一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，該方法包括：（1)將免疫磁珠與液體形式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，以捕獲待測(cè)樣品中可能存在的沙門氏菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到■’(2)將步驟（1)中可能捕獲了沙門氏菌的免疫磁珠與液體培養(yǎng)基混合，并將所得混合物置于能夠使沙門氏菌增殖的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；（3)采用針對(duì)沙門氏菌的特異性引物對(duì)步驟（2)經(jīng)培養(yǎng)獲得的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)樣品中沙門氏菌的存在。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單快捷，所需時(shí)間短，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用性強(qiáng)，特別有利于大范圍的應(yīng)用推廣，對(duì)食品安全監(jiān)測(cè)監(jiān)管具有重大意義。
【專利說明】一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 致病菌（Pathogenic bacteria)能引起疾病的微生物稱為病原微生物或致病菌。 病原微生物包括細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次氏體、衣原體、支原體、真菌及放線菌等。一般所 說的致病菌指的是病原微生物中的細(xì)菌。細(xì)菌的致病性與其毒力、侵入數(shù)量及侵入門戶有 關(guān)。雖然絕大多數(shù)細(xì)菌是無(wú)害甚至有益的，但是相當(dāng)大一部分可以致病。條件致病菌只在 特定條件下致病，如有傷口可以允許細(xì)菌進(jìn)入血液，或者免疫力降低時(shí)。例如，金黃色葡萄 球菌和鏈球菌也是正常菌群，常可以存在于體表皮膚，鼻腔而不引起疾病，但可以潛在引起 皮膚感染，如肺炎（pneumonia)、腦膜炎（meningitis)和敗血癥（sepsis)等。
[0003] 沙門氏菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，不形成芽胞，臨床上可表現(xiàn)為胃腸炎、腸熱 病、菌血癥綜合征或局灶性疾病。受此菌威脅最大的是嬰幼兒、老人及免疫缺陷個(gè)體。據(jù)統(tǒng) 計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地 區(qū)也以沙門氏菌為首位。當(dāng)前，各國(guó)政府和學(xué)術(shù)研究機(jī)構(gòu)都在致力于食品安全問題的研究， 食品安全問題受到了空前的關(guān)注。
[0004] 沙門氏菌檢測(cè)的常規(guī)方法是目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在使用的方法，主要步 驟為前增菌（8-18h)、增菌（18-24h)、平板培養(yǎng)分離（18-24h)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定，由 于其檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠快速檢測(cè)沙門氏菌的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配合使用免疫 磁分離技術(shù)與PCR擴(kuò)增的方法特別有利于實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速特異性檢測(cè)。因此，本發(fā)明 提供了一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)將免疫磁珠與液體形式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，以捕獲待測(cè)樣品中可能存在的 沙門氏菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0008] (2)將步驟⑴中可能捕獲了沙門氏菌的免疫磁珠與液體培養(yǎng)基混合，并將所得 混合物置于能夠使沙門氏菌增殖的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0009] (3)采用針對(duì)沙門氏菌的特異性引物對(duì)步驟（2)經(jīng)培養(yǎng)獲得的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)樣品中沙門氏菌的存在。
[0010] 本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單快捷，所需時(shí)間短，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用性 強(qiáng)，特別有利于大范圍的應(yīng)用推廣，對(duì)食品安全監(jiān)測(cè)監(jiān)管具有重大意義。
[0011] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0013] 圖1是實(shí)施例1中部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中，M為Marker，1-3為實(shí)驗(yàn)組 1-3的電泳結(jié)果，4為死菌組4的電泳結(jié)果，5為陽(yáng)性對(duì)照組5的電泳結(jié)果，6為陰性對(duì)照組 6的電泳結(jié)果；
[0014] 圖2是實(shí)施例1中另一部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中，M為Marker，1為陰性 對(duì)照組7的電泳結(jié)果，2為陰性對(duì)照組8的電泳結(jié)果，3為陰性對(duì)照組9的電泳結(jié)果，4為陽(yáng) 性對(duì)照組5的電泳結(jié)果；
[0015] 圖3是實(shí)施例2中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中，M為Marker，1和2為陰性對(duì)照 組5和6的電泳結(jié)果，3和4為陽(yáng)性對(duì)照組3和4的電泳結(jié)果，5和6為實(shí)驗(yàn)組1和2的電 泳結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0017] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的術(shù)語(yǔ)"免疫磁珠"是指通過偶聯(lián)反 應(yīng)將抗體結(jié)合到磁性微球（或磁球）的表面上，形成的免疫磁性微球；術(shù)語(yǔ)"PCR"是指聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；術(shù)語(yǔ)"引物"包括至少一個(gè)上游引物和至少一個(gè)下游引物；本發(fā)明中使用的液 體體積均為20°C下的數(shù)值。
[0018] 本發(fā)明提供的快速檢測(cè)沙門氏菌的方法包括以下步驟：
[0019] (1)將免疫磁珠與液體形式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，以捕獲待測(cè)樣品中可能存在的 沙門氏菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0020] (2)將步驟（1)中可能捕獲了沙門氏菌的免疫磁珠與液體培養(yǎng)基混合，并將所得 混合物置于能夠使沙門氏菌增殖的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0021] (3)采用針對(duì)沙門氏菌的特異性引物對(duì)步驟（2)經(jīng)培養(yǎng)獲得的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)樣品中沙門氏菌的存在。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，抗體與磁球偶聯(lián)獲得所述免疫磁珠的方法可以為常規(guī)方法，例 如，可以按照文獻(xiàn)（劉輝榮等，簡(jiǎn)便高效分離細(xì)胞新型免疫磁珠制備，中國(guó)公共衛(wèi)生， 2008,11:1349-1351)中的方法進(jìn)行。
[0023] 為了捕獲待測(cè)樣品中的沙門氏菌，所述抗體為能夠與沙門氏菌特異性結(jié)合的抗 體，優(yōu)選地，所述抗體為編號(hào)為L(zhǎng)S-C103073的LSBIO單克隆抗體（該抗體可以從LSBIO公司 商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為L(zhǎng)S-C103073)和/或編號(hào)為01-95-99的KPL多克隆抗體（該 抗體可以從美國(guó)KPL公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat.#)為01-95-99)。采用該優(yōu)選的抗體（特 別是所述多克隆抗體）能夠?qū)崿F(xiàn)沙門氏菌的活菌體檢測(cè)，進(jìn)一步提高了本發(fā)明的檢測(cè)方法 的實(shí)際使用價(jià)值。
[0024] 優(yōu)選情況下，每毫克的磁球上偶聯(lián)的抗體的量為0. 05_2mg。
[0025] 優(yōu)選情況下，相對(duì)于每毫升的液體形式的待測(cè)樣品，以磁球的重量計(jì)，所述免疫磁 珠的用量為10-25 iig。
[0026] 所述磁球可以為各種常規(guī)用于免疫磁分離的磁球，例如，可以為表面修飾有氨基 或羧基的超順磁性Fe3O4聚苯乙烯復(fù)合微球。優(yōu)選情況下，所述磁球的粒徑為150-200nm。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，利用免疫磁珠捕獲沙門氏菌可以借助免疫磁分離系統(tǒng)（例如Matrix Pathatrix免疫磁分離系統(tǒng)）或磁力架進(jìn)行，對(duì)所述捕獲的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地， 步驟（1)中，捕獲的條件包括：溫度為35-38°C，時(shí)間為25-35 min。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，為了準(zhǔn)確地檢測(cè)待測(cè)樣品中沙門氏菌的存在，需要在免疫磁分離之 后對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)增處理，從而擴(kuò)增待測(cè)樣品中可能存在的沙門氏菌。所述液體培 養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)用于沙門氏菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，如緩沖蛋白胨水或營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。 培養(yǎng)的溫度可以為35-38°C。培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為4-8h(更優(yōu)選為4-6h)?？梢岳脫u床進(jìn) 行所述培養(yǎng)，而搖床的轉(zhuǎn)速通?？梢栽O(shè)置為100_200rpm。本發(fā)明中，經(jīng)培養(yǎng)步驟獲得的培養(yǎng) 物即可直接作為PCR擴(kuò)增的模板。本發(fā)明采用先進(jìn)行免疫磁分離，再增殖培養(yǎng)，在很大程度 上減少了檢測(cè)所需的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明，PCR擴(kuò)增所用的特異性引物為能夠特異地?cái)U(kuò)增沙門氏菌的invA(侵 襲蛋白 A，invasionprotein A)基因（例如 GenBank Accession Number :M90846.1)和 / 或 FimY(菌毛 Y 蛋白，fimbriae Y protein)基因（例如 GenBank Accession Number: JQ665438. 1)的引物。其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，PCR擴(kuò)增所用的特 異性引物由序列如SEQ ID N0:l(5'-TCCTCCGCTCTGTCTACTTA-3'）所示的正向引物和序 列如SEQ ID NO: 2 (5 ' -ACCGAAATATTCATTGACGTT-3 '）所示的反向引物組成，或者由序 列如 SEQ ID NO: 3 (5 ' -GCCGGTAAACTACACGATGA-3 '）所示的正向引物和序列如 SEQ ID N0:4(5' -GAGTTACTGAACCAACAGCT-3'）所示的反向引物組成。
[0030] 本發(fā)明中，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中存在特異性引物能夠擴(kuò)增的目的DNA片段，那么說 明樣品中存在沙門氏菌?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的電泳檢測(cè)方法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中可能存在的 DNA片段，從而判斷待測(cè)樣品中是否存在沙門氏菌，例如，瓊脂糖凝膠電泳（AGE)，電泳的具 體條件可以包括：電壓為3-15V/cm，時(shí)間為20-40min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為8-20ii L。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，待測(cè)樣品可以為食品、環(huán)境用水（包括城市廢水、工業(yè) 廢水、農(nóng)業(yè)用水、城市用水、特種用水等）和藥品中的至少一種。具體地，可以按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB4789. 1-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》中的方法取得待測(cè)樣品。
[0032] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，緩沖蛋白胨水購(gòu)自北 京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；使用的菌株均通過商購(gòu)獲得，且分別購(gòu)自ATCC(美國(guó)典型菌種 保藏中心）、CGMCC(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心）和CMCC(中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保 藏管理中心）；1_乙基-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS) 購(gòu)自Sigma公司；使用的特異性引物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；磁分離在磁力 架上進(jìn)行；將從LSBIO公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為L(zhǎng)S-C103073的抗體作為特異性抗 體。
[0033] 制備實(shí)施例1
[0034] 本制備實(shí)施例1使用抗體1制備本發(fā)明的方法所用的免疫磁珠。
[0035] 將通過1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)活化的表面修飾有羧基的超順磁性Fe3O4聚苯乙烯復(fù)合微球（購(gòu)自上海奧潤(rùn)微納新 材料科技有限公司，PM3-020型聚合物磁球，濃度為10mg/mL，粒徑為180nm，表面修飾有羧 基官能團(tuán)）作為磁球使用，取2mg磁球，分散磷酸緩沖溶液中，分散液中磁球的濃度為2mg/ mL。取0? 2mg特異性抗體（溶于ImL的磷酸緩沖液中）與2mg磁球混合，室溫下在搖床 (200r/min)中保持3h，然后通過磁分離進(jìn)行清洗，去除未偶聯(lián)到磁球表面的特異性抗體， 采用BioSpec-nano儀（SHIMADZU，日本）檢測(cè)未偶聯(lián)的微量抗體，且測(cè)得未偶聯(lián)到磁球表面 的特異性抗體的量為300ng。接著用濃度為1% (w/v)的牛血清白蛋白溶液（溶于磷酸緩 沖液），在37°C下封閉30min，然后通過磁分離進(jìn)行清洗，洗去多余的牛血清白蛋白溶液，即 得到免疫磁珠。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 本實(shí)施例用來說明本發(fā)明方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。
[0038] 將不同的菌株（見表1)與2mL的PBS混合得到不同濃度的菌懸液（即待測(cè)樣品）， 并按照以下方式進(jìn)行免疫磁珠捕獲、細(xì)菌培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，其中，死菌組的待測(cè)樣 品通過將菌懸液置于121°C、0. 103MPa的條件下30min進(jìn)行滅活而獲得。
[0039] 表 1
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 將免疫磁珠與液體形式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，以捕獲待測(cè)樣品中可能存在的沙門 氏菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到； (2) 將步驟（1)中可能捕獲了沙門氏菌的免疫磁珠與液體培養(yǎng)基混合，并將所得混合 物置于能夠使沙門氏菌增殖的條件下進(jìn)行培養(yǎng)； (3) 采用針對(duì)沙門氏菌的特異性引物對(duì)步驟⑵經(jīng)培養(yǎng)獲得的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)樣品中沙門氏菌的存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體為編號(hào)為L(zhǎng)S-C103073的LSBIO單克隆 抗體和/或編號(hào)為01-95-99的KPL多克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，每毫克的磁球上偶聯(lián)的抗體的量為0. 〇5-2mg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述磁球?yàn)楸砻嫘揎椨邪被螋然某槾判?Fe3O4聚苯乙烯復(fù)合微球。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，相對(duì)于每毫升的液體形式的待測(cè) 樣品，以磁球的重量計(jì),所述免疫磁珠的用量為10-25 ii g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟（1)中捕獲的條件包括：溫度為35-38°C，時(shí) 間為 25-35min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟（2)中培養(yǎng)的時(shí)間為4-8h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟（3)中PCR擴(kuò)增所用的特異性引物為能夠特 異地?cái)U(kuò)增沙門氏菌的invA基因和/或FimY基因的引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其中，PCR擴(kuò)增所用的特異性引物由序列如SEQ ID NO: 1所示的正向引物和序列如SEQ ID N0:2所示的反向引物組成，或者由序列如SEQ ID N0:3所示的正向引物和序列如SEQ ID N0:4所示的反向引物組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK104212887SQ201410400047
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】杜美紅, 孫永軍, 許迪宰, 楊寅, 陳婷 申請(qǐng)人:北京市理化分析測(cè)試中心