一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)ADSCs細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖，同時(shí)具有來(lái)源豐富，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，取材比骨髓等容易，少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，衰亡率低等優(yōu)點(diǎn)。成體脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0003]1，2，3，4，6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖(1，2，3，4，6-Pentagalloylglucose，PGG)是從藥用植物余甘子中提取得到的化合物，CAS登錄號(hào)為14937-32-7。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200910040157.6公開(kāi)了 1，2，3，4，6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖的抗流感病毒方面的用途。
[0004]傳統(tǒng)的含動(dòng)物血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基給干細(xì)胞的生產(chǎn)與科研帶來(lái)多種不利因素。血清能為干細(xì)胞提供生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但其存在諸多缺點(diǎn):批間差異較大，來(lái)源不穩(wěn)定，需要大量驗(yàn)證工作，價(jià)格昂貴，成分不明確，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。
[0005]無(wú)血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿(mǎn)足干細(xì)胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來(lái)的諸多不利因素。因此，發(fā)展無(wú)血清培養(yǎng)基是干細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的重要條件。目前已有一些市售干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，但是現(xiàn)有市售無(wú)血清培養(yǎng)基存在細(xì)胞增殖不夠理想、價(jià)格昂貴等缺陷。
[0006]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201210197360.6公開(kāi)了一種無(wú)血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以高糖型DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了?；撬帷⑦€原型谷胱甘肽和銅藍(lán)蛋白等組分，但存在細(xì)胞貼壁性差、增殖緩慢、組分較復(fù)雜的缺陷。
[0007]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201310134502.9公開(kāi)了一種無(wú)血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以低糖型DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，雖然添加了堿性成纖維生長(zhǎng)因子、肝素和谷氨酰胺等組分，但脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖效果不夠理想。
[0008]因此，現(xiàn)有技術(shù)存在細(xì)胞貼壁性差，組分復(fù)雜，細(xì)胞增殖速率不夠理想等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞貼壁性差，組分復(fù)雜，細(xì)胞增殖速率不夠理想等問(wèn)題，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)篩選，得到一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的使用無(wú)需培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被，細(xì)胞貼壁性良好，細(xì)胞增殖速率高，保持良好的干細(xì)胞幼稚形態(tài)和干細(xì)胞特性，降低了成本。
[0010]本發(fā)明的目的將通過(guò)下面的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步體現(xiàn)和說(shuō)明。
[0011]本發(fā)明提供一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺l~6mM、谷胱甘肽l~20yg/mL、重組人胰島素l~10yg/mL、人血清白蛋白 0.01~lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.15-10 μ g/mL 1，2，3，4，6_0_ 五沒(méi)食子酰葡萄糖0.04-20 μ Mo
[0012]上述組分及其濃度是發(fā)明人經(jīng)大量試驗(yàn)篩選確定的。上述組分中，L-谷氨酰胺作為一種必需氨基酸，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中起到重要作用，可作為細(xì)胞新陳代謝的二次能量來(lái)源；谷胱甘肽具有抗氧化作用，有利于維持細(xì)胞生物功能；重組人胰島素可提高合成代謝能力，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)；人血清白蛋白能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可調(diào)節(jié)滲透壓，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷；轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中主要的鐵傳遞蛋白，為細(xì)胞內(nèi)化和細(xì)胞代謝提供所需的鐵；1，2，3，4，6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖(I, 2，3，4，6-Pentagalloylglucose，PGG)促進(jìn)了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的快速貼壁和快速增殖，并能夠維持脂肪干細(xì)胞的干細(xì)胞幼稚形態(tài)和干細(xì)胞特性。
[0013]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺2~6mM、谷胱甘肽10~20 μ g/mL、重組人胰島素5~10 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3~5 μ g/mL和1，2，3，4，6_0_五沒(méi)食子酰葡萄糖5~15 μ M。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺4mM、谷胱甘肽12μg/mL、重組人胰島素8μg/mL、人血清白蛋白lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3.5 μ g/mL和1，2, 3, 4, 6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖10 μΜ。
[0015]優(yōu)選地，所述DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基或低糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，還包括鏈霉素，鏈霉素的濃度為100 μ g/mL。
[0017]優(yōu)選地，所述谷胱甘肽為還原型谷胱甘肽。
[0018]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重組人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和1，2，3，4，6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖，混勻，過(guò)膜除菌即得。
[0019]此外，本發(fā)明還提供人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種新的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基促進(jìn)了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的快速貼壁，培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠保持較好的干細(xì)胞幼稚形態(tài)，具有更好的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞干性，降低了成本。本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單，制得的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基用于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞性能。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1含不同濃度PGG的培養(yǎng)基對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。
[0022]圖2人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的增殖曲線。
[0023]圖3培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2培養(yǎng)PlO代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖。
[0024]圖4人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的干性基因Nanog mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果圖。
[0025]圖5人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的干性基因Oct-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果圖。
[0026]圖6人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的干性基因Sox-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0028]本發(fā)明中的各組分均為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如1，2，3，4，6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，貨號(hào)BP0001。本發(fā)明中，培養(yǎng)基1:本發(fā)明實(shí)施例二提供的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基；培養(yǎng)基2:高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%體積百分比的胎牛血清。
[0029]實(shí)施例一含不同濃度PGG的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖的影響
發(fā)明人進(jìn)行大量試驗(yàn)篩選得到本發(fā)明提供的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基配方，并進(jìn)一步對(duì)PGG的濃度影響進(jìn)行了考察。
[0030]將PGG粉末用DMSO溶解成10mM母液，分別用高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將PGG母液稀釋成 20 μΜ、15 μΜ、10 μΜ、7.5 μΜ、5 μΜ、2.5 μ Μ、1.25 μΜ、0.63 μΜ