雜交瘤細胞株FQ-Aa6及其產(chǎn)生的抗重金屬鎘單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株FQ-Aa6，及其抗重金屬鎘的單克隆抗體。雜交瘤細胞株FQ-Aa6，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC?NO.C201458。其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體可識別重金屬離子鎘，靈敏度高、特異性好，對重金屬離子鎘的50％抑制濃度IC50為5.2ng·mL-1。由該單克隆抗體研制的酶聯(lián)免疫檢測方法可實現(xiàn)水中重金屬鎘離子的檢測。
【專利說明】雜交瘤細胞株FQ-Aa6及其產(chǎn)生的抗重金屬鎘單克隆抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株FQ-Aa6,及其分泌的抗重金屬鎘離子的單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，給人類生活帶來極大方便的同時也造成了環(huán)境的嚴重 污染，包括重金屬污染。環(huán)境中重金屬鎘的主要污染來源包括：鉛鋅礦的開采、選礦和冶煉 過程中產(chǎn)生的廢水和廢氣；合金鋼的生產(chǎn)和加工過程；電鍍鎘的生產(chǎn)廢水，染料、農(nóng)藥、油 漆、玻璃、陶瓷、照相材料等生產(chǎn)和加工過程。鎘在環(huán)境中的殘留通過食物鏈逐漸富集，極微 量的鎘就可以對人體造成危害。1993年世界腫瘤研究機構(gòu)已將鎘定義為人類致癌物（group I)，鎘對環(huán)境的污染已引起普遍關(guān)注。因此對環(huán)境中重金屬鎘的檢測工作越來越受到人們 的關(guān)注。
[0003] 目前，重金屬的檢測多采用原子吸收光譜、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、離 子色譜儀、X射線熒光光譜法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法等化學(xué)儀器方法。這些傳統(tǒng)的檢測方 法雖具有較高的精確度與準確度，但檢測儀器昂貴，檢測相對費力、費時，且檢測工作往往 需要相對穩(wěn)定的實驗室環(huán)境，不適應(yīng)現(xiàn)實中對快速簡便檢測的需求。
[0004] 重金屬的免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、特異的優(yōu)點，便攜而有利于進行現(xiàn) 場監(jiān)測，克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點。但重金屬離子本身免疫原型低，很難制備出針對重金 屬離子的單克隆抗體。因此，為克服該困難，本發(fā)明通過化學(xué)合成高選擇性重金屬離子捕獲 螯合劑，制備重金屬離子螯合物，與載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原，篩選出能夠分泌針對環(huán)境 水中重金屬鎘離子的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。并利用該雜交瘤細胞株所分泌的 單克隆抗體建立了針對環(huán)境水中重金屬鎘離子的酶聯(lián)免疫檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供雜交瘤細胞株FQ_Aa6,及其分泌的抗重金屬鎘離子的單克隆 抗體。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 1)抗原制備：
[0008] 分別稱取血藍蛋白和牛血清白蛋白10mg溶于0. 5mL，濃度為10mM，pH9. 0的 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液中形成血藍蛋白和牛血清白蛋白溶液；
[0009] 稱取10mg金屬螯合劑1- (4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸溶于lmL二甲基亞砜 中形成23nM金屬螯合劑溶液；
[0010] 分別取78. 1 μ L濃度為23nM的金屬螯合劑溶液輕輕攪拌下逐滴滴加到0. 5mL血 藍蛋白和牛血清白蛋白溶液中，用10MK0H調(diào)節(jié)pH至9.0,室溫下反應(yīng)24小時；
[0011] 反應(yīng)產(chǎn)物用30Kd的超濾管純化，超濾管預(yù)先用lOOmM乙二胺四乙酸浸泡，用超純 水充分沖洗后，超濾管內(nèi)加入反應(yīng)產(chǎn)物超濾，超濾管內(nèi)先用10mM，pH9. 0的N-2-羥乙基哌 嗪-N-2-乙磺酸緩沖液沖洗3次，再用10mM，pH7. 4的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液 洗2次除去其中未反應(yīng)的小分子金屬螯合劑，所得產(chǎn)物即分別為純化的血藍蛋白-1-(4-異 硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸和牛血清白蛋白-1- (4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸溶液， 將牛血清白蛋白-1-(4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸溶液等分成兩份，一份直接用作包 被抗原，另一份與金屬鎘離子螯合；
[0012] 53. 7mg純度為99. 999 %的鎘粒溶于100 μ L優(yōu)級濃硝酸，待充分溶解加超純水使 終體積為lmL，形成477. 8mM鎘溶液；
[0013] 取18.8yL濃度為477.8mM的鎘溶液攪拌下逐滴滴加到純化過的血藍蛋 白-1-(4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸中，取8. 9 μ L濃度為477. 8mM的鎘溶液攪拌下 逐滴滴加到純化過的牛血清白蛋白-1-(4-異硫氰基苯基）_乙二胺四乙酸中，用0.5M鹽 酸調(diào)節(jié)pH至7. 0,室溫下反應(yīng)3小時。用30Kd的超濾管進行純化去除未反應(yīng)的金屬離子， 純化后的產(chǎn)物分別為血藍蛋白-1- (4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸-Cd和牛血清白蛋 白-1- (4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸_Cd。其中血藍蛋白-1- (4-異硫氰基苯基）-乙 二胺四乙酸-Cd為免疫原，牛血清白蛋白-1- (4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸-Cd為包 被源。
[0014] 2)小鼠免疫
[0015] 將制備好的免疫原免疫6-8周齡雌性BAIB/C小鼠，每次每只小鼠的免疫原用量為 200 μ g(以蛋白含量計算），共免疫五次。從第四次開始，每次免疫后一周，鼠尾靜脈采血， 用間接非競爭ELISA法檢測抗體的效價與特異性。
[0016] 3)細胞融合
[0017] 通過差異率篩選BAIB/C小鼠，差異率超過50%的BAIB/C小鼠用N-2-羥乙基哌 嗪-N-2-乙橫酸緩沖液稀釋血藍蛋白-1-(4-異硫氰基苯基）-乙二胺四乙酸-Cd直接免 疫，三天后取脾臟，脾細胞和對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞通過雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤 細胞，37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-14天后，通過檢測融合孔上清篩選雜交瘤細胞；
[0018] 4)雜交瘤細胞篩選
[0019] 融合孔上清首先采用間接非競爭ELISA法進行初步篩選，得到效價較高的融合孔 后，用間接競爭ELISA法確認融合孔上清（雜交瘤細胞分泌的抗體）對重金屬鎘離子是否 識別。對存在識別性的融合孔進行亞克?。ㄌ荻认♂尫ǎ?，重復(fù)上述篩選程序。經(jīng)過3-5個 周期的篩選，確定能夠識別重金屬鎘離子的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體。
[0020] 5)雜交瘤細胞株的保藏
[0021] 本發(fā)明所涉及的能夠分泌識別重金屬鎘離子單克隆抗體的雜交瘤細胞株于2014 年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址，中國武漢武漢大學(xué)；保藏編號 CCTCC NO :C201458 ;分類名稱：雜交瘤細胞株FQ-Aa6。
[0022] 有益效果
[0023] (1)抗體的穩(wěn)定性好：雜交瘤細胞凍存于液氮至少保持5年，抗體的穩(wěn)定性也會比 較好，純化的抗體_20°C冰箱至少可以存放2年。
[0024] (2)抗體特異性高：本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株FQ_Aa6所分泌的抗重金屬鎘單克 隆抗體與Hg 2+的交叉反應(yīng)為1. 21 %，與其余金屬暫未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測重金屬鎘的單克隆抗體，由保藏編號為CCTCC N0:C201458的雜交瘤 細胞株FQ_Aa6產(chǎn)生，為IgGl型，抗體輕鏈為kappa鏈。
2. 產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的用于檢測重金屬鎘的單克隆抗體的雜交瘤細胞株FQ-Aa6,于 2014年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:C201458。
【文檔編號】C12N5/20GK104151431SQ201410399821
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】劉鳳權(quán), 王利民, 蔡佳, 王玉龍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)