一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)及方法，該系統(tǒng)包括探測(cè)裝置、光鑷裝置、微流芯片、電動(dòng)載物臺(tái)、物鏡。該方法是利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，得到具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞以及沒(méi)有標(biāo)記的正常細(xì)胞，然后對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行激光掃描，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞在近紅外波段激光誘導(dǎo)下發(fā)射上轉(zhuǎn)換光，探測(cè)器一旦檢測(cè)到此上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，就通過(guò)光鑷技術(shù)將此細(xì)胞篩選出來(lái)，最終實(shí)現(xiàn)問(wèn)題細(xì)胞的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和分離。本發(fā)明降低了成本同時(shí)提高了所測(cè)信號(hào)的信噪比，有著極大的技術(shù)發(fā)展應(yīng)用空間和廣闊的市場(chǎng)前景，適用于基于微流控芯片的癌細(xì)胞診斷和操縱等結(jié)構(gòu)微型化器件。
【專利說(shuō)明】一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)及方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米光子學(xué)、生物光子學(xué)及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)等交叉【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]納米生物光子學(xué)是近些年新興的交叉領(lǐng)域?qū)W科，其將光學(xué)方法中無(wú)損、快速、實(shí)時(shí)探測(cè)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，同時(shí)結(jié)合納米材料技術(shù)，對(duì)于解決一些傳統(tǒng)生命科學(xué)的難題有其天然的優(yōu)越性。在癌細(xì)胞檢測(cè)、篩選、研究領(lǐng)域，傳統(tǒng)的拉曼系統(tǒng)常采用兩束不同激光，一束激光用來(lái)激發(fā)熒光檢測(cè)癌細(xì)胞，另一束激光則作為光鑷在檢測(cè)結(jié)束后對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行篩選。這些方法一方面使用拉曼方法檢測(cè)信號(hào)微弱，還有很大程度的背景熒光干擾；另一方面，雙光路系統(tǒng)對(duì)搭建要求較高，成本較高，細(xì)胞檢測(cè)及操作時(shí)間也較長(zhǎng)。這兩大缺點(diǎn)在一定程度上制約了癌細(xì)胞檢測(cè)控制系統(tǒng)的發(fā)展。
[0003]近年來(lái)，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料以其特殊的性能和廣泛的用途成為研究的焦點(diǎn)，在固體激光、太陽(yáng)能電池、光動(dòng)力治療、三維顯示，特別是作為生物標(biāo)記探針，在熒光成像方面有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料具有特殊的發(fā)光性質(zhì)，即能吸收兩個(gè)或多個(gè)低能光子而輻射一個(gè)高能光子，通常是將近紅外光轉(zhuǎn)換成可見光。它作為生物標(biāo)記的納米探針有許多優(yōu)點(diǎn)，如窄帶發(fā)射、高信噪比、抗光漂白、低細(xì)胞毒性等，同時(shí)采用近紅外激發(fā)可以減少對(duì)生物樣品的損傷。而光鑷技術(shù)是近二十年發(fā)展起來(lái)的新的激光顯微操縱與測(cè)量技術(shù)，它具有不接觸、無(wú)污染、作用力均勻、對(duì)生物體無(wú)損傷等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。
[0004]因此，如何將這些最新的技術(shù)應(yīng)用于癌細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)具有極大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、效率高以及速度快的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明還提供了一種基于上述系統(tǒng)的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，包括探測(cè)裝置、光鑷裝置、微流芯片、電動(dòng)載物臺(tái)、物鏡，微流芯片放置于電動(dòng)載物臺(tái)上，微流芯片上設(shè)有微流通道，微流通道內(nèi)流動(dòng)的細(xì)胞包括具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞以及正常細(xì)胞；物鏡設(shè)置在微流芯片的上方，光鑷裝置將近紅外波段激光通過(guò)物鏡照射在微流通道內(nèi)的細(xì)胞上，利用近紅外波段激光作為光鑷的光壓勢(shì)阱控制住當(dāng)前細(xì)胞；探測(cè)裝置通過(guò)物鏡采集當(dāng)前細(xì)胞所反射光信號(hào)，如果判斷此光信號(hào)是上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，則將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)問(wèn)題細(xì)胞排出通道排出，如果判斷是激發(fā)光信號(hào)，則將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)正常細(xì)胞排出通道排出。本發(fā)明采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用近紅外波段激光的光鑷作用實(shí)現(xiàn)對(duì)問(wèn)題細(xì)胞和正常細(xì)胞的篩選，大大簡(jiǎn)化了系統(tǒng)的搭建，降低了成本，提聞了系統(tǒng)穩(wěn)定性。[0008]優(yōu)選的，所述微流控系統(tǒng)還包括電機(jī)控制裝置和電機(jī)，所述微流芯片與電機(jī)連接，探測(cè)裝置與電機(jī)控制裝置相連，根據(jù)當(dāng)前細(xì)胞所反射光信號(hào)的不同，探測(cè)裝置通過(guò)電機(jī)控制裝置控制微流芯片在電動(dòng)載物臺(tái)上平移。從而實(shí)現(xiàn)問(wèn)題細(xì)胞和正常細(xì)胞在篩選后分別流出。
[0009]具體的，所述微流芯片以標(biāo)準(zhǔn)載玻片玻璃為基底，所述微流通道刻蝕在此基底上，微流通道包括標(biāo)記段、緩沖段、分流段，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針與待檢測(cè)細(xì)胞分別通過(guò)入口進(jìn)入標(biāo)記段內(nèi)進(jìn)行混合，在問(wèn)題細(xì)胞上進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記，然后進(jìn)入緩沖段，在緩沖段開始端還設(shè)有一用于細(xì)胞緩沖液流入的入口，在細(xì)胞緩沖液作用下，細(xì)胞逐個(gè)在微流通道中緩慢移動(dòng)直到分流段；分流段分為兩段，一段是具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞排出通道，一段是正常細(xì)胞的排出通道，分流段和緩沖段相交處的上方設(shè)有物鏡。
[0010]更進(jìn)一步的，所述標(biāo)記段上的微流通道為蛇形彎曲通道。采用這種通道可以增加上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針與待檢測(cè)細(xì)胞的作用時(shí)間，使問(wèn)題細(xì)胞均能夠得到上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記，從而提高篩選的準(zhǔn)確度。
[0011]更進(jìn)一步的，所述緩沖段中的起始段為一使細(xì)胞單個(gè)通過(guò)的窄通道。從而不僅通過(guò)緩沖液這一介質(zhì)減慢速度，同時(shí)也通過(guò)結(jié)構(gòu)來(lái)限制細(xì)胞單行通過(guò)，以便后面的篩選。
[0012]更進(jìn)一步的，所述分流段中，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞排出通道在物鏡下方，其通道的軸線與物鏡的光軸平行，正常細(xì)胞的排出通道與微流通道中的緩沖段末端同軸。采用這種結(jié)構(gòu)可以使微流通道加工更簡(jiǎn)單，安裝定位也更容易。
[0013]更進(jìn)一步的，所述微流通道上各出入口的開閉均通過(guò)壓電閥實(shí)現(xiàn)。微流通道經(jīng)過(guò)預(yù)處理后由壓電閥控制其液流流向及速度，使流動(dòng)平穩(wěn)且速度控制更精確。
[0014]優(yōu)選的，所述微流通道采用玻璃鍵合的方法密封。
[0015]作為一種優(yōu)選方式，所述光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器、擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡、和二色鏡，其中二色鏡特性為近紅外反射、可見光透過(guò)，所述半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次通過(guò)擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和二色鏡，二色鏡與該激光束成45度角放置，在垂直于該激光束且通過(guò)二色鏡光軸的方向上，物鏡同軸放置在二色鏡下方，二色鏡使激光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上；所述探測(cè)裝置包括濾光片和探測(cè)器，在垂直于激光束且通過(guò)二色鏡光軸的方向上，同軸放置在二色鏡上方。
[0016]作為另一種優(yōu)選方式，所述光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器、擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和第一二色鏡，其中第一二色鏡特性為近紅外反射、可見光透過(guò)，所述半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次通過(guò)擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和第一二色鏡，第一二色鏡與該激光束成45度角放置，在垂直于該激光束且通過(guò)第一二色鏡光軸的方向上，物鏡同軸放置在第一二色鏡下方，第一二色鏡使激光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上；所述探測(cè)裝置包括第二二色鏡，第二二色鏡同軸放置于第一二色鏡的上方，沿光束光軸方向依次設(shè)有聚焦透鏡、探測(cè)針孔、光柵和光電探測(cè)器。
[0017]一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法，利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，得到具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞以及沒(méi)有標(biāo)記的正常細(xì)胞，然后對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行激光掃描，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞在近紅外波段激光誘導(dǎo)下發(fā)射上轉(zhuǎn)換光，探測(cè)器一旦檢測(cè)到此上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，就通過(guò)光鑷技術(shù)將此細(xì)胞篩選出來(lái)。待測(cè)細(xì)胞在輸入系統(tǒng)中后，經(jīng)過(guò)上述微流控方法進(jìn)行篩選，將待測(cè)細(xì)胞分為問(wèn)題細(xì)胞和正常細(xì)胞，由于光鑷技術(shù)以及緩沖液的作用，細(xì)胞更容易計(jì)數(shù)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以進(jìn)一步得到問(wèn)題細(xì)胞所占的比例等信息，從而便于后面的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)。
[0018]優(yōu)選的，所述近紅外波段激光的波長(zhǎng)為910-1000納米。這個(gè)波段的光為近紅外光，是生物窗口，對(duì)生物樣品無(wú)害，且穿透深度大。
[0019]具體的，所述利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法是:將上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒進(jìn)行生物修飾，根據(jù)所需探測(cè)的問(wèn)題細(xì)胞類型，在其表面修飾相應(yīng)的生物抗體分子；然后將含有不同種類的待測(cè)細(xì)胞樣品和修飾好的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針?lè)謩e從微流通道的兩個(gè)入口流入，在微流通道中混合，使待測(cè)細(xì)胞樣品中的問(wèn)題細(xì)胞與該納米探針結(jié)
口 ο
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0021]1、本發(fā)明將具有特殊光學(xué)特性的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)目標(biāo)中問(wèn)題細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用近紅外波段激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的方法通過(guò)激光掃描光學(xué)探測(cè)手段進(jìn)行問(wèn)題細(xì)胞的探測(cè)，降低了細(xì)胞毒性，抗光漂白，并且成像信噪比更高。這一基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的單光束技術(shù)為制作出低成本、高效率、快速實(shí)時(shí)的問(wèn)題細(xì)胞檢測(cè)、篩選及計(jì)數(shù)分析系統(tǒng)提供了可能。本發(fā)明降低了成本同時(shí)提高了所測(cè)信號(hào)的信噪比，有著極大的技術(shù)發(fā)展應(yīng)用空間和廣闊的市場(chǎng)前景，適用于基于微流控芯片的問(wèn)題細(xì)胞診斷和操縱等結(jié)構(gòu)微型化器件。
[0022]2、本發(fā)明采用單個(gè)半導(dǎo)體激光器同時(shí)作為激發(fā)光源和光鑷操作光束，為單光束系統(tǒng)，大大簡(jiǎn)化了系統(tǒng)的搭建，因此光路簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、系統(tǒng)搭建簡(jiǎn)單、易穩(wěn)定控制。
[0023]3、由于細(xì)胞中的內(nèi)源熒光物質(zhì)和常用的有機(jī)熒光染料不能被穩(wěn)態(tài)近紅外激光器激發(fā)，本發(fā)明消除了細(xì)胞自發(fā)熒光和有機(jī)熒光染料發(fā)光等背景熒光的干擾，是一種高靈敏度的成像技術(shù)。
[0024]4、由于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針在近紅外激光激發(fā)下幾乎不會(huì)被光漂白，對(duì)生物樣品的損傷很小，因此本發(fā)明能對(duì)問(wèn)題細(xì)胞進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)和光控。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是本實(shí)施例1中上轉(zhuǎn)換納米顆粒合成進(jìn)行修飾的示意圖。
[0026]圖2是本實(shí)施例1的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖3是本實(shí)施例1中轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針與癌細(xì)胞結(jié)合示意圖。
[0028]圖4是本實(shí)施例2的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]其中，I一上轉(zhuǎn)換納米顆粒探針；2—未經(jīng)過(guò)任何標(biāo)記修飾的待測(cè)細(xì)胞中的正常細(xì)胞；3—未經(jīng)過(guò)任何標(biāo)記修飾的待測(cè)細(xì)胞中的癌細(xì)胞；4一標(biāo)記有上轉(zhuǎn)換納米顆粒探針的癌細(xì)胞；5—細(xì)胞緩沖液；6—微流通道；7—半導(dǎo)體激光器；8—擴(kuò)束透鏡；9一光束整形透鏡；
10—照明針孔；11—第一二色鏡；12—物鏡；13—癌細(xì)胞排出通道；14一第二二色鏡；15—聚焦透鏡；16—探測(cè)針孔；17—光柵；18—光電探測(cè)器；19一電機(jī)；20—二色鏡；21—濾光片；22 —電機(jī)控制裝置；23—微流芯片。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本實(shí)施例中問(wèn)題細(xì)胞為子宮頸癌HeLa細(xì)胞，在進(jìn)行篩選前需要準(zhǔn)備上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針，轉(zhuǎn)換過(guò)程如圖1所示，其中，A為包裹有油酸的上轉(zhuǎn)換納米顆粒核結(jié)構(gòu)出為5_巰基琥珀酸(MSA);(:為5-巰基琥珀酸(MSA)包裹后的上轉(zhuǎn)換納米顆粒；D為聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH) ；E為PAH-MSA-UCNPs ；F為CAE8抗體；G為完成抗體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針。首先，合成小于10納米大小的上轉(zhuǎn)換納米核殼顆粒結(jié)構(gòu)。具體是使用三氯化釔(YCl3)，三氯化鐿(YbCl3),和三氯化鉺(ErCl3)粉末，油酸(OA)，油胺(OM)，和1-十八烯(ODE)攪拌溶液并置于真空加熱至110°C維持I小時(shí)。然后加入油酸鈉(NaOL)粉末和無(wú)水NH4F并在310°C下通N2攪拌0.5—1小時(shí)，然后移開熱源在空氣流中快速冷卻降溫到75°C，在反應(yīng)溶液中加入無(wú)水乙醇來(lái)沉淀氟釔化鈉20%鐿摻雜，2%鉺摻雜(NaYF4:20%Yb，29ffir)納米顆粒并轉(zhuǎn)移到離心管中將它冷卻到室溫，之后在3000G下離心2-3分鐘。如此至少洗兩次。然后形成包裹殼層結(jié)構(gòu)，具體是=YCl3在油酸和ODE中在110°C下加熱I小時(shí)，將溶液冷卻至60°C，然后加入之前儲(chǔ)存在己烷中的上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶液。減壓排出己烷，再加入NH4F和油酸鈉后溶液冷卻到室溫。然后將溶液加熱到280°C保持30分鐘，迅速冷卻，當(dāng)溫度低于75°C時(shí)加入10毫升的乙醇，如上步驟洗滌。得到納米顆粒A，即包裹有油酸的上轉(zhuǎn)換納米顆粒核結(jié)構(gòu)。然后進(jìn)行表面抗體蛋白修飾，具體是:取200微升的NaYF4:Yb3+/Er3+氯仿中的溶液，及120毫克的5-巰基琥珀酸(MSA)(圖1中標(biāo)號(hào)為B)加入2毫升的去離子水和SmL的氯仿混合?；旌衔锸覝叵聰嚢桁o置一夜，然后用無(wú)水乙醇和水洗過(guò)兩次后得到水溶性的MSA-UCNPs(圖1中標(biāo)號(hào)為C)。再取200微升的聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)(圖1中標(biāo)號(hào)為D)的溶液和10毫升的氯化鈉(NaCl)溶液加入到之前的MSA-UCNP水溶液中。然后混合溶液漩渦3分鐘，3小時(shí)離心兩次得納米顆粒(圖1中標(biāo)號(hào)為E)。將其再次溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，取10微升與待測(cè)細(xì)胞中癌細(xì)胞對(duì)應(yīng)的抗體(圖1中標(biāo)號(hào)為F)。溶液(0.5暈克/暈升)加入到之前合成的PAH-MSA-UCNPs溶液中，室溫下靜置I小時(shí)，然后離心除去沒(méi)有結(jié)合的抗體分子即得到此系統(tǒng)中用于相應(yīng)癌細(xì)胞探測(cè)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針G。
[0033]如圖2所示，本實(shí)施例所述一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括探測(cè)裝置、光鑷裝置、微流芯片、電動(dòng)載物臺(tái)、物鏡、電機(jī)控制裝置和電機(jī)，微流芯片放置于電動(dòng)載物臺(tái)上，微流芯片上設(shè)有微流通道。微流通道用于將上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針和待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行混合，得到具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞。物鏡12設(shè)置在微流芯片的上方，光鑷裝置將近紅外波段激光通過(guò)物鏡12照射在微流通道內(nèi)的細(xì)胞上，利用近紅外波段激光作為光鑷的光壓勢(shì)阱控制住當(dāng)前細(xì)胞。探測(cè)裝置通過(guò)物鏡采集當(dāng)前細(xì)胞所反射光信號(hào)，如果判斷此光信號(hào)是上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，則探測(cè)裝置輸出信號(hào)到電機(jī)控制裝置，電機(jī)控制裝置控制電機(jī)旋轉(zhuǎn)，電機(jī)轉(zhuǎn)軸與微流芯片連接，隨著電機(jī)旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)微流芯片在電動(dòng)載物臺(tái)上平移，進(jìn)而將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)癌細(xì)胞排出通道排出，如果判斷是激發(fā)光信號(hào)，則將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)正常細(xì)胞排出通道排出。
[0034]如圖2所示，所述微流芯片以標(biāo)準(zhǔn)載玻片玻璃為基底，微流通道6刻蝕在此基底上，大小為100微米寬、50微米深、50厘米長(zhǎng)，微流通道采用玻璃鍵合的方法密封。微流通道6包括依次連接的標(biāo)記段、緩沖段、分流段，有5處開孔，分別是待測(cè)細(xì)胞輸入口、上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針輸入口、細(xì)胞緩沖液輸入口、癌細(xì)胞排出口以及正常細(xì)胞的排出口。這些出入口的開閉均通過(guò)壓電閥實(shí)現(xiàn)。具體工作過(guò)程是:未經(jīng)過(guò)任何標(biāo)記修飾的待測(cè)細(xì)胞(如圖中2和3，這里假設(shè)2為正常細(xì)胞，3為癌細(xì)胞)及已經(jīng)合成的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針I(yè)分別從微流通道兩個(gè)入口加入微流通道中的標(biāo)記段，兩個(gè)入口通道大小為50微米寬、50微米深、5厘米長(zhǎng)，標(biāo)記段處的微流通道為約30厘米的蛇形彎曲通道，待其充分反應(yīng)得到標(biāo)記有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的癌細(xì)胞4。然后通過(guò)緩沖段開始端的入口通道(50微米寬、50微米深、5厘米長(zhǎng))在微流通道中加入細(xì)胞緩沖液5，緩沖段中的起始段為一使細(xì)胞單個(gè)通過(guò)的窄通道(30微米寬、50微米深、約2厘米長(zhǎng))，通過(guò)這一窄通道以及壓電閥的作用，使細(xì)胞逐個(gè)在微流通道6中緩慢流動(dòng)。分流段分為兩段，一段是具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的癌細(xì)胞排出通道13 (50微米寬、50微米深、5厘米長(zhǎng))，該通道在物鏡12下方，通道13的軸線與物鏡12的光軸平行，一段是正常細(xì)胞的排出通道，分流段和緩沖段相交處的上方設(shè)有物鏡。
[0035]本實(shí)施例中物鏡、光鑷裝置、探測(cè)裝置共同組成了一顯微鏡光學(xué)探測(cè)裝置。其中光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器7、擴(kuò)束透鏡8、光束整形透鏡9、照明針孔10和第一二色鏡11，打開半導(dǎo)體激光器7，使其產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡8、光束整形透鏡9后成為一束較大的平行光束，然后再通過(guò)照明針孔10，第一二色鏡11與激光光束成45度角放置，使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡12會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上。在第一二色鏡11上方與激光束垂直的光軸方向上，同軸的放置有第二二色鏡14，沿光束光軸方向有聚焦透鏡15、探測(cè)針孔16、光柵17和與計(jì)算機(jī)連接的光電探測(cè)器18。上述部件共同構(gòu)成探測(cè)裝置。該裝置通過(guò)光柵分光的方式選擇一定波長(zhǎng)范圍的信號(hào)由光電探測(cè)器18接收顯示在計(jì)算機(jī)上，進(jìn)行圖像的存儲(chǔ)和下一步控制，例如通過(guò)控制電機(jī)控制裝置和電機(jī)19實(shí)現(xiàn)微流芯片在電動(dòng)載物臺(tái)上的平移。
[0036]本實(shí)施例一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法是:利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，得到具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的癌細(xì)胞以及沒(méi)有標(biāo)記的正常細(xì)胞，然后對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行激光掃描，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的癌細(xì)胞在近紅外波段(波長(zhǎng)為910-1000納米)激光誘導(dǎo)下發(fā)射上轉(zhuǎn)換光，探測(cè)器一旦檢測(cè)到此上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，就通過(guò)光鑷技術(shù)將癌細(xì)胞篩選出來(lái)。
[0037]如圖3所示，為上轉(zhuǎn)換納米顆粒與癌細(xì)胞結(jié)合的示意圖，被修飾了抗體的上轉(zhuǎn)換納米顆粒與癌細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合，其中P為向微流通道I中加入的上轉(zhuǎn)換納米探針和待測(cè)細(xì)胞，X為待測(cè)癌細(xì)胞上的抗原，Y為癌細(xì)胞，Z為具有特定抗體修飾的上轉(zhuǎn)換納米探針。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針與癌細(xì)胞結(jié)合的過(guò)程如下:將待測(cè)細(xì)胞樣品和修飾好的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針?lè)謩e從微流通道的兩個(gè)入口流入，在微流通道中混合，使待測(cè)細(xì)胞樣品中的問(wèn)題細(xì)胞與該納米探針結(jié)合。
[0038]如圖2所示本實(shí)例的工作過(guò)程是:將未經(jīng)過(guò)任何標(biāo)記修飾的待測(cè)細(xì)胞(2和3)及已經(jīng)合成的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針I(yè)分別從微流通道兩個(gè)入口加入微流通道6中，并使其緩慢進(jìn)入微流通道。由于合成的上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面修飾有子宮頸癌HeLa細(xì)胞的抗體蛋白，這些經(jīng)過(guò)特定抗體蛋白修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針可以連接并附著在子宮頸癌HeLa細(xì)胞表面，先使溶液充滿微流通道，在微流通道中反應(yīng)一段時(shí)間。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余的未連接的上轉(zhuǎn)換納米探針。之后將配置好的細(xì)胞緩沖液5(磷酸鹽緩沖液PBS)從緩沖液池入口加入與待測(cè)細(xì)胞混合，清洗待測(cè)細(xì)胞，減小背景熒光，開啟微通道連接的壓電閥控制其流速，并利用緩沖段起始端的一小段窄口通道，保持待測(cè)細(xì)胞一個(gè)一個(gè)的排列緩慢通過(guò)主通道。將完成反應(yīng)的微流芯片置于電動(dòng)載物臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光光源7(中心波長(zhǎng)975納米)，功率約5微瓦，發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡8和光束整形透鏡9，變成一束直徑較大的平行光束，通過(guò)照明針孔10后，經(jīng)過(guò)第一二色鏡11 (反射波長(zhǎng)大于850納米的光，透過(guò)波長(zhǎng)小于850納米的光)反射使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)高倍物鏡12會(huì)聚在焦點(diǎn)上，使其聚焦在微流通道癌細(xì)胞排出口中心位置，在實(shí)際光路中，除了要保證物鏡后瞳被光束充滿，還需要考慮下列情況:阱位與焦點(diǎn)位置并不一致。為了保證被捕獲的微粒能夠清晰成像到觀測(cè)平面上，激光束經(jīng)過(guò)物鏡后的會(huì)聚點(diǎn)應(yīng)適當(dāng)偏離物平面，而使阱位落在物平面上。然后對(duì)待測(cè)細(xì)胞用光鑷控制，同時(shí)該975納米的激發(fā)光可以激發(fā)標(biāo)記在子宮頸癌HeLa細(xì)胞上的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光，該熒光經(jīng)過(guò)物鏡12收集依次通過(guò)第一二色鏡
11和第二二色鏡14 (這塊二色鏡可以和11正好相反，<850nm反射，>850透射(過(guò)濾激發(fā)光源))后偏折45度，然后依次通過(guò)聚焦透鏡15、探測(cè)針孔16和光柵17，最后由連接有計(jì)算機(jī)的探測(cè)器18接收，計(jì)算機(jī)記錄圖像存儲(chǔ)并且計(jì)數(shù)一次，若發(fā)現(xiàn)熒光光譜圖像為預(yù)期上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜圖像，則計(jì)算機(jī)通過(guò)控制電機(jī)控制裝置驅(qū)動(dòng)電機(jī)19運(yùn)作，使微流芯片在電動(dòng)載物臺(tái)上做微移動(dòng)，此時(shí)可通過(guò)該移動(dòng)實(shí)現(xiàn)將光控下的癌細(xì)胞移離主通道進(jìn)入癌細(xì)胞排出通道13，然后光束釋放該細(xì)胞，使其流入癌細(xì)胞池，再次移動(dòng)微流芯片使其復(fù)位，并且計(jì)數(shù)一次，使待測(cè)細(xì)胞再次流過(guò)近紅外激發(fā)光的物鏡焦點(diǎn)處，重復(fù)進(jìn)行下一次檢測(cè)。
[0039]實(shí)施例2
[0040]本實(shí)施例除下述特征外其他結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1:如圖4所示，本實(shí)施例中光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器7、擴(kuò)束透鏡8、光束整形透鏡9和二色鏡20，其中二色鏡20特性為近紅外反射、可見光透過(guò)，所述半導(dǎo)體激光器7產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次通過(guò)擴(kuò)束透鏡8、光束整形透鏡9和二色鏡20，二色鏡20與該激光束成45度角放置，在垂直于該激光束且通過(guò)二色鏡20光軸的方向上，物鏡12同軸放置在二色鏡20下方，二色鏡20使激光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡12會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上；所述探測(cè)裝置包括濾光片21和探測(cè)器18，在垂直于激光束且通過(guò)二色鏡20光軸的方向上，同軸放置在二色鏡20上方。
[0041]其光學(xué)探測(cè)裝置工作過(guò)程是:半導(dǎo)體激光器7 (中心波長(zhǎng)> 910納米)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡8和光束整形透鏡9，變成一束較大的平行光束，二色鏡20 (近紅外反射，可見光透過(guò))使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡12會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，待測(cè)細(xì)胞在微流通道6中逐一緩慢流過(guò)激發(fā)光焦點(diǎn)處，該激發(fā)光利用其作為光鑷的光壓勢(shì)阱控制住該癌細(xì)胞，微流通道中具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的癌細(xì)胞在該910納米至1000納米激光的激發(fā)下發(fā)射上轉(zhuǎn)換光，其中一部分上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)通過(guò)物鏡12收集轉(zhuǎn)換成平行光束，通過(guò)該二色鏡20 (近紅外反射，可見光透過(guò))，再通過(guò)濾光片21，即可獲得一定波長(zhǎng)范圍的光學(xué)信號(hào)，然后能夠被光電探測(cè)器18接收。光電探測(cè)器18收到信號(hào)，經(jīng)分析后若為預(yù)判的上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，光電探測(cè)器18會(huì)立刻發(fā)出信號(hào)給電機(jī)控制裝置，電機(jī)控制裝置驅(qū)動(dòng)電機(jī)運(yùn)作，使微流芯片23發(fā)生側(cè)向微移，癌細(xì)胞在近紅外激光光鑷控制下通過(guò)微流芯片23的移動(dòng)進(jìn)入癌細(xì)胞排出通道，激光釋放癌細(xì)胞，并且計(jì)數(shù)一次。若分析為激發(fā)光信號(hào)，則細(xì)胞沿原微流通道繼續(xù)前進(jìn)，在前方被收集。
[0042]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，包括探測(cè)裝置、光鑷裝置、微流芯片、電動(dòng)載物臺(tái)、物鏡，微流芯片放置于電動(dòng)載物臺(tái)上，微流芯片上設(shè)有微流通道，微流通道內(nèi)流動(dòng)的細(xì)胞包括具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞以及正常細(xì)胞；物鏡設(shè)置在微流芯片的上方，光鑷裝置將近紅外波段激光通過(guò)物鏡照射在微流通道內(nèi)的細(xì)胞上，利用近紅外波段激光作為光鑷的光壓勢(shì)阱控制住當(dāng)前細(xì)胞；探測(cè)裝置通過(guò)物鏡采集當(dāng)前細(xì)胞所反射光信號(hào)，如果判斷此光信號(hào)是上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，則將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)問(wèn)題細(xì)胞排出通道排出，如果判斷是激發(fā)光信號(hào)，則將當(dāng)前細(xì)胞通過(guò)正常細(xì)胞排出通道排出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述微流控系統(tǒng)還包括電機(jī)控制裝置和電機(jī)，所述微流芯片與電機(jī)連接，探測(cè)裝置與電機(jī)控制裝置相連，根據(jù)當(dāng)前細(xì)胞所反射光信號(hào)的不同，探測(cè)裝置通過(guò)電機(jī)控制裝置控制微流芯片在電動(dòng)載物臺(tái)上平移。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述微流芯片以標(biāo)準(zhǔn)載玻片玻璃為基底，所述微流通道刻蝕在此基底上，微流通道包括標(biāo)記段、緩沖段、分流段，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針與待檢測(cè)細(xì)胞分別通過(guò)入口進(jìn)入標(biāo)記段內(nèi)進(jìn)行混合，在問(wèn)題細(xì)胞上進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記，然后進(jìn)入緩沖段，在緩沖段開始端還設(shè)有一用于細(xì)胞緩沖液流入的入口，在細(xì)胞緩沖液作用下，細(xì)胞逐個(gè)在微流通道中緩慢移動(dòng)直到分流段；分流段分為兩段，一段是具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞排出通道，一段是正常細(xì)胞的排出通道，分流段和緩沖段相交處的上方設(shè)有物鏡。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記段上的微流通道為蛇形彎曲通道； 所述緩沖段中的起始段為一使細(xì)胞單個(gè)通過(guò)的窄通道； 所述分流段中，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞排出通道在物鏡下方，其通道的軸線與物鏡的光軸平行，正常細(xì)胞的排出通道與微流通道中的緩沖段末端同軸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述微流通道上各出入口的開閉均通過(guò)壓電閥實(shí)現(xiàn)； 所述微流通道采用玻璃鍵合的方法密封。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器、擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和二色鏡，其中二色鏡特性為近紅外反射、可見光透過(guò)，所述半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次通過(guò)擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和二色鏡，二色鏡與該激光束成45度角放置，在垂直于該激光束且通過(guò)二色鏡光軸的方向上，物鏡同軸放置在二色鏡下方，二色鏡使激光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上；所述探測(cè)裝置包括濾光片和探測(cè)器，在垂直于激光束且通過(guò)二色鏡光軸的方向上，同軸放置在二色鏡上方。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控系統(tǒng)，其特征在于，所述光鑷裝置包括半導(dǎo)體激光器、擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和第一二色鏡，其中第一二色鏡特性為近紅外反射、可見光透過(guò)，所述半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束依次通過(guò)擴(kuò)束透鏡、光束整形透鏡和第一二色鏡，第一二色鏡與該激光束成45度角放置，在垂直于該激光束且通過(guò)第一二色鏡光軸的方向上，物鏡同軸放置在第一二色鏡下方，第一二色鏡使激光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上；所述探測(cè)裝置包括第二二色鏡，第二二色鏡同軸放置于第一二色鏡的上方，沿光束光軸方向依次設(shè)有聚焦透鏡、探測(cè)針孔、光柵和光電探測(cè)器。
8.一種單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法，其特征在于，利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，得到具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞以及沒(méi)有標(biāo)記的正常細(xì)胞，然后對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行激光掃描，具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針標(biāo)記的問(wèn)題細(xì)胞在近紅外波段激光誘導(dǎo)下發(fā)射上轉(zhuǎn)換光，探測(cè)器一旦檢測(cè)到此上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，就通過(guò)光鑷技術(shù)將此細(xì)胞篩選出來(lái)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法，其特征在于，所述近紅外波段激光的波長(zhǎng)為910-1000納米。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的單光束生物細(xì)胞檢測(cè)及篩選的微流控方法，其特征在于，所述利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法是:將上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒進(jìn)行生物修飾，根據(jù)所需探測(cè)的問(wèn)題細(xì) 胞類型，在其表面修飾相應(yīng)的生物抗體分子；然后將含有不同種類的待測(cè)細(xì)胞樣品和修飾好的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針?lè)謩e從微流通道的兩個(gè)入口流入，在微流通道中混合，使待測(cè)細(xì)胞樣品中的問(wèn)題細(xì)胞與該納米探針結(jié)合。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103439242SQ201310404958
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】詹求強(qiáng), 劉靜, 趙宇翔 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)