一種提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其一種提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國急性心肌梗死的死亡率依然較高。目前對(duì)于心肌梗死的治療方法主要包括 溶栓、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)、激光心肌血運(yùn)重建術(shù)及心臟移 植手術(shù)等。前四項(xiàng)方法只能恢復(fù)梗死區(qū)早期再灌注、改善心肌供血，但不能修復(fù)或逆轉(zhuǎn)已壞 死的心肌，殘留心肌只能在有絲分裂信號(hào)的刺激下發(fā)生肥厚，進(jìn)而使心室發(fā)生重構(gòu)，最終導(dǎo) 致心力衰竭。心臟移植雖可替代受損心臟，但由于缺乏供體，移植后免疫排斥反應(yīng)及花費(fèi)較 高等原因難以得到廣泛應(yīng)用。因此如何增加梗死區(qū)有收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量或減少心肌 細(xì)胞的凋亡或死亡成為治療心肌梗死的主要障礙。雖然臨床實(shí)驗(yàn)表明，移植自體細(xì)胞可以 改善受損心肌的功能，但心肌細(xì)胞體外擴(kuò)增能力有限，難于獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞，且移植細(xì) 胞很難彌補(bǔ)和修復(fù)先天性或大面積缺損。
[0003] 干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存 在一類間充質(zhì)干細(xì)胞，因其克隆細(xì)胞株的增殖能力強(qiáng)，具有多向分化的潛能，在體外培養(yǎng)中 保持穩(wěn)定的生長增殖活性，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣的多向分化潛能，稱為脂肪干細(xì) 胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，除皮下脂肪含量十分豐富，提取方便外，脂肪干細(xì)胞可以分 泌具有生物活性的血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子等多種促進(jìn)血管新生的因子。
[0004] 體內(nèi)各組織器官氧氣含量變化范圍較大，脂肪組織中氧氣濃度一般小于3%，因此 脂肪干細(xì)胞處于低氧環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)研究表明，低氧環(huán)境下培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有較強(qiáng)的擴(kuò) 增，迀移及抗凋亡能力。Kim等發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS)，還原型輔酶II氧化酶，磷酸化的血小板衍 生生長因子-P受到抑制后，脂肪干細(xì)胞的擴(kuò)增與分化能力下降。然后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 中、低量ROS可提高脂肪干細(xì)胞擴(kuò)增，迀移以及再生能力。缺氧條件下，NADPH氧化酶活化 使脂肪干細(xì)胞產(chǎn)生R0S，定位于細(xì)胞核周圍的Nox4優(yōu)先表達(dá)，將其沉默后，脂肪干細(xì)胞的擴(kuò) 增與迀移能力降低。說明還原型輔酶II氧化酶4在脂肪干細(xì)胞擴(kuò)增迀移過程中發(fā)揮重要的 作用。低氧環(huán)境下培養(yǎng)的干細(xì)胞，其抗凋亡能力得到改善。Stubbs等應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、乳酸 脫氫酶實(shí)驗(yàn)及Caspase激活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧條件下（2%O2)培養(yǎng)ADSCs24小時(shí)后，和常氧條 件下培養(yǎng)相比，HP-hADSCs的VEGF分泌量增高，AKT的磷酸化程度也得到提高，進(jìn)一步研究 表明，應(yīng)用VEGF的中和抗體和磷酸肌醇3-激酶抑制劑LY294002可降低HP-hADSCs的生存 能力，說明低氧環(huán)境促使ADSCs分泌大量的VEGF，而該細(xì)胞因子與ADSCs的存活密切相關(guān)。 Valorani等的研究結(jié)果認(rèn)為低氧環(huán)境（2%O2)不會(huì)改變ADSCs的細(xì)胞表型，并且能夠提高 ADSCs擴(kuò)增與生存能力，促使其向脂肪細(xì)胞與骨細(xì)胞分化。不僅如此，ADSCs的擴(kuò)增與集落 形成與低氧環(huán)境密切相關(guān)（1 %O2)，其機(jī)制為低氧環(huán)境使得ADSCs的2581個(gè)基因受到調(diào)控， 進(jìn)而激活了涉及ADSCs增殖與凋亡的相關(guān)途徑。然而，對(duì)于在何種低氧環(huán)境下最適于ADSCs 旁分泌以及抗凋亡能力還需要進(jìn)一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的 方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的方法，3 %低氧環(huán)境能促進(jìn)脂肪源干細(xì) 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0008] 優(yōu)選的，上述提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的方法，具體方法如下：
[0009] (1)剪除脂肪組織中明顯的血管，用含有雙抗（2ml)的D-Hank' S(200ml)清洗脂 肪組織2-3次后剪碎，所述雙抗為lOOU/ml青霉素和lg/ml鏈霉素；
[0010] (2)將剪碎的脂肪組織通過150目尼龍篩網(wǎng)過濾，收集150目濾網(wǎng)上的脂肪組織， 用含有40U/50mlDNaseI和250yg/ml兩性霉素的D-Hank's液沖洗濾網(wǎng)上的脂肪組織， 去掉分離組織時(shí)因破壞細(xì)胞而釋放的DNA及其他胞內(nèi)容物；
[0011] (3)將脂肪組織加入D-Hank's液體，并以1500rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至離心 管中，加入含有0. 5%膠原酶I的等體積D-Hank's液，在37°C恒溫振蕩器上振蕩約75min 后，以 1800rpm離心 5min;
[0012] (4)棄上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整每個(gè)T75Cm2培養(yǎng)瓶中的 細(xì)胞數(shù)約為2x106,置入37°C，5%C0J?箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后，將未貼壁的細(xì)胞移除；
[0013] (5)7-10天后瓶中細(xì)胞增殖并鋪滿瓶底，待融合率達(dá)到80%，以0? 25 %胰蛋白 酶-0. 01 %EDTA消化，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)原代細(xì)胞，每3天換液1次，當(dāng)細(xì) 胞融合率達(dá)80%時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶消化、傳代得到脂肪源干細(xì)胞，所用脂肪源干細(xì)胞 (humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)為 3-5 代；
[0014](6)培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞24小時(shí)，使細(xì)胞融合達(dá)50 %，更換培養(yǎng)基，調(diào)整氧濃度，3 % 02、5%C02、92% N2，在上述氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明所述提高脂肪源干細(xì)胞抗凋亡及旁分泌的方法，通過大量研究發(fā)現(xiàn)3%氧 環(huán)境下最適于ADSCs旁分泌以及抗凋亡能力的提高，為臨床實(shí)踐中提高脂肪源干細(xì)胞生存 能力提供新的參考。
【附圖說明】
[0017] 圖1:從人脂肪組織中獲取的人脂肪干細(xì)胞。
[0018] 圖2:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞的特異性標(biāo)記。人脂肪干細(xì)胞免疫表型抗原 ⑶71、⑶73、⑶90、⑶105陽性表達(dá)率較高，⑶34、⑶45、⑶54、HLA-DR為陰性表達(dá)。
[0019] 圖3 :qRT_PCR及WesternBlot檢測(cè)脂肪源干細(xì)胞的抗凋亡及旁分泌情況。
[0020] 圖4 :ELISA檢測(cè)脂肪源干細(xì)胞的旁分泌情況。
[0021] 圖5 :流式細(xì)胞術(shù)分析脂肪源干細(xì)胞的抗凋亡情況。
[0022] 圖6 :SPCET觀察低氧環(huán)境培養(yǎng)的人脂肪源干細(xì)胞縮小心肌梗死面積。
[0023] 圖7 :免疫熒光分析低氧環(huán)境培養(yǎng)的人脂肪源干細(xì)胞的生存及成血管性。
[0024] 圖8:免疫熒光分析經(jīng)低氧環(huán)境培養(yǎng)的人脂肪源干細(xì)胞減少心肌細(xì)胞凋亡的情 況。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 在1%、3%、5%、10%、21%氧環(huán)境下，充分對(duì)比脂肪源干細(xì)胞的抗凋亡及旁分泌 能力。依據(jù)上述結(jié)果，選3%氧環(huán)境作為最適宜的培養(yǎng)條件。再將該條件下培養(yǎng)的脂肪源干 細(xì)胞用于治療心肌梗死，觀察療效。經(jīng)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，3%低氧環(huán)境能促進(jìn)脂肪源干細(xì) 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0026] 具體實(shí)施步驟包括：
[0027] LADSCs的獲取及免疫表型鑒定的實(shí)驗(yàn)方法
[0028] 患者知情并同意后，經(jīng)吸脂術(shù)獲取脂肪組織。剪除脂肪組織中明顯的血管，用含有 2ml雙抗（100U/ml青霉素，lg/ml鏈霉素）的200mlD-Hank's清洗脂肪組織2-3次后剪 碎。將剪碎的脂肪組織通過150目尼龍篩網(wǎng)過濾，收集150目濾網(wǎng)上的脂肪組織。用含有 DNaseI(40U/50ml)和250yg/ml兩性霉素的D-Hank's液沖洗濾網(wǎng)上的脂肪組織，去掉分 離組織時(shí)因破壞細(xì)胞而釋放的DNA及其他胞內(nèi)容物。將脂肪組織加入D-Hank's液體，并以 1500rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至離心管中。加入含有0. 5%膠原酶I的等體積D-Hank's 液，在37°C恒溫振蕩器上振蕩約75min后，以1800rpm離心5min。棄上清，加入含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整每個(gè)T75Cm2培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)約為2x106,置入37°C，5%CO2 孵箱中培養(yǎng)。約24小時(shí)后，將未貼壁的細(xì)胞移除。7-10天后瓶中細(xì)胞增殖并鋪滿瓶底，待 融合率達(dá)到80%，以0. 25%胰蛋白酶-0. 01 %EDTA消化，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng) 原代細(xì)胞，每3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶消化、傳代得到脂 肪源干細(xì)胞，所用脂肪源干細(xì)胞（humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)為3-5代。
[0029] 培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞24小時(shí)，使細(xì)胞融合達(dá)50%，更換培養(yǎng)基，按以下分組調(diào)整氧濃 度，A組：1% 02預(yù)處理組（1% 02,5% C02,94%N2)B組：3% 02預(yù)處理組（3% 02,5% C02， 92%隊(duì))(：組：5%02預(yù)處理組（5%02,5%0) 2,90%隊(duì))0組：10%02預(yù)處理組（10%02,5% C0 2,85%N2)E組，對(duì)照組：5% C02,95%空氣。在上述氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0030] 收集生長狀態(tài)良好的hADSCs經(jīng)胰酶消化后，用含0. 5%BSA的PBS沖洗。將細(xì)胞 懸液加在8個(gè)I. 5ml的EP管中，每管待測(cè)細(xì)胞數(shù)多105。在EP管中分別加入一抗⑶34， ⑶45,⑶54,⑶71，⑶73,⑶90,⑶105和HLA-DR，以及IgG-PE的同型對(duì)照抗體各4y1，充分 混勻，4°C避光孵育30min。離心2000rpmXlmin，棄上清，用Iml的PBS洗滌一次，棄上清。 4 %多聚甲醛400