專利名稱：：一種動物角的仿生酶解產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥動物角的仿生酶解產(chǎn)物及其在清熱解毒、涼血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定驚、鎮(zhèn)痛的藥物中的應(yīng)用。屬中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：動物角類作為傳統(tǒng)中藥應(yīng)用，已有悠久的歷史，臨床應(yīng)用很廣泛。動物的角同屬皮膚衍化物的組織，其結(jié)構(gòu)和成分相似，均由角質(zhì)細胞組成。犀角CornuRhinoceriAsiatic、廣角CornuRhinoceriAfrican具有清血熱、解溫毒、定驚的功能，主治熱病神昏澹語、斑疹、吐血等證。羚羊角CornuSaigaeTataric為哺乳綱偶蹄目?？苿游镔惣恿缪騍aigatataricaLinnaeus的角，它具有^熱鎮(zhèn)痙、平肝熄風、解毒消腫的功能，中醫(yī)用于高熱神昏、驚厥抽搐等證。藏羚羊角CornuPantholopsisHodgson是藏羚羊Pantholopshodgsoni的角，主治月經(jīng)不調(diào)、子宮出血、死胎不下等證。山羊角為?？苿游锴嘌騈aemorhedusgoralHardwicke、北山羊CapiraibexLinnaeus的角，本品首載于《本草新編》，曰其"?；钏姥?，具有清熱鎮(zhèn)驚，散瘀止痛之功，目前發(fā)現(xiàn)其有明顯的解熱，鎮(zhèn)痛,鎮(zhèn)靜,抗驚厥，抗病毒作用，與羚羊角藥理作用相似，但力弱，故臨床常用治小兒驚癇，高血壓頭痛,流行性乙型腦炎；另發(fā)現(xiàn)有興奮子宮作用，故也用治產(chǎn)后腹痛，痛經(jīng)等疾病。黃羊角為牛科動物黃羊Procapragutturosapallas的角，本品非傳統(tǒng)藥材，但民間常作藥用，目前已被《吉林中草藥》一書收載，具有平肝熄風,清熱解毒之功，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其有類似于羚羊角的藥理作用，故臨床也常用于治療溫熱病高熱神昏驚厥,小兒感冒發(fā)熱，小兒驚風,中風，青光眼等癥，以代替羚羊角入藥。耗牛角是?？苿游锖呐osgrunniens(藏語稱Yak)的角，是傳統(tǒng)藏醫(yī)藥學中的一種特有藥材，本品藥用始于明代,李時珍曰其"治驚癇,熱毒,諸血病"；目前牦牛已被馴為家畜，藥源豐富，具有清熱解毒，涼血熄風作用，臨床常用治高熱驚癇，血熱出血等證,療效突出，普遍認為是一味具有研究價值的中藥。水牛角為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角，最早見載于《名醫(yī)別錄》一書，曰"療時氣寒熱頭痛"，有清熱解毒,涼血定驚之功；現(xiàn)代研究表明，水牛角有明顯的強心,鎮(zhèn)靜,抗驚厥，抗炎,抗感染及保肝、降血脂等作用，故臨床可用治熱病頭痛,高熱神昏，發(fā)斑發(fā)疹，出血，小兒驚風及咽喉腫痛等癥，并且療效顯著；另尚用治急性黃疸性肝炎，精神分裂癥等疾病。黃牛角為?？苿游稂S牛BostaurusGmelin的角，本品非傳統(tǒng)藥材，但民間常作藥用，目前已被《中國動物藥》收載，為寒性苦味藥，具有清熱解毒,涼血止血作用；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),黃牛角不但能強心,抗炎，抗感染，而且能使血小板數(shù)量增加，出、凝血時間縮短，故臨床常用治流行性腦膜炎，乙型腦炎，出血癥，流行性出血熱，咽喉腫痛等疾病，且療效令人滿意。鹿角為鹿禾斗動物梅花鹿CervusnipponTemminek、馬鹿CervuselaphusLinnaeus已骨化的角或脫落的角基，鹿角的藥用，在我國已沿用了近2千年,其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，為溫性咸味藥，善入肝腎兩經(jīng)，具有補肝腎,益精血，強筋骨，行血消腫等多方面作用；可廣泛用治腎虛腰脊冷痛、陽痿遺精，陰疽瘡瘍，跌打損傷，產(chǎn)后腹痛,婦人赤白帶下；另外，臨床亦用鹿角治療乳腺炎及乳腺增生等疾?。荒壳?，研究發(fā)現(xiàn),鹿角能明顯增加心臟搏出量，提高機體免疫功能，用治心力衰竭等。犀角及羚羊角藥材資源匾乏，許多國家己經(jīng)明令禁止使用犀角和羚羊角及其制成品。然而這些動物的角在入藥的方式上通常采用原藥材粉碎后直接服用，或水提后服用，其所采取的提取方法比較傳統(tǒng)，由于動物的角含有大量的角蛋白，水提時有效成分不易完全提取出來，藥材利用率較低，有效成分沒有獲得充分利用。經(jīng)現(xiàn)代較為系統(tǒng)的與臨床功效相關(guān)的生物活性和物質(zhì)基礎(chǔ)評價研究，動物角中的水溶性蛋白及肽類、游離的氨基酸成分的療效越來越受到關(guān)注。人體經(jīng)口服動物角后，經(jīng)胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子肽類成分吸收入血發(fā)揮療效，小分子的寡肽類物質(zhì)和氨基酸很容易被小腸吸收，而大分子的蛋白類在小腸里也很難被吸收。傳統(tǒng)的原粉直接服用，原藥粉中大分子蛋白，只有少量在體內(nèi)經(jīng)過胃腸道的分解，變成小分子的寡肽而被吸收，由于藥材粉碎的細度、胃腸道pH的變化及口服其他食物的干擾造成水解的不完全，有效成分被吸收利用的少，造成大量藥材的浪費療效大大降低。水提的提取工藝使得有大部分不溶入水的蛋白被濾過除去，造成大量的藥材浪費，療效同樣大大降低。應(yīng)用酶解法水解動物蛋白，獲得具有一定生理活性的生物活性肽是目前國內(nèi)外研究的熱點。由于不同的酶作用的部位不一樣，酶解法得到的產(chǎn)物也不一樣，用單一的胃蛋白酶或胰酶來酶解，只能使藥材中的蛋白部分酶解，藥材中的蛋白得不到最大程度的利用，這樣就迫切的需要一種仿生的酶解方法——在動物或人體生物進化過程中已被證實、療效確切、模擬人體的消化過程的仿生酶解方法，將動物藥酶解后得到的有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同時更加充分利用原藥材。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的在于提供一種更有效的，安全的動物角仿生酶解產(chǎn)物；本發(fā)明的第二目的是提供該提取物在清熱解毒、涼血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定驚、鎮(zhèn)痛的藥物中的應(yīng)用。發(fā)明人提供一種動物角的酶解產(chǎn)物，該產(chǎn)物采用仿生酶解的方法制備取動物角，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至1.03.0，加入胃蛋白酶于3545。C保溫酶解0.54小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入胰酶或胰蛋白酶于405(TC保溫酶解28小時，即得。進一步優(yōu)化為取動物角，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入動物角量的0.5%5%的胃蛋白酶于3545。C保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入動物角量的O.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于4050'C保溫酶解36小時，即得。較優(yōu)的制備方法為取動物角，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入動物角量的1%2%的胃蛋白酶于40'C保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入動物角量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50°。保溫酶解36小時，即得。發(fā)明人經(jīng)過試驗篩選，動物角藥材細粉加水后，可預(yù)先加熱至8010(TC,保溫1530分鐘，再降溫至酶解所需溫度，按以上操作酶解，其效果更強。按本發(fā)明技術(shù)方案進行酶解，當胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白轉(zhuǎn)化力不低于25.0時，效果較為充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。本發(fā)明所述的動物角類包括犀角CornuRhinoceriAsiatic,廣角CornuRhinoceriAfrican,藏羚羊Parvtholopshodgsoni的角，牛禾斗動物賽力口羚羊SaigatataricaLinnaeus的角，?？苿游锴嘌騈aemorhedusgoralHardwicke、北山羊CapiraibexLinnaeus的角，?？苿游稂S羊Procapragutturosapallas的角，鹿禾斗動物梅花鹿CervusnipponTemminek、馬鹿CervuselaphusLinnaeus已骨化的角或脫落的角基，?？苿游稂S牛BostaurusGmelin的角，牛禾斗動物牦牛BosgrunniensLirmaeus的角，牛禾斗動物7jC牛BubalusbubalisUnnaeus的角。經(jīng)現(xiàn)代研究證明，動物角中的肽類成分也是有效部位。人體經(jīng)口服動物角后，經(jīng)胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化，以小分子肽類成分吸收而發(fā)揮療效。發(fā)明人根據(jù)人體口服動物角等動物藥的過程，創(chuàng)造性的在體外采用人體仿生酶解的方法，先后對原料進行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人體直接口服藥材原粉比較，所得被小腸吸收消化的有效物質(zhì)群相同，但體外酶解選擇較優(yōu)的試驗條件，酶解的更充分，再口服所得的藥效更強，酶解成寡肽或小分子的活性部位群經(jīng)注射或粘膜、皮膚等途徑給藥時更容易被吸收，免疫原性更低，更有效。經(jīng)過試驗篩選，單獨以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解動物角，效果均優(yōu)于原粉直接口服，但都低于本發(fā)明的仿生酶解方法，本發(fā)明方法在很大程度上增強了動物角等動物藥的療效，而且由于以小分子寡肽的形式入藥，口服、非口服及鼻腔粘膜等途徑給藥應(yīng)用時可透膜吸收，發(fā)揮療效迅速，增強療效；而且由于沒有引入異蛋白，減小了注射等劑型的毒副作用，值得推廣應(yīng)用。5本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地將本發(fā)明酶解產(chǎn)物配合適當?shù)妮o料，制備成各種常規(guī)制劑，如a、將酶解液直接噴霧干燥，加入適量的常規(guī)輔料如淀粉、乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等制成膠囊劑或片劑。b、將酶解液濾過濃縮成稠膏，加入適量的糖粉和糊精制成顆粒劑。c、將酶解液加熱至85'C殺酶后，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等制成小針或輸液；也可加入甘露醇、乳糖等凍干制成凍干粉針劑。d、將酶解液濾過，濾液以超濾膜超濾，截留分子量10kD以下的溶液，或濾液直接加卡波姆、殼聚糖等常規(guī)藥用輔料，制成凝膠劑或噴霧劑。本發(fā)明提供的動物角酶解產(chǎn)物可以單獨使用，也可以與其他藥物成分聯(lián)合使用，即在藥物活性成分中，可以只有該產(chǎn)物，還可以是其與其他藥物的混合物，達到配合治療、輔助治療的目的。本發(fā)明動物角酶解產(chǎn)物可以在清熱解毒，涼血止血，抗炎，抗感染，抗病毒，定驚，鎮(zhèn)痛藥物中廣泛應(yīng)用，可用于溫病高熱，神昏譫語，發(fā)斑發(fā)疹，吐血衄血，驚風，癲狂、鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜，抗病毒等，如感冒引起的發(fā)熱，血熱引起的衄血、紫癜，癲癇、急驚風；也可用于治療銀屑病、急性皮炎及變態(tài)反應(yīng)性皮炎、乙型腦炎、黃疸型或無黃疸型肝炎、鉤端螺旋體病、痢疾、敗血癥、急性腦血管疾病及風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。有益效果為進一步驗證本發(fā)明產(chǎn)物的治療作用，發(fā)明人進行了動物藥效學實驗，實驗中的"仿生酶解組"即為按本發(fā)明技術(shù)方案制得的水牛角酶解產(chǎn)物一、解熱作用藥效比較試驗(酵母法)1、材料1.1動物Wister大鼠，購自山東大學動物實驗中心。1.2試劑胃蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20070914;胰蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071228;胰酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071130;阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限公司)；干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn))。1.3供試樣品未酶解組取黃羊角藥材細粉(80目)50g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃羊角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C士2。C,保溫同時攪拌酶解4h,85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45jmi)濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃羊角藥材量的1%胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為5(TC土2X:，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃羊角藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50。C士2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，力i入黃羊角藥材量的W胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入黃羊角藥材量的P/。胰蛋白酶，溫度為50。C士2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min,放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；空白對照組即生理鹽水組；陽性對照組即阿司匹林組。2、方法與結(jié)果2.1試驗方法選健康大鼠，雄性，體重180200g,編號，稱重。測肛溫2次，選用56只體溫范圍3638.5°C，且體溫波動小于0.3'C者，隨機分為7組，分別為空白對照組、未酶解組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、胰酶酶解組、仿生酶解組、陽性藥組(阿司匹林片)，每組8只。造模前測體溫作為"基礎(chǔ)體溫"。大鼠的劑量為:2.75g(生藥)/kg。各組大鼠均背部皮下注射2(F/。酵母-NS溶液10rnL/kg,造成發(fā)熱模型。造模后6h，每組大鼠均分別灌胃給藥，給藥后的O、0.5、1、1.5、2、3h復(fù)測大鼠肛溫。以各時間點的體溫升高值作組間比較，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值土標準偏差表示。2.2試驗結(jié)果(見表1):表l樣品對致熱大鼠體溫靜增減值的影響(義士s,r^8)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與空白對照組比較，*P〈0.05，**P<0.01。上述試驗結(jié)果表明，仿生酶解工藝大大增加了黃羊角的退熱活性，均比其余酶解工藝理想，較未酶解樣品具有極顯著性差異。二、止血作用藥效比較試驗1、材料1.1供試樣品未酶解組取黃牛角藥材細粉(80目)50g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為5(TC土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，85'C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0,溫度為50°C±2°C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為4(TC土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，溫度為50。C土2。C,保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45拜)濾過，即得；空白對照組即生理鹽水組；陽性對照組即立止血組。1.2試劑胃蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20070914;胰蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071228;胰酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071130;立止血規(guī)格lku,瑞士巴塞爾素高大藥廠，進口產(chǎn)品；注射用生理鹽水規(guī)格:250ml,批號02110504，沈陽志鷹制藥廠生產(chǎn)。1.3動物昆明種小白鼠，體重2022g,雌雄各半，動物購自沈陽醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號遼實動質(zhì)字2000。1.4儀器BS634血小板聚集凝血儀，北京生化儀器廠。2、方法與結(jié)果2.1對小鼠出血時間的影響采用測定小鼠尾靜脈出血時間的方法。實驗組分為7組，每組12只小鼠,雌雄各半。小鼠尾靜脈給藥，實驗用藥物與立止血均用注射用生理鹽水稀釋或溶解,給藥體積為0.20ml/10g。陽性對照藥物采用進口立止血，劑量為0.3ku/kg，陰性對照組給等體積生理鹽水。給藥后30min將小鼠尾固定，用手術(shù)刀片切開左側(cè)中部尾靜脈,每30秒用濾紙輕輕擦拭一次,直到不再出血為止，記錄時間即為出血時間。2.2測定結(jié)果見表2:表2對小鼠尾靜脈出血時間和凝血時間的影響(義±s，n=12)組別平均出血時間(min)平均凝血時間(min)未酶解樣品組4.81±0.612.96±0.76胃s白酶酶解組4.48±0.52*3.06±0.63*胰蛋白酶酶解組3.42±0.42*2.64±0.67*胰酶酶解組3.38±0.41*2.56±0.65*仿生酶解組2.35±0.48**2.32±0.72**立止血組2.26±1.60**1.95±0.79**生理鹽水組5.51±1.423.67±0.51注與空白對照組比較，**P〈0.01。上述試驗結(jié)果表明，本方法直觀地反映了仿生酶解工藝得到的產(chǎn)物對壓力較低的靜脈止血作用效果，止血作用顯著，均比其余酶解工藝理想，較未酶解樣品具有顯著性差異。三、抗炎作用藥效比較試驗1試驗材料1.l試驗動物昆明種小鼠，SPF級，早，1822g，安徽省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(皖)2005-0001號。1.2試驗儀器JNB型精密扭力天平上海第二天平儀器廠出品。1.3受試藥物二甲苯無錫醫(yī)藥采購供應(yīng)站經(jīng)銷，東湖塘化工廠出品。供試樣品的制備未酶解組取黃牛角藥材細粉(80目)50g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為5CTC土2t:，保溫同時攪拌酶解4h,85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50'C土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為4(TC士2'C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，溫度為5(TC土2'C,保溫同時攪拌酶解4h，85'C保溫20min，放冷，濾過，即得；空白對照組即生理鹽水組。2試驗方法參照文獻方法，取昆明種小鼠60只，隨機分成6組，分組及給藥劑量同上，分別灌胃給予O.lml/10g相應(yīng)供試液，連續(xù)7天，末次給完藥后30min時做試驗。水次給藥后30min每鼠用乙醚麻醉，將二甲苯致炎液涂在小鼠左耳前后兩面，每面約0.025ml，共0.05ml/每耳，右耳作對照，lh后，將小鼠斷頭處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用9mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用扭力天平稱重。每鼠的左耳片重量減去右耳片重量的增加百分率即為腫脹程度。計算各組腫脹度之均值與標準差，并作t檢驗，比較組間差異顯著性。3試驗結(jié)果，見下表。表3對小鼠因二甲苯所致耳廓腫脹度的影響結(jié)果表(又士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注經(jīng)t檢驗，各組與空白對照組相比，補<0.05，林P〈0.01。上述試驗結(jié)果表明，小鼠耳廓給予二甲苯后，可以造成耳廓腫脹炎癥模型。與空白對照組比較，仿生酶解組可顯著減輕小鼠耳廓腫脹炎癥，具有顯著性差異(P〈0.01);單酶酶解組同樣存在明顯差異(P〈0.05)，提示本發(fā)明仿生酶解產(chǎn)物和單酶酶解產(chǎn)物均具有優(yōu)于未酶解組的抗炎作用，且仿生酶解組的藥理作用好于單酶酶解組。四、抗病毒作用藥效比較試驗1、藥品與試劑供試樣品的制備未酶解組取黃牛角藥材細粉(80目)50g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為4(TC土2。C，保溫同時攪拌酶解4h,85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45jim)濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50。C士2'C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45jam)濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為4(TC土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，溫度為50。C土2-C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)；HBeAg檢測試劑盒；HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞細胞株ffepG2-2.2.15。2、試驗方法HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞H印G廠2.2.15細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗(100U/mL青霉素和100叫/niL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液中，于37°C、02條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的癌細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成5X107mL單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100pL，貼壁培養(yǎng)24h后棄去上清液，加入不同體積藥物，樣品用3%二甲亞砜溶解配制成lmg/mL的母液，補加DMEM培養(yǎng)液至終體積為200nL。每個濃度平行6孔，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。吸取培養(yǎng)板上清液5pL，按HBeAg檢測試劑盒方法檢測e抗原的吸光度(A)值，按下式計算細胞增殖抑制率。細胞抑制率=(1_加藥細鵬的A值/對照細胞的A值)X100%3試驗結(jié)果，見下表。表4對H印G2-2.2.15細胞的抑制率結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。上述試驗結(jié)果表明，仿生酶解產(chǎn)物具有較強的抗HBV作用，與不加藥物僅加等體積DMEM培養(yǎng)液的對照組比較，在10pg/mL的藥物濃度顯示出顯著差異，較其他單酶酶解產(chǎn)物的作用強，提示本發(fā)明仿生酶解產(chǎn)物具有較好的抗病毒作用。五、抗戊四氮驚厥作用藥效比較試驗1、材料1.1動物昆明種小白鼠，體重2022g，雌雄各半，動物購自沈陽醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號遼實動質(zhì)字2000。1.2藥品未酶解樣品組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、胰酶酶解組、仿生酶解組供試品溶液的制備方法同上；空白對照組即生理鹽水組。1.3試劑胃蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20070914;胰蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071228;胰酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071130;戊四氮注射液(上海新亞制藥廠)；注射用生理鹽水規(guī)格250ml，批號02110504,沈陽志鷹制藥廠生產(chǎn)。2、方法與結(jié)果2.1試驗方法選取活潑無受孕的小白鼠60只，雌雄均可,體重1822g。隨機分成6組,每組10只，分別ip未酶解組供試品、胃蛋白酶酶解組供試品、胰蛋白酶酶解組供試品、胰酶酶解組供試品、仿生酶解組供試品和生理鹽水(N.S)O.25tnl/10g，15min后ip0.5%戊四氮0.2ml/10g，觀察驚厥發(fā)生的時間及生存時間，采用t檢驗法統(tǒng)計處理。2.2結(jié)果見表3:表5對小鼠抗驚厥作用的影響(XiS，n=10)組別平均驚厥發(fā)生時間(min)平均生存時間(rain)空白對照組1.07±0.2210.12±4.29未酶解組1.14±0.3312.21±5.09胃蛋白酶酶解組1.45±0.3512.67±5.25胰蛋白酶酶解組1.75±0.41*14.09±6.01*胰酶酶解組1.81±0.53*14.51±5.61*仿生酶解組2.49±0.92"17.61±6.34'*注與空白對照組比較，*P<0.05，，〈0.01。以上試驗結(jié)果表明，仿生酶解組的抗驚厥效果明顯優(yōu)于其他組，且平均生存時間明顯延長，與未酶解組比較仿生酶解組明顯增強了小鼠的抗驚厥作用。六、鎮(zhèn)痛作用藥效比較試驗121試驗材料1.l試驗動物昆明種小鼠，SPF級，早，1822g，安徽省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(皖)2005-0001號。1.2試驗儀器熱板儀自制；電熱恒溫水浴鍋上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。1.3受試藥物供試樣品的制備未酶解組取黃牛角藥材細粉(80目)50g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為5(TC土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，85i:保溫20rain，放冷，濾過，即得；胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50°C±2°C，保溫同時攪拌酶解4h，85t:保溫20min，放冷，濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，加入黃牛角藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0,溫度為4(TC土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入黃牛角藥材量的1%胰蛋白酶，溫度為50。C土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；空白對照組即生理鹽水組。2試驗方法參照文獻方法，取早性昆明種小鼠60只，給藥前將小鼠放入熱板上(將恒溫水浴調(diào)節(jié)至55士0.5i:，放入1000ral的薄鐵皮燒杯，底部接觸水面)，用秒表記錄小鼠自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時間(s)作為該鼠的給藥前痛閾值，應(yīng)挑選530s以內(nèi)者為合格。取測痛閾值后篩選出痛閾值符合要求的小鼠54只，按痛閾值和體重隨機分成6組。分別為空白對照組、未酶解組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、胰酶酶解組和仿生酶解組，給藥劑量均為10ml/kg，空白組灌胃給予同體積的生理鹽水。連續(xù)給藥5天，于末次給藥后30min、60min將小鼠放入熱板上，測定痛閾值以及痛閾值提高百分率，并作t檢驗，比較組間差異顯著性。3試驗結(jié)果具體實驗結(jié)果見下表。13表6對小鼠因熱板所致痛閾值的影響結(jié)果表(文土SD,n=9)組別給藥前痛閾值(s)30min(s)30min痛閾提高率(%)60min(s)60min痛閾提高率(%)空白對照組17.7±2.219.8±4.512.3±33.3119.9±4.712.9±28.9未酶解組19.7±3.924.7±6.8*25.9±30.4*25.2±7.3*27.6±26.1*胃蛋白酶酶解組19.4±4.025.6±7.8*32.5±27,2*26.0±8.6*34.3±30.7*胰蛋白酶酶解組18.4±5.927.6±8.8*48.9±27.6*27.9±9.0*51.0±31.3*胰酶酶解組18.6±5.928,2±8.8*51.9±27.6*28.4±9.0*52.6±31.3*胰酶酶解組19.2±2.531.6±7.4林65.3±40.8*32.2±6.7**67.9±37.0林注經(jīng)t檢驗，各組與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。上述試驗結(jié)果表明，在給藥后30min和60min時，與空白對照組比較，仿生酶解組可顯著提高因熱板所致小鼠的痛閾值和痛閾值提高百分率，具有顯著性差異(P〈0.01);其他單酶酶解組同樣存在明顯差異(P<0.05)，提示本發(fā)明仿生酶解產(chǎn)物和單酶酶解產(chǎn)物均具有較好的鎮(zhèn)痛作用，且仿生酶解組的藥理作用好于單酶酶解組。具體實施方式下面列舉實施例，進一步說明本發(fā)明，各實施例僅用于說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明實施例l取山羊角500g，粉碎成細粉，加10倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入山羊角量的1%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入山羊角量的1%的胰酶于50"保溫酶解4小時，噴霧干燥，加入適量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填裝膠囊。實施例2取牦牛角500g，粉碎成細粉，力Q8倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.6，加入牦牛角量的2%的胃蛋白酶于37'C保溫酶解3小時，調(diào)節(jié)pH至7.5，加入牦牛角量的2%的胰蛋白酶于40匸保溫酶解6小時，噴霧干燥，加入適量的微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，壓制成片。實施例3取羚羊角500g，粉碎成細粉，加15倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至3.0，加入羚羊角量的5%的胃蛋白酶于40'C保溫酶解2小時，調(diào)節(jié)pH至8.5，加入羚羊角量的5X的胰蛋白酶于45'C保溫酶解5小時，加熱至85'C保溫15分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成注射液。14取犀角500g，粉碎成細粉，加15倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至L5，加入犀角量的0.5%的胃蛋白酶于40'C保溫酶解1小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入犀角量的1.5W的胰蛋白酶于5(TC保溫酶解3小時，加熱至95'C保溫30分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，加入甘露醇，冷凍干燥，制成凍干粉針劑。實施例5取黃牛角250g、地龍50g，加15倍量水勻衆(zhòng)，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入總藥量的1%的胃蛋白酶于40'C保溫酶解2小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入總藥量的1W的胰酶于50'C保溫酶解4小時，加熱至85'C保溫15分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，潤脹12小時，調(diào)PH增加粘度，加入200g生地提取濃縮液，混勻，制成凝膠劑。實施例6取廣角500g，粉碎成細粉，加15倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.5，加入廣角量的4%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2小時，調(diào)節(jié)pH至8.5，加入廣角量的5%的胰蛋白酶于45°。保溫酶解6小時，加熱至85'C保溫I5分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成噴霧劑。實施例7取黃羊角500g，粉碎成細粉，加10倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0,加入黃羊角量的2%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2.5小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入黃羊角量的2X的胰酶于5(TC保溫酶解5小時，噴霧干燥，加入適量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填裝膠囊。實施例8取藏羚羊角500g，粉碎成細粉，加12倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.5，加入藏羚羊角量的2.5%的胃蛋白酶于39°。保溫酶解2.5小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入藏羚羊角量的3%的胰蛋白酶于40'C保溫酶解6小時，噴霧干燥，加入適量的微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，壓制成片。實施例9取水牛角500g，粉碎成細粉，加15倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入水牛角量的2.5%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解3小時，調(diào)節(jié)pH至8.5，加入水牛角量的2.5^的胰酶于5(TC保溫酶解6小時，噴霧干燥，加入適量的糖粉和糊精，制粒，干燥，整粒，制成顆粒劑。實施例IO取鹿角500g，粉碎成細粉，加12倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入鹿角量的3%的胃蛋白酶于38'C保溫酶解2.5小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入鹿角量的4%的胰蛋白酶于42i:保溫酶解6小時，加熱至85'C保溫15分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，制15成噴霧劑。實施例ll取實施例9所制顆粒治療過敏性紫癜患者36例。36例均為住院患兒,其中男16例，女20例，年齡214歲，病程為315d;診斷標準參照《實用兒科學》有關(guān)標準進行，全部病例有不同程度的皮膚紫癜，其中腹痛H例，關(guān)節(jié)痛23例，血尿12例，糞潛血陽性12例，全部病例檢査血小板計數(shù)、出凝血時間均正常?？诜o藥，每次10g，每天2次。根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病癥診斷療效標準》制定療效標準，臨床治愈:紫斑紫癜及全身癥狀消失，實驗室指標恢復(fù)正常；好轉(zhuǎn):皮膚青紫斑點明顯減少,全身癥狀減輕,實驗室指標有改善；未愈:皮膚青紫斑點、全身癥狀及實驗室指標均無變化。本組36例，治愈28例(77.78%)，好轉(zhuǎn)7例(19.44%)，未愈1例(2.78%)，總有效率97.22%。權(quán)利要求1、一種動物角的仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物角，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保溫酶解0.5～4小時，再調(diào)節(jié)pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保溫酶解2～8小時，即得。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的動物角酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物角，粉碎成細粉，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入動物角量的0.5%5%的胃蛋白酶于3545'C保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入動物角量的0.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于405(TC保溫酶解36小時，即得。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物角酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物角，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入動物角量的1%2%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入動物角量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于5CTC保溫酶解36小時，即得。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物，其特征在于將動物角粉碎成細粉后加水先加熱至8010(TC并保溫1530分鐘后，再降溫至所需溫度進行酶解。5、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白轉(zhuǎn)化力不低于25.0。6、權(quán)利要求1至5中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物的動物角可以是犀角、廣角、藏羚羊角、羚羊角、山羊角、黃羊角、鹿角、黃牛角、牦牛角、水牛角。7、根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物，其特征在于加入常規(guī)藥用輔料制成注射劑、口服制劑或外用制劑。8、權(quán)利要求1至5中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物在制備用于治療發(fā)熱以及由血熱引起的出血、滲血的藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1至5中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物在制備用于抗炎，抗感染，抗病毒的藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求1至5中任一所述的動物角酶解產(chǎn)物在制備用于鎮(zhèn)痛，抗驚厥的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種動物角的酶解產(chǎn)物及其用途，屬中藥領(lǐng)域，其特征是采用仿生酶解的方法，取動物角，粉碎成細粉，加水勻漿后，在適當?shù)臈l件下，先以胃蛋白酶保溫酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保溫酶解，所得的酶解物按不同的制劑要求制成制劑。本發(fā)明產(chǎn)物在清熱解毒、涼血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定驚、鎮(zhèn)痛方面具有良好效果。文檔編號A61K35/32GK101647814SQ200810118158公開日2010年2月17日申請日期2008年8月13日優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日發(fā)明者劉國飛,周小明申請人:北京凱瑞創(chuàng)新醫(yī)藥科技有限公司