抗凝血因子viii單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法，具體地，涉及抗人凝血因子VIII單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血因子是參與凝血過程的一種重要蛋白質(zhì)成分。它的生理作用是，在血管出血 時被激活，和血小板粘連在一起補塞血管上的漏口。這個過程被稱為凝血。在血友病患 者中，80%的病人是血友病A，即甲型血友病，該類病人主要缺少正常人所擁有的凝血因子 VIII。甲型血友病是一種終生性疾病，目前仍沒有根治的方法，只能通過輸注人凝血因子 VIII替代產(chǎn)品進(jìn)行治療。
[0003] 凝血因子VIII分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量為330kDa，是一種較大的血衆(zhòng)蛋白分子。其 在血漿中的含量僅為0. 1-0. 2 μ g/mL，半衰期約為12小時。由于其提取技術(shù)非常困難，而我 國在大規(guī)模親和層析技術(shù)上比較落后，目前尚沒有親和層析法制備的高純凝血因子類產(chǎn)品 問世。因此，造成了目前國內(nèi)市場上凝血因子VIII產(chǎn)品嚴(yán)重不足，不能充分供給國內(nèi)甲型 血友病患者使用，經(jīng)常會出現(xiàn)斷藥的情況，危害國內(nèi)患者的健康和生命安全。
[0004] 血漿蛋白的層析分離技術(shù)的難點在于血漿的高粘度和一次處理的巨大體積。對于 凝血因子類微量血漿蛋白的分離，親和層析是最佳的純化方式。目前，國際上多數(shù)企業(yè)，包 括最大的血液制品企業(yè)CSL也采用低溫乙醇聯(lián)合層析的方法來分離血漿蛋白。在上世紀(jì)90 年代，百特已采用抗體親和層析法來制備超純VIII因子和VII因子，比活性可達(dá)3000IU/ mg，總體活性回收率超過30%。而我國目前制備VIII因子則仍采用冷沉淀粗制獲得，比活 性多低于l〇〇IU/mg，活性回收率約在6%左右。
[0005] 因此，為了利用親和層析大幅度提高凝血因子的分離效率，其關(guān)鍵技術(shù)瓶頸是制 備有效的親和層析用抗體。因而，本領(lǐng)域中存在著對特異性凝血因子VIII單克隆抗體的需 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株及其制備方法。
[0007] 在第一個方面，本發(fā)明提供了一種制備分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株的方法（在本文中有時也簡稱為"本發(fā)明的方法"），所述方法包括以下步驟：
[0008] 1)制備免疫抗原：通過同型雙功能蛋白交聯(lián)劑將人凝血因子VIII與牛血清白蛋 白偶聯(lián)，得到人凝血因子VIII-牛血清白蛋白偶聯(lián)物；
[0009] 2)免疫小鼠：采用小劑量長周期免疫方案，利用步驟1)中得到的人凝血因子 VIII-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作用免疫抗原，對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫；
[0010] 3)細(xì)胞融合：將SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞與步驟2)獲得的免疫Balb/c小鼠的脾臟 細(xì)胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；
[0011] 4)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：在步驟3)中融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中選擇性 培養(yǎng)后，選擇小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠雜交瘤細(xì)胞SP2/0的融合細(xì)胞；以及
[0012] 5)單克隆化：將步驟4)中獲得的經(jīng)檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行 多次單克隆獲得穩(wěn)定分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0013] 在第二個方面，本發(fā)明提供了分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株（下文中有時稱為"本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株"），所述雜交瘤細(xì)胞株是通過本發(fā)明的方法 制備的。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明的方法制備的一株雜交瘤細(xì)胞株于2015 年11月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏 中心，保藏編號為CCTCC C2015196,培養(yǎng)物名稱為：雜交瘤細(xì)胞株F8-M-01。
【具體實施方式】
[0015] 定義：
[0016] "蛋白交聯(lián)劑"是一類小分子化合物，其分子兩端各有一個或者更多個針對特殊基 團(tuán)（-nh2、-cooh、-hs等）的反應(yīng)性末端，可以和生物分子上的活性基團(tuán)分別偶聯(lián)，從而使這 些分子結(jié)合在一起。蛋白交聯(lián)劑可分為同型雙功能交聯(lián)劑（也稱為"同源交聯(lián)劑")、異型雙 功能交聯(lián)劑（也稱為"異源交聯(lián)劑"）和光活化交聯(lián)劑（也稱為"光反應(yīng)性交聯(lián)劑"）三類。
[0017] 同型雙功能蛋白交聯(lián)劑的分子兩端具有相同的反應(yīng)性末端或活化反應(yīng)基團(tuán)。常用 的同型雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是公知的，其非限制實例包括但不限于，NHS酯類交聯(lián)劑諸 如N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)、二硫代雙（琥珀酰亞胺基丙酸酯）（DSP)和3, 3' -二硫代雙 (磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）（DTSSP)、琥珀酸辛二酸二亞胺（DSS)和丁二烯-苯乙烯共聚 物（BS)、酒石酸二琥珀酰亞胺酯（DST)和Sulfo-DST、雙（2-[琥珀酰亞胺氧羰基氧）乙基） 砜（BS0C0ES)和 sulfo-BSOCOES、乙二醇雙[琥珀酰亞胺基丁二酸](EGS)和 sulfo-EGS、琥 珀酸辛二酸戊二酸鹽（DSG)、Ν，Ν'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC);碳二亞胺類諸如1-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC);亞氨酯類交聯(lián)劑諸如二甲基二亞胺酯 (DMA)、二甲基亞胺酯（DMP)、二甲基苯二酸亞胺酯（DMS)、二叔丁基過氧化物（DTBP);巰基 反應(yīng)類交聯(lián)劑諸如1，4-二（3'-[2'_二硫基吡啶]丙酸酰氨基）丁烷（DTOPB);二氟苯衍 生物的1，5-二氟-2, 4-二硝基苯（DFDNB)、雙（4-氟-3-硝基苯基）亞砜（DFDNPS)等；光 反應(yīng)性交聯(lián)劑類交聯(lián)劑諸如雙-[β-(疊氮基水楊?；被┮一鵠二硫化物（BASED)等； 醛類交聯(lián)劑諸如甲醛、戊二醛等；雙環(huán)氧化物類的1，4-丁二醇縮水甘油醛等；酰肼類交聯(lián) 劑諸如己二酸二酰肼、碳酰肼等；雙重衍生物類交聯(lián)劑諸如被重氮的〇-聯(lián)甲苯胺、雙重氮 聯(lián)苯胺等；以及雙烷基鹵化物等。
[0018] 光反應(yīng)性交聯(lián)劑是具有光反應(yīng)性基團(tuán)的交聯(lián)劑。同型雙功能交聯(lián)劑的活化反應(yīng)基 團(tuán)也可以是光反應(yīng)性基團(tuán)。
[0019] 表1中列出了部分同型雙功能蛋白交聯(lián)劑的類型、反應(yīng)基團(tuán)、蛋白結(jié)合基團(tuán)、光活 化性等性質(zhì)。
[0020] 表 1
[0021]
[0022] "抗體" (antibody)指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增 殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。
[0023] 本發(fā)明提供了一種分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備方 法。
[0024] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0025] 1)制備免疫抗原：通過同型雙功能蛋白交聯(lián)劑將人凝血因子VIII與牛血清白蛋 白（BSA)偶聯(lián)，得到人凝血因子VIII-BSA偶聯(lián)物；
[0026] 2)免疫小鼠：采用小劑量長周期免疫方案，利用步驟1)中得到的人凝血因子 VIII-BSA偶聯(lián)物作用免疫抗原，對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫；
[0027] 3)細(xì)胞融合：將SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞與步驟2)獲得的免疫Balb/c小鼠的脾臟 細(xì)胞融合，在含有HAT的1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；
[0028] 4)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：在步驟3)中融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中選擇性 培養(yǎng)后，選擇小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠雜交瘤細(xì)胞SP2/0的融合細(xì)胞；以及
[0029] 5)單克隆化：將步驟4)中獲得的經(jīng)檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行 多次單克隆化獲得穩(wěn)定分泌抗人凝血因子VIII單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0030] 在本發(fā)明的方法中，可以采用本領(lǐng)域中公知的任意同型雙功能蛋白交聯(lián)劑，優(yōu)選 碳二亞胺類蛋白交聯(lián)劑，更優(yōu)選H)C。
[0031] 在本發(fā)明中，動物免疫采用小劑量多次免疫方案，以小鼠為例，常規(guī)以100~ 200 μ g/只的劑量免疫，免疫3~4次。一個具體的免疫方案實例是：使用免疫抗原對7周 齡的雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，按IOOyg/只的免疫劑量，與弗氏完全佐劑按體積比1:1 混合，乳化達(dá)到油包水狀，將乳化的完全抗原，頸背部多點皮下注射免疫小鼠，2周后，以相 同抗原和等體積的弗氏不完全佐劑乳化，100 μ g/只進(jìn)行加強免疫，2周后行第三次免疫， 劑量與方法同第二次免疫，在細(xì)胞融合前對小鼠進(jìn)行最后一次沖擊免疫，100 μ g/只的免疫 劑量腹腔注射。
[0032] 在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞融合的方法不受限制，可以采用本領(lǐng)域中公知的方法和 流程。
[0033] 在本發(fā)明的方法中，抗體檢測的方法不受限制，可以采用本