藻糖似乎可阻止植物組織遭受脫水的影響，并且可降低水分丟失的速度。葉片變褐色的一部分原因可能是由于Maillard反應(yīng)所致，即其中還原糖與多肽的游離氨基及產(chǎn)生褐顏色的氨基酸反應(yīng)。銀非還原糖海藻糖并不參與該反應(yīng)，甚至抑制其他糖與蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)(Roser&Colaco(1993)，New Sciennist 1973，24)。
海藻糖保護(hù)被切下的葉子免受干旱損傷表明海藻糖既使在完整植物水平上也可能有相似的作用。為了估測是否海藻糖能夠提高完整植物的干旱耐受性，我們使試管內(nèi)增殖的完整植物暴露于風(fēng)干條件下(30％RH，圖6A)。在3至4小時內(nèi)對照植物失去充盈狀態(tài)并出現(xiàn)萎蔫。相反，產(chǎn)海藻糖的基因植物在經(jīng)過長時間風(fēng)干后只顯示出充盈狀態(tài)喪失的征象。干燥處理17小時之后，使植物重新水化并記錄植物的存活率(圖6A)。未被轉(zhuǎn)化的對照植物既使在長時間重新水化后仍沒有恢復(fù)，因而經(jīng)此處理后未能存活。相反，產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物系雖然明顯萎蔫并且丟失了大部分組織水分(降至鮮重的30％)，但干燥17小時后卻仍然存活。
幼小籽苗也表現(xiàn)有提高的干旱存活性(圖6B)。將轉(zhuǎn)基因系8產(chǎn)生的3周令籽苗連同未被轉(zhuǎn)化的和載體轉(zhuǎn)化的對照籽苗一起暴露于風(fēng)干條件(50％RH)下，證明產(chǎn)海藻糖植物和對照植物間在干旱耐受性上存在明顯的差異。與對照植物相比，轉(zhuǎn)基因的海藻糖陽性系8顯示出延遲的充盈狀態(tài)丟失和在脫水環(huán)境壓力下的較高存活性(圖6B)。實施例4由編碼Tre6P合成酶和一個或多個編碼Tre6Pase或調(diào)節(jié)性多肽的基因共轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生海藻糖本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備含有處于ats1A啟動子控制下的酵母TPS2和TSL1基因之編碼序列的載體，并按“一般材料和方法”及實施例1中所述的方法用它們轉(zhuǎn)化煙草、擬南芥及其他植物。為了得到同時用TPS1和其他基因即TPS1和TSL1之一或兩者轉(zhuǎn)化的植物，可以使個別轉(zhuǎn)化株相互雜交，或用第二個基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)化一株已被轉(zhuǎn)化的植物，或者用含有連接到適當(dāng)啟動子上之兩個或三個基因的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化例如，可將TPS1連接到非組成性ats1A啟動子上以在海藻糖合成過程中提供控制作用，并由組成性啟動子驅(qū)動其他基因的表達(dá)。
預(yù)期受控制的酵母海藻糖合成酶復(fù)合物之兩個或多個亞基(至少一個是56 KDa亞基)基因的表達(dá)將導(dǎo)致海藻糖在植物綠色組織中積聚量的增加，因為其他基因的存在將使56KDa亞基得以穩(wěn)定化。此外，導(dǎo)入102KDa Tre6Pase亞基將是有利的，因為當(dāng)Tre6P合成酶亞基的穩(wěn)定性增加時，可望它將降低Tre6P的潛在積聚量。
很顯然，對于這種類型的構(gòu)建來說，可以用某些其他Tre6P合成酶結(jié)構(gòu)基因的編碼序列取代TPS1的編碼序列，用某些其他Tre6Pase基因的編碼序列取代TPS2序列并用某些其他編碼對Tre6P合成酶和Tre6Pase賦予調(diào)節(jié)性質(zhì)或穩(wěn)定性之基因的編碼序列取代TSL1序列，其中所采取的方式如同由TSL1產(chǎn)物對天然酵母海藻糖合成酶賦予這些性質(zhì)一樣。實施例5用處于環(huán)境壓力誘導(dǎo)的啟動子控制下的Tre6P合成酶基因轉(zhuǎn)化植物已知例如LTI78(Nordin et al.(1993)PlantMol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&Palva(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)等植物啟動子是在對干旱和寒冷壓力的反應(yīng)中被誘導(dǎo)的。單獨(dú)用處于這些壓力誘導(dǎo)的啟動子控制下的Tre6P合成酶基因如TPS1的編碼序列，或者連同處于常規(guī)植物啟動子控制下的Tre6Pase或調(diào)節(jié)肽或兩者的基因一起轉(zhuǎn)化煙草、擬南芥屬植物或其他植物，可使海藻糖在植物組織中的積聚只在對這些環(huán)境壓力發(fā)生反應(yīng)時出現(xiàn)。這樣，優(yōu)點(diǎn)在于只有(1)當(dāng)植物偶然暴露于環(huán)境壓力時(由海藻糖提供保護(hù)作用，然后克服任何不利影響)，或者(2)當(dāng)植物預(yù)先有準(zhǔn)備地暴露于環(huán)境壓力時才引起海藻糖的積聚，然后再從收獲的植物中提取海藻糖，這樣就可能避免不同量的海藻糖對某些植物的某些組織帶來的不利影響，以及光合合成能力向產(chǎn)率降低方向偏轉(zhuǎn)和可能的植物生長遲滯。實施例6其他Tre6P合成酶的純化、分析和克隆盡管可能有產(chǎn)生海藻糖的其他代謝途徑，但似乎正如Cabib和Leloir(1958，文獻(xiàn)出處同上)所述，主要合成途徑還是通過Tre6P。該途徑中的關(guān)鍵酶是Tre6P合成酶，因為如上所述，一旦制得Tre6P，許多細(xì)胞就將能夠使之去磷酸化而成為游離海藻糖。因此，本發(fā)明中的關(guān)鍵性原則是向靶植物內(nèi)導(dǎo)入Tre6P合成酶活性。至于這種活性來自何處則不是最重要的。我們使用了碰巧是酵母海藻糖合成酶復(fù)合物之亞基(該復(fù)合物至少還含有其他兩個亞基)的酵母酶。在這種情況下，雖然有證據(jù)表明來自酵母的56KDa Tre6P合成酶亞基，可在沒有102和123KDa亞基的情況下在煙草中有效地發(fā)揮功能，但Tre6P合成酶亞基的最適活性可能需要存在有一個或多個其他亞基。
已知催化多種不同生物體內(nèi)同一反應(yīng)的酶常常是同源的，從而一旦克隆了該家族的一個成員后，便將有利于完成對其他成員的克隆工作。因為克隆了酵母Tre6P合成酶(Londesborough and Vuorio，(1992)USPA07/836,021)，所以進(jìn)一步了解到存在一個包括來自大腸桿菌之Tre6P合成酶和來自熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)之蛋白質(zhì)(McDougall et al.，(1993)FEMS Microbiology Letters 107，25-30)的同源蛋白質(zhì)家族。我們決定試驗是否其他生物體也含有同源Tre6P合成酶。
包皮垢分支桿菌含有已部分純化的由Elbein的小組研究過的肝素活化的Tre6P合成酶(Liu et al.，(1969)J.Biol.Chem.244，3728-3791；Lapp et al，.(1971)J.Biol.Chem 246，4567-4579；Elbein and Mitchell(1975)Arch.Biochem.Biophys.168，369-377；Pan et al.，(1978)Arch.Biochem.Biophys.186，392-400)。由這些研究者純化的酶在37℃及在最適量肝素存在下，用Glc6P和UDPG作底物(該酶可使用核苷二磷酸葡糖衍生物的光譜)進(jìn)行檢測，表明其具有0.8U/mg蛋白質(zhì)的比活性。該制劑含有SDS-PAGE分子量約為45和90KDa的兩個多肽。我們對作者的純化方法進(jìn)行了改動，其中包括在所使用的緩沖液中加入蛋白酶抑制劑及其他蛋白質(zhì)保護(hù)劑，并在非離子型去污劑Triton X-100存在下加進(jìn)一個最后的層析步驟。以下是我們最后使用的方法1)在含有1mM芐脒、2mM MgCl2、1mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇、1mM苯甲基磺酰氟(DMSF)和10μg胃酶抑制劑A/ml的40ml 50mM HEPES/KOH(pH7.5)中裂解包皮垢分支桿菌細(xì)胞(在Luria培養(yǎng)液中生長3天并冷凍保存的28濕重細(xì)胞)，然后在Franch勻漿器中破壞之。將勻漿液以28,000g離心20分鐘。向上清液內(nèi)加入(NH4)2SO4(每100ml加30g)。收集沉淀的蛋白質(zhì)，溶解于含有0.1mMEDTA并加有0.1mM PMSF及10μg胃酶抑制劑A/ml之0.2mM二硫蘇糖醇的20mM HEPES/KOH(pH7.5)(HED緩沖液)中，并對HED緩沖液透析過夜。
2)將透析液上樣于3.4×25cm DEAE纖維素柱上并用加在1.2 LHED緩沖液中的達(dá)到0.9M NaCl的線性梯度，以20ml/小時的流速洗脫酶。合并酶的峰值部分(在0.2M NaCl時被洗脫)(33ml)，并調(diào)整到其中含0.5mM PMSF和5μg胃酶抑制劑A/ml。加入9.9g(NH4)2SO4以沉淀蛋白質(zhì)，并將沉淀的蛋白酶溶解在含有50mM NaCl、0.1mMEDTA和0.2mM二硫蘇糖醇的50mM Tris/HCl(pH7.5)(TNED緩沖液)中。
3)使溶解的蛋白質(zhì)(3.7ml)以36ml/小時的流速通過一個用TNED緩沖液平衡過的2.8×34cm Sephadex G100柱。然后將酶的峰值部分直接上樣于一個1.5×8.5cm肝素-Sepharose(在TNED緩沖液中)柱上。用達(dá)到1.0M NaCl的梯度(在100ml緩沖液中)以5ml/小時的流速洗脫柱。在大約0.5M NaCl時洗脫出酶。
4)將肝素-Sepharose洗脫物(表3中的組分H37)的樣品轉(zhuǎn)移到加在Amincon小池內(nèi)之PM10膜上的TNED/0.1％(V/V)Triton×100中，然后上樣于用含有0.1％(V/V)Triton×100的TNED平衡過的0.7×8cm肝素-Sepharose柱上，并用加在50ml上述緩沖液中的達(dá)到1.0M的NaCl梯度洗脫。
表3 從包皮垢分支桿菌中純化Tre6P合成酶基本上按Londesborough和Vuorio(1993)所述方法，于35℃和0.25μg肝素/ml存在下檢測Tre6P合成酶組分 體積 比活性總活性(ml)(mU/mg) (U)28,000g上清液 154 925.0透析的(NH4)2SO4沉淀物 52 2135.2DE52洗脫物 33 13923.4G100洗脫物 21 38514.6第一肝素-Sepharose洗脫物組分H33 2.71880 0.9組分H34 2.74380 2.1組分H35 2.76190 2.7組分H36 2.77890 2.8組分H37 2.76340 1.6第二肝素-Sepharose洗脫物(只上樣H37)組分T211.4 ND 0.08組分T221.4 ND 0.14組分T231.4 ND 0.06雖然經(jīng)過第一個肝素-Sepharose層析步驟后的比活性比Pan等人(19878)報導(dǎo)的高得多，但SDS-PAGE(圖7)卻顯示這些組分是不純的。令人驚奇的是，在大約55KDa處的帶只是強(qiáng)度與酶活性密切相關(guān)的主帶。切掉55KDa帶并在凝膠中用胰蛋白酶消化，然后經(jīng)HPLC分離出胰酶解肽并按上述方法(Londesborough and Vuorio，1993，文獻(xiàn)同上)進(jìn)行序列分析。序列示于表4中并在序列表中給出。對于給出的雙股序列的肽峰值部分29和31來說，已將氨基酸按表4中所述的同樣方式隨意地指定為SEQ ID NO 3和4(來自峰29)及SEQ ID NO 6和7(來自峰31)。肽13的前9個殘基有89％完全相同于酵母之56KDa Tre6P合成酶的殘基250-258(VGAFPIGID，參見Vuorio等人的上述文獻(xiàn)(1993)；EMBL登錄號為X67499)。
表4 得自從包皮垢分支桿菌純化之Tre6P合成酶的內(nèi)部胰酶解肽的氨基酸序列肽峰序列 序列表13 VGAFPISIDSAELSEQ ID NO121 AT/GFLDALAATGETGDSGVTSEQ ID NO229(雙股) RVVVNNTSRSEQ ID NO3YLEGAR SEQ ID NO425 QVLAHDVDRSEQ ID NO531(雙股) IGGAQPAD SEQ ID NO6VGALQVLL SEQ ID NO743 GEVQVGFR SEQ ID NO8為了進(jìn)一步證實該約55KDa帶代表Tre6P合成酶，作進(jìn)一步的純化嘗試。該酶強(qiáng)有力地結(jié)合到UDP-葡糖醛酸瓊脂糖柱上，但是不能被回收。因此，將組分H37轉(zhuǎn)移到含有0.1％Triton×100的緩沖液中(在此轉(zhuǎn)移過程中有2/3的活性丟失)并于Triton×100存在下再次過肝素-Sepharose柱進(jìn)行層析。圖8顯示，除了兩個比細(xì)胞色素c小的微弱帶外，約55KDa帶是存在于活性部分中的僅有的考馬斯亮蘭反應(yīng)性材料。很明顯，Pan等人(1978)所報導(dǎo)的90KDa多肽并不是來自包皮垢分支桿菌的該Tre6P合成酶的基本成分，而且約55KDa基本多肽的大小顯著大于這些作者所報導(dǎo)的較小的45KDa成分。圖9顯示該多肽是由抗酵母海藻糖合成酶之56KDa Tre6P合成酶亞基的抗血清而不是由預(yù)免疫血清識別的，這表明包皮垢分支桿菌的Tre6P合成酶于酵母酶分享抗原決定基。研究了存在于相對粗的酶制劑中的其他免疫反應(yīng)性帶(見圖9中泳道5和6)的性質(zhì)所有這些都不是由于大的蛋白質(zhì)上樣量人為造成的，而且代表某些相關(guān)的蛋白質(zhì)。盡管如此，仍可使用抗酵母酶的抗血清從用皮皮垢分支桿菌基因庫轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中檢測并分離出陽性克隆。同樣，可使用表4中所示的氨基酸數(shù)據(jù)檢查被分離之基因的序列。從酵母和包皮垢分支桿菌中分離的酶之間的免疫學(xué)和氨基酸序列相似性表明，也可以成功地使用根據(jù)TPS1基因設(shè)計的核苷酸探針篩選包皮垢分支桿菌基因。
總之，對包皮垢分支桿菌酶所作免疫學(xué)和測序研究證實，來自不同生物體的Tre6P合成酶都是同一個家族的成員?？梢园词褂肨PS1的同樣方式使用這些酶的基因制得能夠合成海藻糖并改善了環(huán)境壓力耐受性的轉(zhuǎn)基因植物。
序列表(1)一般信息(i)申請人Alko Group Ltd和Londesborough，JohnTunnela，OutiHolmstrm，Kjell-OveMntyl，EinarWelin，BjrnMandal，AbulPalva，E.Tapio(ii)發(fā)明題目產(chǎn)生海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物(iii)序列數(shù)8(iv)通訊地址(A)地址Alko Group Ltd(B)街Salmisaarenranta 7(C)城市Helsinki(D)州-(E)國家Finland(F)區(qū)號FIN-00180(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Diskette，3.5 inch，720 kb(B)計算機(jī)IBM PC/XT/AT(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件WP5.1 file exported as DOS text file(vi)現(xiàn)有申請資料(A)申請?zhí)枺?B)提交日29 June 1995(C)分類？(vii)先有申請資料(A)申請?zhí)朏I 943133(B)提交日29-JUNE-1994(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)片段類型N末端(v)序列描述 SEQ ID NO1Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Ser Ala Glu Leu5 10(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO2Ala Xaa Phe Leu Asp Ala Leu Ala Ala Thr Gly Glu Thr Gly Asp5 10 15Ser Gly Val Thr(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)有(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO3Arg Val Val Val Asn Asn Thr Ser Arg5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)有(iv)片段類型 N末端(v)序列描述SEQ ID NO4Tyr Leu Glu Gly Ala Arg5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO5Gln Val Leu Ala His Asp Val Asp Arg5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)有(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO6Ile Gly Gly Ala Gln Pro Ala Asp5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)有(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO7Val Gly Ala Leu Gln Val Leu Leu5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)片段類型N末端(v)序列描述SEQ ID NO8Gly Glu Val Gln Val Gly Phe Arg權(quán)利要求
1.一種用融合到非組成性植物啟動子上的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的編碼序列轉(zhuǎn)化的植物，從而使被轉(zhuǎn)化的植物具有新的海藻糖合成能力。
2.權(quán)利要求1的植物，其中植物啟動子是組織特異的。
3.權(quán)利要求1的植物，其中植物啟動子是光激活的。
4.權(quán)利要求1的植物，其中植物啟動子是可因經(jīng)受干燥、高鹽堿或極端溫度變化等環(huán)境壓力而被激活。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的植物，其中海藻糖-6-磷酸合成酶基因是微生物來源的。
6.權(quán)利要求5的植物，其中海藻糖-6-磷酸合成酶基因是編碼酵母海藻糖合成酶之56KDa亞基的酵母基因TPS1。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的植物，其為用編碼海藻糖-6-磷酸酶的或編碼與被導(dǎo)入之海藻糖-6-磷酸合成酶或海藻糖-6-磷酸酶相互作用之調(diào)節(jié)性多肽的至少一個基因共轉(zhuǎn)化的。
8.權(quán)利要求7的植物，其中編碼海藻糖-6-磷酸酶的基因是酵母TPS2基因，編碼調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因是酵母TSL1基因。
9.權(quán)利要求6的植物，其中植物啟動子是pats1A。
10.權(quán)利要求1至8中任一項的植物，其中所使用的植物啟動子是環(huán)境壓力激活的啟動子，例如LTI78或RAB18。
11.權(quán)利要求1至10中任一項的植物，其中所說的植物比未被轉(zhuǎn)化的植物有更大環(huán)境壓力耐受性。
12.權(quán)利要求1至11中任一項的植物，其為單子葉植物例如玉米、燕麥、粟、小麥、稻米、大麥、高粱、莧菜、洋蔥、蘆筍或甘蔗。
13.權(quán)利要求1至11中任一項的植物，其為雙子葉植物例如苜蓿、大豆、矮牽?；ā⒚藁?、甜菜、向日葵、胡蘿卜、芹菜、甘藍(lán)、黃瓜、胡椒、番茄、馬鈴薯、小扁豆、亞麻、嫩莖花椰菜、煙草、菜豆、萵苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘藍(lán)、洋薊、豌豆、秋葵、南瓜、散葉甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、茶或咖啡。
14.從權(quán)利要求1至13中任一項的植物中海藻糖的產(chǎn)生。
15.由權(quán)利要求1至13中任一項的植物產(chǎn)生的種子。
16.增加植物的海藻糖含量的方法，該方法包括以下步驟—至少用海藻糖-6-磷酸合成酶的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化感興趣的植物，以及—表達(dá)處于適當(dāng)啟動子控制下的基因，以允許在基因表達(dá)過程中進(jìn)行時序的、局部分布的或環(huán)境壓力誘導(dǎo)的控制。
17.權(quán)利要求16的方法，其中基因是編碼酵母海藻糖合成酶之56KDa亞基的酵母基因TPS1。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中植物是用處于非組成性啟動子如pats1A控制下的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因，和至少一個處于任何適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡碌暮Ｔ逄?6-磷酸酶或海藻糖合成酶之調(diào)節(jié)亞基的基因共轉(zhuǎn)化的，這樣海藻糖的合成即受到控制海藻糖-6-磷酸合成酶基因之啟動子的調(diào)節(jié)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中海藻糖-6-磷酸酶或調(diào)節(jié)亞基的基因分別是酵母基因TPS2或TSL1。
20.權(quán)利要求16至19中任一項的方法，其中海藻糖合成酶基因的編碼序列被融合到植物啟動子上，供以引起在儲藏器官中的特異性地表達(dá)。
21.生產(chǎn)海藻糖的方法，其包括以下步驟—用海藻糖-6-磷酸合成酶的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，—于將誘導(dǎo)海藻糖-6-磷酸合成酶在植物中表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，以及—從植物的組織中提取海藻糖。
22.權(quán)利要求21的方法，其中基因是在允許對基因的表達(dá)進(jìn)行時序性、局部分布性或環(huán)境壓力誘導(dǎo)性控制之啟動子的控制下表達(dá)的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物在其儲藏器官中積聚海藻糖。
24.權(quán)利要求23的方法，其中植物是塊根作物如馬鈴薯、甜菜或蕪菁。
25.保護(hù)主要農(nóng)作物植物以對抗干旱、高鹽堿或極端溫度變化的方法，其包括至少用與植物啟動子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的編碼序列轉(zhuǎn)化植物，這樣只有在植物遭遇到干旱、高鹽堿或極端溫度條件時才能實現(xiàn)基因的充分表達(dá)。
26.保護(hù)有可食果實的植物以防花受到霜凍損害的方法，其包括至少用與植物啟動子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的編碼序列轉(zhuǎn)化植物，這樣只有在植物遭遇到低溫時才能實現(xiàn)基因的充分表達(dá)。
27.改善包括綠色食品原料、采摘的果實及觀賞植物在內(nèi)的已收獲植物的貯藏性質(zhì)的方法，該方法包括至少用與植物啟動子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化植物，以便提供這樣的植物、其已收獲的部分具有改善保水能力、改善脫水耐受性或兩者。
28.有利于培養(yǎng)和維護(hù)觀賞植物的方法，其包括至少用與植物啟動子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化植物，以便使植物與未被轉(zhuǎn)化的植物相比具有改善了的環(huán)境壓力耐受性。
29.改善由植物的可食部分制備的泥、糊、凍和醬的味道和質(zhì)地的方法，其包括用與植物啟動子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的編碼序列轉(zhuǎn)化植物，以便實現(xiàn)海藻糖在植物可食部分中的積聚。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物及增加植物海藻糖含量的方法。根據(jù)本發(fā)明，有用的植物是用編碼海藻糖-6-磷酸合成酶基因的序列轉(zhuǎn)化的，所說的序列與非組成性植物啟動子相融合，從而使基因按時序的、按局部分布的或環(huán)境壓力誘導(dǎo)的控制方式得以表達(dá)。本發(fā)明可用于生產(chǎn)抗干旱、高鹽堿或極端溫度變化的基本農(nóng)作物，并用于改善綠色食品原料、采摘的果實及觀賞植物等在內(nèi)的收獲植物的儲存性質(zhì)。
文檔編號C12R1/91GK1159833SQ95194807
公開日1997年9月17日 申請日期1995年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月29日
發(fā)明者J·龍迪斯保羅, O·騰內(nèi)拉, K·O·霍爾姆斯特倫, E·曼迪拉, B·韋林, A·曼德爾, E·T·帕爾瓦 申請人:阿爾科集團(tuán)公司