一種用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物篩選是新藥研究的最初過(guò)程和關(guān)鍵步驟，目的是發(fā)現(xiàn)新藥，然而很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，成本過(guò)高、周期過(guò)長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜、通量不足、成功率低下等缺點(diǎn)一直制約著現(xiàn)代藥物的篩選和開(kāi)發(fā)?，F(xiàn)階段以96孔板為基礎(chǔ)的高通量篩選由于其快速、高效等特點(diǎn)，適合藥物初步篩選，被國(guó)際大多數(shù)藥物研究機(jī)構(gòu)廣泛采用，并得到快速的發(fā)展，已成為藥物篩選的主要技術(shù)手段之一。然而這種基于常規(guī)孔板的藥物篩選方式存在一些局限，如試劑消耗大、操作繁瑣、檢測(cè)和分析靈敏度低等，這在很大程度上限制了其普及與應(yīng)用。因此，藥物篩選技術(shù)的微型化、自動(dòng)化和低成本化是未來(lái)發(fā)展的必然趨勢(shì)。
[0003]在20世紀(jì)90年代，瑞士的Manz和Widmer等首次提出了微流控芯片技術(shù)(Microfluidics)，該技術(shù)通過(guò)在大小僅為幾平方厘米的芯片上集成各種具有功能單元的微通道，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)和陣列，并通過(guò)操縱流體在通道中的行為以實(shí)現(xiàn)各種常規(guī)化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室中需要的甚至難以完成的功能。由于具有快速檢測(cè)分析、試劑消耗量少、靈活可控、信息量大、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)，如今這種技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物合成與篩選等領(lǐng)域，成為21世紀(jì)最為熱門(mén)的前沿技術(shù)之一。新藥研發(fā)是微流控芯片最重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一，微流控芯片的基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺(tái)上靈活組合、規(guī)模集成，利用微系統(tǒng)內(nèi)流體獨(dú)有的尺度效應(yīng)，成十倍、百倍地提高樣品處理和反應(yīng)效率，大幅降低樣品和試劑消耗，利用芯片快速和多通道的特點(diǎn)可顯著提高分析和篩選通量。由于諸多優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)可以克服傳統(tǒng)藥物篩選的限制，顯著縮短整個(gè)藥物篩選周期，微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)，給藥物篩選領(lǐng)域帶來(lái)了新的生機(jī)。
[0004]微流控芯片在細(xì)胞水平藥物篩選方面有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如微流控芯片操作所需的細(xì)胞量很少，適合來(lái)源稀缺但又十分重要的細(xì)胞研究；芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成相對(duì)獨(dú)立、封閉的環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境類(lèi)似，可以精確控制溫度、成分等因素，從而高度模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)；且由于微通道中的高表面積體積比，使得更多的界面可以用來(lái)進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，傳送效率提高，細(xì)胞代謝加快，且可以將藥物的合成分離富集、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物刺激、藥效實(shí)時(shí)檢測(cè)等多步工序集成在單片的微系統(tǒng)中。
[0005]目前，將微流控芯片技術(shù)用于細(xì)胞研究和藥物篩選等方面已有不少報(bào)道，如Ye等人在文南犬(Nannan Ye, Jianhua Qin, ffeiwei Shi, XinLiu, Bingchen Lin, Cell-basedhigh content screening using an integrated micfluidic device,LabChip, 2007,7(12), 1696-1704)中構(gòu)建了一種集成化細(xì)胞水平的藥物篩選微流控芯片，該芯片集濃度梯度稀釋和加樣、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞刺激和細(xì)胞標(biāo)記等單元操作于一體，實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞多種參數(shù)測(cè)量的高內(nèi)涵篩選；Wu等在文獻(xiàn)(Wu J1Wheeldon I1Guo Y, et al.A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughputscreening[J].B1materials, 2011, 32 (3): 841-848.)中設(shè)計(jì)了一種具有“三明治”夾層結(jié)構(gòu)的、細(xì)胞水平的陣列式高通量篩選芯片，通過(guò)熒光檢測(cè)藥物與乳腺癌細(xì)胞(MCF-7 )的相互作用，篩選出潛在的抗腫瘤藥物，實(shí)驗(yàn)采用9-羥基喜樹(shù)堿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證明其有效可行，該方法為藥物活性成分的篩選提供了一種快速、低成本的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述問(wèn)題，本實(shí)用新型提供一種用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片，該芯片含有濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)和陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，一次運(yùn)行即可獲得多個(gè)實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)，為藥物篩選和細(xì)胞-藥物研究提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的上述目的，本實(shí)用新型提供一種用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片，由上層的PDMS流體通道層與下層的適合細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的玻璃層構(gòu)成；所述PDMS流體通道層與玻璃層通過(guò)氧等離子鍵合構(gòu)成不可逆結(jié)構(gòu)的流體通道單元。
[0008]所述流體通道單元包括:位于芯片上游的濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)與位于芯片下游的陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)；所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)與陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)之間設(shè)有緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)，所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)、陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)、與緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)通過(guò)微通道相互連通。
[0009]所述陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)由若干列細(xì)胞培養(yǎng)單元并聯(lián)組成，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元由若干個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔通過(guò)微通道相互串聯(lián)組成一列，每?jī)闪屑?xì)胞培養(yǎng)單元的出口由微通道逐級(jí)互相連接，最終連接成一個(gè)出口通道，該出口通道末端作為細(xì)胞注入口。
[0010]所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)最上端設(shè)有若干個(gè)進(jìn)樣孔，所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)由多級(jí)相互連通的分支通道組組成，所述分支通道組由若干個(gè)分支通道相互連通組成，所述分支通道組的分支通道數(shù)量從進(jìn)樣孔向緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)逐層依次增加，至數(shù)量與細(xì)胞培養(yǎng)單元的列數(shù)相同；所述進(jìn)樣孔的數(shù)目大于I個(gè)小于細(xì)胞培養(yǎng)單元的列數(shù)。
[0011]所述緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)由若干列緩沖單元組成，所述緩沖單元的列數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)單元的列數(shù)相同。
[0012]所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)最下層分支通道的每一個(gè)出口，都通過(guò)所述緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)的一列緩沖單元與陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的一列細(xì)胞培養(yǎng)單元入口相連接。
[0013]所述陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)由四列或四列以上的細(xì)胞培養(yǎng)單元相互并聯(lián)組成，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元由三個(gè)或三個(gè)以上的細(xì)胞培養(yǎng)腔相互串聯(lián)組成一列，所述每列細(xì)胞培養(yǎng)單元中包含的細(xì)胞培養(yǎng)腔的數(shù)量相同。
[0014]所述進(jìn)樣孔為兩個(gè)，分別為藥物入口和培養(yǎng)基入口。
[0015]所述相鄰的分支通道組連通形成的橫向直型通道寬度為為200-400 μ m，彎曲的分支通道寬度為100-300 μ m。
[0016]所述細(xì)胞培養(yǎng)腔截面為圓形或橢圓形，尺寸為(0.8-1.2) X (0.8-1.2)mm。
[0017]所述微通道寬度為200-500 μ m。
[0018]所述緩沖單元的彎曲流道寬度為100-300 μπι。
[0019]所述芯片的濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)、陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)、緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)通道高度相同，為 80-200 μπ?ο
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比本實(shí)用新型的有益效果。
[0021]本實(shí)用新型提供的用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片，將藥物濃度梯度生成、芯片細(xì)胞培養(yǎng)、藥物對(duì)細(xì)胞刺激、結(jié)果生成與檢測(cè)集成在一張芯片上，并通過(guò)緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)的啟閉來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元(即濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)和陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū))的獨(dú)立工作與整體運(yùn)行，靈活實(shí)現(xiàn)各功能的切換，避免不同結(jié)構(gòu)間的互相干擾。采用本實(shí)用新型集成化微流控芯片研究臨床藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死作用，與傳統(tǒng)的孔板技術(shù)相比，省去了配制不同濃度藥物溶液的繁冗操作，大大簡(jiǎn)化了細(xì)胞接種、受激、洗滌和染色等操作過(guò)程，顯著降低細(xì)胞數(shù)量和試劑耗量，并可一次運(yùn)行獲得多個(gè)實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)，為藥物篩選和細(xì)胞-藥物研究提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本實(shí)用新型微流控芯片的總體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖2為本實(shí)用新型微流控芯片的結(jié)構(gòu)分解示意圖。
[0024]圖3為明場(chǎng)下肝腫瘤HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
[0025]圖4為L(zhǎng)IVE/DEAD染色后熒光顯微鏡下的培養(yǎng)24h肝腫瘤H印G2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0026]圖5為L(zhǎng)IVE/DEAD染色后熒光顯微鏡下的培養(yǎng)48h肝腫瘤H印G2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0027]圖6為L(zhǎng)IVE/DEAD染色后熒光顯微鏡下的培養(yǎng)72h肝腫瘤H印G2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0028]圖7為不同濃度槲皮素作用下Hoechst33342染色后焚光顯微鏡下的肝腫瘤HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)圖。
[0029]圖8為不同濃度槲皮素作用下PI染色后熒光顯微鏡下的肝腫瘤IfepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)圖。
[0030]圖9為各濃度槲皮素對(duì)肝腫瘤HepG2細(xì)胞的凋亡壞死影響折線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)用新型。
[0032]請(qǐng)參閱圖1、圖2，本實(shí)施例提供一種用于細(xì)胞水平藥物篩選的微流控芯片，由上層的PDMS流體通道層I與下層的適合細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的玻璃層2構(gòu)成；所述PDMS流體通道層I與玻璃層2通過(guò)氧等離子鍵合構(gòu)成不可逆結(jié)構(gòu)的流體通道單元。
[0033]所述流體通道單元包括:位于芯片上游的濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3與位于芯片下游的陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4 ;所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3與陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4之間設(shè)有緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5，所述緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5由八列緩沖單元6組成。所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3、陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4、與緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5通過(guò)微通道9相互連通。
[0034]所述陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4由八列細(xì)胞培養(yǎng)單元7并聯(lián)組成，所述并聯(lián)的八列細(xì)胞培養(yǎng)單元7通過(guò)微通道9相互聯(lián)通，所述每列細(xì)胞培養(yǎng)單元7均由五個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔8通過(guò)微通道9相互串聯(lián)組成一列，每?jī)闪屑?xì)胞培養(yǎng)單元7的出口由微通道9逐級(jí)互相連接，最終連接成一個(gè)出口通道10，該出口通道10末端作為細(xì)胞注入口 11。
[0035]所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3最上端設(shè)有兩個(gè)進(jìn)樣孔12，分別作為藥物入口 13與培養(yǎng)基入口 14。所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3為“圣誕樹(shù)”形，由多級(jí)相互連通的分支通道組15組成，所述分支通道組15由若干個(gè)分支通道16相互連通組成，所述分支通道組15的分支通道16數(shù)量從進(jìn)樣孔12向緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5逐層依次增加至八列；所述分支通道組15每增加一層，分支通道16的數(shù)量增加一個(gè)。
[0036]所述相鄰的分支通道組15連通形成的橫向直型通道寬度為300 μπι ;所述分支通道16為迂回的弧形，分支通道16的寬度為200 μπι。
[0037]所述濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3最下層分支通道的每一個(gè)出口，都通過(guò)所述緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5的一列緩沖單元6與陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4的一列細(xì)胞培養(yǎng)單元7入口相連通。
[0038]所述緩沖單元6設(shè)有兩個(gè)出液口 17及一段“S”形彎曲流道18，用于廢液排出及阻擋細(xì)胞懸液流入濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3，避免相互干擾；同時(shí)，通過(guò)緩沖結(jié)構(gòu)區(qū)5中各出液口 17的啟閉，可控制濃度梯度生成結(jié)構(gòu)區(qū)3與陣列式細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)4的獨(dú)立運(yùn)行與整體銜接，實(shí)現(xiàn)各功能的靈活切換。
[0039]