一組核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鑒定中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種核苷酸序列組合，由SEQ ID NO:1-6組成。所述組合中的核苷酸序列分別作為環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物用于伊氏李斯特菌的鑒定方法。與普通PCR和Real-time PCR檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的方法具有優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡(jiǎn)便性，適合檢測(cè)條件較差的應(yīng)急檢測(cè)和基層檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】-組核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鑒定中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用，特別是在伊氏李斯特菌鑒 別診斷中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，Liv)，又稱為綿羊李斯特菌，是廣泛存在于環(huán) 境中的革蘭氏陽(yáng)性、有運(yùn)動(dòng)能力、兼性胞內(nèi)寄生短桿菌，是重要的人獸共患病病原菌。該病 原體主要引起反芻動(dòng)物致病，導(dǎo)致李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)，約占動(dòng)物李斯特菌病的15%。 由伊氏李斯特菌所致的動(dòng)物李斯特菌病，其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、胃腸炎、新生兒敗血癥以及流 產(chǎn)，但不能穿過(guò)血腦屏障，侵入神經(jīng)中樞系統(tǒng)。伊氏李斯特菌也能引起人類李斯特菌病。該 李斯特菌病的易感人群主要為免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生兒 和孕婦；后者為腫瘤患者、艾滋病患者和器官移植受體等。人類伊氏李斯特菌病主要臨床 癥狀為敗血癥、孕婦流產(chǎn)、死產(chǎn)以及發(fā)熱性胃腸炎等。此外，與其他李斯特菌種比較，該病原 體在環(huán)境、食品中的分布更為廣泛。許多研究表明，伊氏李斯特菌所引起的李斯特菌病被低 估。為了給予臨床病人或感染動(dòng)物準(zhǔn)確快速的治療、以及伊氏李斯特菌的流行病學(xué)調(diào)查，研 發(fā)一個(gè)省時(shí)、省力和特異性較高的伊氏李斯特菌檢測(cè)方法成為必要。
[0003] 目前對(duì)于伊氏李斯特菌分離鑒定主要依賴于傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)和生化鑒定，該方 法耗時(shí)大約5到7天，包括二次增菌，選擇培養(yǎng)及后續(xù)的生化鑒定，耗時(shí)耗力，而且生化結(jié)果 的判讀依賴于人的主觀判斷，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差，易錯(cuò)判。隨著核酸診斷技術(shù)的快速發(fā)展， 一些以PCR為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)（如普通PCR技術(shù)，熒光PCR技術(shù)）被用于伊氏李斯特菌的 快速診斷，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設(shè)備，需要后續(xù)的電泳操作，昂貴的探針合成， 以及熟練的操作人員。對(duì)于一些條件有限的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法進(jìn)行，限制了這些技術(shù)的運(yùn)用。目前 運(yùn)用這些檢測(cè)技術(shù)診斷伊氏李斯特菌的PCR方法和Real-time PCR方法，所選擇的目的基 因（如iap，Liv22-228)特異性差，極易出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增。此外這些檢測(cè)技術(shù)的靈敏度差， 檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)和應(yīng)急檢測(cè)。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由 Notomi等發(fā)明的一種新型核酸特異性擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易檢 測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于分子生物研究和診斷領(lǐng)域。LAMP針對(duì)靶核苷酸序列的6個(gè)區(qū)域設(shè) 計(jì)4條核心引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下（60?65°C )實(shí)現(xiàn) 擴(kuò)增。
[0005] LAMP的4條核心引物，包括2條內(nèi)引物，即FIP (Forward inner primer，F(xiàn)IP)和 BIP (Backward inner primer，BIP)，2 條外引物（F3 和 B3)。FIP 包含 Flc (Fl 區(qū)域的互補(bǔ)序 列）和？2，即5/41(：42出1?包含81(3(81區(qū)域的互補(bǔ)序列）和82，即5 /-81(3-82。此 夕卜，兩條環(huán)引物（Loop primes, LF和LB)被增加到反應(yīng)體系，能夠加速LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。
[0006] LAMP擴(kuò)增反應(yīng)包括兩個(gè)過(guò)程，即啞鈴狀模板合成階段和循環(huán)擴(kuò)增階段。在既定的 反應(yīng)溫度下，雙鏈DNA在處于半解離和半結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA 的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。在Bst DNA聚合酶的作用 下，以FIP引物F2區(qū)段的3'末端為起點(diǎn)，與對(duì)應(yīng)的DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合 成。F3引物與F2c前端F3c序列互補(bǔ)，以3'末端為起點(diǎn)，通過(guò)鏈置換活性DNA聚合酶的作 用，首先置換出FIP引物合成的DNA鏈，同時(shí)合成自身DNA。最終F3引物合成而得的DNA鏈 與模板DNA形成雙鏈。然后由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進(jìn)行鏈置換產(chǎn)生一單鏈， 該單鏈通過(guò)5'末端的Flc區(qū)段和Fl區(qū)段互補(bǔ)，發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同 時(shí)，BIP引物同該單鏈雜交結(jié)合，以BIP引物的3'端為起點(diǎn)，合成互補(bǔ)鏈，在此過(guò)程中莖環(huán) 結(jié)構(gòu)被打開(kāi)。接著，B3引物BIP引物外側(cè)的互補(bǔ)區(qū)域B3c配對(duì)結(jié)合，以：V端為起點(diǎn)，在聚 合酶的作用下，合成新的互補(bǔ)鏈。通過(guò)上述2個(gè)過(guò)程，形成雙鏈DNA。被置換的單鏈DNA依 據(jù)兩端存在的互補(bǔ)區(qū)域，發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條被置換出來(lái)的DNA在 兩端呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)階 段：首先在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以3'末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸。 與此同時(shí)，F(xiàn)IP引物F2與環(huán)上單鏈F2c雜交，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)，解離由Fl區(qū)段合成 的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)上存在單鏈形 式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)相同的過(guò)程，又形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通 過(guò)此過(guò)程，結(jié)果在同一條鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)可以特異、 高效、快速的擴(kuò)增目的DNA，在1小時(shí)之內(nèi)使產(chǎn)物的量達(dá)到IO 9個(gè)拷貝。
[0007] LAMP擴(kuò)增之后，其產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖電泳后檢測(cè)擴(kuò)增子，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳 圖呈特異性階梯狀。其次，實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)也被用于檢測(cè)LAMP擴(kuò)增?，F(xiàn)在更為簡(jiǎn)單的方法是 在反應(yīng)混合物中加入可視染料（如FD試劑，朗普熒光可視試劑），陽(yáng)性反應(yīng)管的顏色從淺 灰色變?yōu)榫G色，陰性反應(yīng)管則保持原來(lái)的淺灰色。
[0008] 本發(fā)明針對(duì)伊氏李斯特菌的種特異基因 smcL(NC_015713. 1，Listeriaivanovii, Liv)設(shè)計(jì)一套環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物，旨在建立一種針對(duì)該病原的快速、敏感和特異的核酸 檢測(cè)體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一組能夠應(yīng)用細(xì)菌檢測(cè)，特別是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的核 苷酸序列，更進(jìn)一步提供環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)伊氏李斯特菌的方法，以及應(yīng)用于該方 法的試劑盒。
[0010] 基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種核苷酸序列組合，所述組合由SEQ ID NO: 1-6組成。所述序列是根據(jù)伊氏李斯特菌種特異性基因 Smcl設(shè)計(jì)的LAMP反應(yīng)引物，其 中，SEQ ID N0:1和2為外引物，SEQ ID N0:3和4為內(nèi)引物，SEQ ID N0:5和6為環(huán)引物。 [0011] 其次，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸組合在伊氏李斯特菌鑒定中的應(yīng)用。
[0012] 再次，本發(fā)明又提供了一種用于檢測(cè)伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步 驟：
[0013] (1)將待檢測(cè)樣本、序列如SEQ ID N0:l-2所示的一對(duì)外引物、序列如SEQ ID NO: 3-4所示的一對(duì)內(nèi)引物、序列如SEQ ID NO: 5-6所示的一對(duì)環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合 酶、MgS04、甜菜堿以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液加入到反應(yīng)容器中；
[0014] ⑵將步驟⑴所得的混合液放置于63°C恒溫環(huán)境中進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)；
[0015] (3)檢測(cè)步驟⑶獲得的產(chǎn)物。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述MgSOJ^濃度為4mM，所述甜菜堿的濃度為0. 8mM。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（1)中所述待檢測(cè)樣本為DNA提取物。
[0018] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（2)中所述的DNA擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。
[0019] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（3)所述的檢測(cè)方法可以是目測(cè)判讀、瓊脂糖凝 膠電泳判讀、或者實(shí)時(shí)濁度儀判讀。
[0020] 優(yōu)選地，在檢測(cè)前在反應(yīng)體系加入熒光試劑，步驟（3)所述的檢測(cè)方法為目測(cè)判 讀。
[0021] 最后，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)伊氏李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括：序列如 SEQ ID NO: 1-2所示的一對(duì)外引物、序列如SEQ ID N0:3-4所示的一對(duì)內(nèi)引物、序列如SEQ ID NO: 5-6所示的一對(duì)環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜堿、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖 液。
[0022] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述MgSOJ^濃度為4mM，所述甜菜堿的濃度為0. 8mM。
[0023] 本發(fā)明提供的組合序列在使用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)伊氏李斯特菌的方法中 顯示了優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡(jiǎn)便性。
[0024] 運(yùn)用連續(xù)稀釋好的伊氏李斯特基因組DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示： LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度比普通PCR方法高100倍，比Real-time PCR方法高10倍。
[0025] LAMP在模擬糞便中的檢測(cè)下限為8 X 103CFU/g，而Real-time PCR擴(kuò)增檢測(cè)在模 擬糞便中的檢測(cè)下限為8X 104CFU/g。結(jié)果表明，在實(shí)際應(yīng)用中，LAMP檢測(cè)方法10倍敏感 于 Real-time PCR 檢測(cè)。
[0026] 該體系在檢測(cè)26種其他常見(jiàn)致病菌和機(jī)會(huì)致病菌共94株時(shí)未出現(xiàn)非特異性擴(kuò) 增，說(shuō)明該檢測(cè)體系的特異性良好。
[0027] 使用LAMP技術(shù)在模擬糞便中僅需一次增菌培養(yǎng)6小時(shí)就能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。
[0028] 本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法的結(jié)果判讀不僅可以使用瓊脂糖凝膠電泳判讀、或者實(shí) 時(shí)濁度儀判讀，還可以在事先加入熒光試劑的情況下直接使用肉眼進(jìn)行目測(cè)判讀，具有極 高的簡(jiǎn)便性，適合檢測(cè)條件較差的應(yīng)急檢測(cè)和基層檢測(cè)。
[0029] 綜上所述，基于本發(fā)明表現(xiàn)出的優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡(jiǎn)便性，本發(fā)明 提供的組合序列及使用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)伊氏李斯特菌的方法具有極為廣闊的應(yīng) 用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖I. LAMP引物設(shè)計(jì)的位置和方向示意圖；
[0031] 圖2A. LAMP反應(yīng)的目測(cè)濁度結(jié)果圖；
[0032] 圖2B. LAMP反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；
[0033] 圖3.使用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)LAMP靈敏性的結(jié)果圖；
[0034] 圖4.使用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)普通PCR靈敏性的結(jié)果圖；
[0035] 圖5.使用熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)Real-time PCR靈敏性的結(jié)果圖；
[0036] 圖6.使用實(shí)時(shí)濁度儀評(píng)價(jià)LAMP靈敏性的結(jié)果圖；
[0037] 圖7.使用實(shí)時(shí)濁度儀評(píng)價(jià)LAMP快速性的結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。
[0039] 引物設(shè)計(jì)
[0040] 根據(jù)伊氏李斯特菌種特異性基因 smcL(NC_015713. 1，Listeria ivanovii，Liv)設(shè) 計(jì)LAMP反應(yīng)引物，該基因存在于伊氏李斯特菌所有亞種中，其特異性好，可以將伊氏李斯 特菌與其他密切相近的菌種（如單增李斯特菌，希爾李斯特菌，威爾李斯特菌，伊洛克李斯 特菌，格氏李斯特菌）和菌屬（如芽孢桿菌屬）區(qū)分開(kāi)。利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)軟 件 Primerexplorer V4 (http: //primerexplorer. ip/e/)和弓|物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5. 0設(shè)計(jì)LAMP引物,并將獲得的特異性引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. CRi)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹 配，最終獲得優(yōu)化后的一套環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物。引物設(shè)計(jì)的位置和方向見(jiàn)圖1，序列見(jiàn)表 1〇
[0041] 表1.本發(fā)明檢測(cè)所有引物和探針序列一覽表
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種核苷酸序列組合，由SEQ ID NO: 1-6組成。
2. 權(quán)利要求1所述的核苷酸組合在伊氏李斯特菌鑒定中的應(yīng)用。
3. -種用于檢測(cè)伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 將待檢測(cè)樣本、序列如3￡〇10勵(lì):1-2所示的一對(duì)外引物、序列如3￡〇10從):3-4所 示的一對(duì)內(nèi)引物、序列如SEQ ID N0:5-6所示的一對(duì)環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgS04、 甜菜堿以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液加入到反應(yīng)容器中； (2) 將步驟（1)所得的混合液放置于63°C恒溫環(huán)境中進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)； (3) 檢測(cè)步驟（3)獲得的產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述MgSO 4的濃度為4mM，所述甜菜堿的 濃度為〇. 8mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述待檢測(cè)樣本為DNA提 取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的DNA擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間 為60分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述的檢測(cè)方法可以是目測(cè) 判讀、瓊脂糖凝膠電泳判讀、或者實(shí)時(shí)濁度儀判讀。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在檢測(cè)前在反應(yīng)體系加入熒光試劑，步驟 (3)所述的檢測(cè)方法為目測(cè)判讀。
9. 一種檢測(cè)伊氏李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括：序列如SEQ ID NO: 1-2所示的 一對(duì)外引物、序列如SEQ ID N0:3-4所示的一對(duì)內(nèi)引物、序列如SEQ ID N0:5-6所示的一對(duì) 環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgS04、甜菜堿、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述MgSO 4的濃度為4mM，所述甜菜堿 的濃度為〇. 8mM。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104498487SQ201410725837
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】王毅, 葉長(zhǎng)蕓, 王艷 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所