一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，屬于從經(jīng)血中分離干細(xì)胞的方法領(lǐng)域。為了解決傳統(tǒng)方法中采用淋巴分離液法，其離心時(shí)間長，對(duì)細(xì)胞的損傷較大，細(xì)胞得率低等問題。本發(fā)明采用來源廣泛的經(jīng)血為材料，采集過程中采用特殊的保存液進(jìn)行保存，然后通過淋巴細(xì)胞分離管的密度梯度離心法進(jìn)行初步分離，對(duì)分離的離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，然后通過干細(xì)胞貼壁生長的特性進(jìn)行再次分離，將干細(xì)胞分離和擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，在分離過程中最大限度地維持干細(xì)胞活性，得到的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞純度高、數(shù)量大、應(yīng)用價(jià)值高。本發(fā)明操作簡單，成本低。
【專利說明】一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從經(jīng)血中分離干細(xì)胞的方法，特別涉及一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在發(fā)育生物學(xué)研究和臨床治療，如組織和器官修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，MSCs最先在骨髓中確認(rèn)存在，隨后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪組織等處均發(fā)現(xiàn)有MSCs的存在。MSCs屬于多能干細(xì)胞，在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下能分化為骨、脂肪、軟骨、肌肉和肝細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞。目前成人骨髓是MSCs臨床應(yīng)用的最主要來源，但也存在一些缺陷，如成人骨髓中的MSCs的量非常少(約
0.001% 0.01% )0此外，在衰老和疾病狀況下，骨髓MSCs的數(shù)量和分化潛能下降，且采集骨髓為創(chuàng)傷性過程。所以尋找其它的可替代MSCs來源十分重要。
[0003]經(jīng)血是女性血液和一些脫落的子宮內(nèi)膜、子宮頸粘液及陰道分泌物的混雜液體。近年來，美國的研究小組從健康女性的月經(jīng)血中得到重復(fù)分離的干細(xì)胞；2008年，日本的研究小組也利用女性月經(jīng)血成功分離培養(yǎng)出具有多重分化功能的干細(xì)胞，該干細(xì)胞可用于修復(fù)受損的心肌組織。
[0004]這種干細(xì)胞稱為經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(menstrualblood-derivedmesenchymal cells, MMCs),有望用來治療損傷和衰老的組織。MMSCs不僅來源廣泛，且對(duì)其研究不會(huì)涉及倫理道德和法律問題。此外，MMSCs還具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是干細(xì)胞研究的一種理想種子細(xì)胞，因此成為尋找人類間充質(zhì)干細(xì)胞新來源及提高臨床應(yīng)用效果的研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，包括以下內(nèi)容:
[0007]a.收集經(jīng)血:將經(jīng)血轉(zhuǎn)移到I~2倍經(jīng)血體積的磷酸鹽緩沖液中，得到混合物，并將混合物于4°C下保存；
[0008]b.將步驟a中得到的混合物在48h內(nèi)，加入等體積的PBS緩沖液充分混勻，通過200目篩網(wǎng)過濾得濾液，將濾液用淋巴細(xì)胞分離管于2670rpm轉(zhuǎn)速下離心17min，得到4層分離液，除去最上層分離液，提取中間白膜層物質(zhì)，得到混合物A ；
[0009]c.將步驟b中得到的混合物A加入PBS緩沖液中洗滌2~3次，然后離心，取沉淀細(xì)胞B ; [0010]d.將步驟c中得到的沉淀細(xì)胞B接種到培養(yǎng)基中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0011]e.收集步驟d中所述的培養(yǎng)的細(xì)胞，即為所述的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞。[0012]優(yōu)選地，步驟a中所述的磷酸鹽緩沖液的pH值為7.2，所述的磷酸鹽緩沖液包括質(zhì)量濃度為5ug/ml的EDTA、50ug/ml的枸櫞酸鈉、50~100mg/ml的海藻糖、0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~0.lmg/ml鏈霉素、0.05~0.lmg/ml氟康唑。
[0013]優(yōu)選地，步驟c中所述的PBS緩沖液的配方為:NaC1137mmol/L，KC12.7mmol/L,Na2HPO41OmmoI/L, KH2P042mmol/L ;所述 PBS 緩沖液的 pH 值為 7.2。
[0014]優(yōu)選地，步驟d中所述的培養(yǎng)基包括質(zhì)量濃度為1.34% DMEM粉末和0.22%NaHCO30
[0015]優(yōu)選地，步驟d中所述的培養(yǎng)包括以下內(nèi)容:每隔3~4天則去掉未貼壁的細(xì)胞，并更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)的總時(shí)間為7~10天。
[0016]優(yōu)選地，步驟d中所述的培養(yǎng)基，細(xì)胞首次傳代前的培養(yǎng)基均含0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~0.lmg/ml鏈霉素、0.05~0.lmg/ml氟康唑,首次傳代后的細(xì)胞所用培養(yǎng)基則不添加抗生素。
[0017]本發(fā)明的有益效果如下:
[0018]1.本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，采用來源廣泛的經(jīng)血為材料，通過采用淋巴分尚管法進(jìn)行初步分尚，利用干細(xì)胞貼壁生長的特性進(jìn)行再次分尚，并且將干細(xì)胞分離和擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，可以得到純度高、數(shù)量大的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞。傳統(tǒng)用于經(jīng)血干細(xì)胞分離多采用淋巴分離液法，其離心時(shí)間長，對(duì)細(xì)胞的損傷較大，細(xì)胞得率低。
[0019]2.本發(fā)明提供的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，在收集經(jīng)血時(shí)，采用特殊的保存液進(jìn)行初步保存。經(jīng)血易污染，本發(fā)明在磷酸鹽緩沖液中加入的青霉素和鏈霉素，具有很好的抗菌作用，避免經(jīng)血在從采取到分離的時(shí)間內(nèi)遭受外界污染；本發(fā)明在緩沖液中還加入呋康痤,抑制經(jīng)血自身真菌感染,提高間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率,為得到數(shù)量大的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞提供保障；經(jīng)血中含有纖溶酶，能使經(jīng)血不凝，但是采集后的經(jīng)血需要保存在4°C，纖溶酶在4°C下酶活低，不能達(dá)到為經(jīng)血抗凝的效果，所以本發(fā)明提供的緩沖液中加入枸櫞酸鈉和EDTA，不僅可以改善經(jīng)血細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，還能對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，維持細(xì)胞活性，降低細(xì)胞離體后的死亡率；本發(fā)明提供的緩沖液中加入海藻糖，在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，提高細(xì)胞活性，進(jìn)一步提高經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值。
[0020]3.本發(fā)明提供的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，采用淋巴分離管法進(jìn)行初步分離，結(jié)合本發(fā)明提供的經(jīng)血保存液(即收集經(jīng)血時(shí)的磷酸鹽緩沖液)，對(duì)分離的離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，在分 離過程中最大限度地維持干細(xì)胞活性，提高經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值，并且對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的高得率、高純度提供保障。
[0021]4.本發(fā)明提供的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，對(duì)經(jīng)血的采集和分離的各步驟進(jìn)行優(yōu)化處理，操作簡單，成本低，可以得到純度高、數(shù)量大的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明中培養(yǎng)2-3天的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞圖；
[0023]圖2為本發(fā)明中培養(yǎng)6-7天的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞圖；
[0024]圖3為傳統(tǒng)方法中培養(yǎng)2-3天的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞圖；
[0025]圖4為傳統(tǒng)方法中培養(yǎng)6-7天的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]實(shí)施例1
[0028]處理十份不同年齡來源的經(jīng)血，均勻地分成兩份，分布標(biāo)記為樣品A和樣品B，將樣品A采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行分離，具體內(nèi)容見下:
[0029]一種新型經(jīng)血 來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，包括以下內(nèi)容:
[0030]a.收集經(jīng)血:將經(jīng)血轉(zhuǎn)移到I~2倍經(jīng)血體積的磷酸鹽緩沖液中，得到混合物，并將混合物于4°C下保存；
[0031]所述的磷酸鹽緩沖液的pH值為7.2，所述的磷酸鹽緩沖液包括質(zhì)量濃度為5ug/ml的EDTA、50ug/ml的枸櫞酸鈉、50~100mg/ml的海藻糖、0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~
0.lmg/ml 鏈霉素、0.05 ~0.lmg/ml 氟康唑。
[0032]b.將步驟a中得到的混合物在48h內(nèi)，轉(zhuǎn)移到等體積的PBS緩沖液中充分混勻后，通過200目篩網(wǎng)過濾得濾液，將濾液用淋巴細(xì)胞分離管于2670rpm轉(zhuǎn)速下離心17min，得到4層分離液，小心除去最上層分離液，提取中間白膜層物質(zhì)，得到混合物B;
[0033]c.將步驟b中得到的混合物A加入PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，然后離心，取沉淀細(xì)B ；
[0034]所述的PBS 緩沖液的配方為:NaC1137mmol/L，KC12.7mmol/L, Na2HP0410mmol/L,KH2P042mmol/L ;所述PBS緩沖液的pH值為7.2。
[0035]d.將步驟c中得到的沉淀細(xì)胞B接種到培養(yǎng)基中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)5% C02的飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0036]所述的培養(yǎng)基包括質(zhì)量濃度為1.34% DMEM粉末和0.22% NaHC03。
[0037]所述的培養(yǎng)基，細(xì)胞首次傳代前的培養(yǎng)基均含0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~
0.lmg/ml鏈霉素、0.05~0.lmg/ml氟康唑,首次傳代后的細(xì)胞所用培養(yǎng)基則不添加抗生素。
[0038]所述的培養(yǎng)包括以下內(nèi)容:每隔3~4天則去掉未貼壁的細(xì)胞，并更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)的總時(shí)間為7~10天。
[0039]e.收集步驟d中所述的培養(yǎng)的細(xì)胞，即為所述的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0040]細(xì)胞基本生物學(xué)特征的鑒定:
[0041]將上述步驟d中的沉淀細(xì)胞B培養(yǎng)2~3天左右，就可培養(yǎng)容器壁上有少量細(xì)胞生長，呈短梭形，形態(tài)飽滿(如圖1所示)；經(jīng)過6~7天左右的培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下可見有較多量的細(xì)胞生長(如圖2所示)；經(jīng)過7-10天培養(yǎng)、收集的干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下可見分離得到的干細(xì)胞為典型的纖維狀細(xì)胞。
[0042]經(jīng)血來源的間充質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞特異性標(biāo)志物分析:
[0043]選取實(shí)施例中得到的經(jīng)血來源的充質(zhì)干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞懸液于離心管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X105.μ L — I ;取6只試管,每管分別加15μ L鼠抗人單克隆抗體 CD29 - PE、CD34 — PE、CD44 — FITC、CD105 — FITC，以鼠抗人 IgG2a —FITC.1gG 1- PE作為陰性對(duì)照，再分別加入150 μ L細(xì)胞懸液混勻，室溫避光放置lOmin，之后再用PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cellquest軟件獲取與分析，見表1。
[0044]表1.本發(fā)明中干細(xì)胞特異性標(biāo)志物分析結(jié)果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，包括以下內(nèi)容: a.收集經(jīng)血:將經(jīng)血轉(zhuǎn)移到廣2倍經(jīng)血體積的磷酸鹽緩沖液中，得到經(jīng)血混合物，并將混合物于4°C下保存； b.將步驟a中得到的混合物在48h內(nèi)，加入等體積的PBS緩沖液充分混勻，通過200目篩網(wǎng)過濾得濾液，將濾液用淋巴細(xì)胞分離管于2670rpm轉(zhuǎn)速下離心17min，得到4層分離液，除去最上層分離液，提取中間白膜層物質(zhì)，得到混合物A ； c.將步驟b中得到的混合物A加入PBS緩沖液中洗滌2~3次，然后離心，取沉淀細(xì)胞B ； d.將步驟c中得到的沉淀細(xì)胞B接種到培養(yǎng)基中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)； e.收集步驟d中所述的培養(yǎng)的細(xì)胞，即為所述的經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟a中所述的磷酸鹽緩沖液的PH值為7.2，所述的磷酸鹽緩沖液包括質(zhì)量濃度為5ug/ml的EDTA、50ug/ml的枸櫞酸鈉、50~100mg/ml的海藻糖、0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~0.lmg/ml鏈霉素、0.05^0.lmg/ml 氟康唑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟c中所述的 PBS 緩沖液的配方為:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO42mmol/L ;所述PBS緩沖液的pH值為7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟d中所述的培養(yǎng)基包括質(zhì)量濃度為1.34% DMEM粉末和0.22%NaHC03。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟d中所述的培養(yǎng)包括以下內(nèi)容:每隔3~4天去掉未貼壁的細(xì)胞，并更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)的總時(shí)間為7~10天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟d中所述的培養(yǎng)基，細(xì)胞首次傳代前的培養(yǎng)基均含0.03、.05mg/ml青霉素、0.05、.lmg/ml鏈霉素、0.05、.lmg/ml氟康唑，首次傳代后的細(xì)胞所用培養(yǎng)基則不添加抗生素。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103966162SQ201410232819
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】高雪華, 海泉, 趙令卉, 李俊, 陳靜嫻, 趙峻 申請(qǐng)人:成都清科生物科技有限公司