、0.31 μΜ、0.16 μ Μ、0.08 μ M 與 0.04 μ M 的 PGG 溶液。
[0031]將Pl代人脂肪間充質(zhì)干細胞以14個/mL的密度接種于96孔板中，分別用含不同濃度PGG的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基(與實施例二提供的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基的區(qū)別在于PGG濃度不同)培養(yǎng)，每孔100 μ L，以不加PGG的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基為對照組。置于37°C、5%C02的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24h、48h與72h之后，用MTT檢測方法，測定每孔的吸光值，將加入PGG處理組的吸光值與不加PGG的對照組的吸光值相對比，求算添加不同濃度PGG后的細胞存活率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，當PGG濃度達到1.25 μ M時，存活率呈現(xiàn)升高的趨勢，并隨著濃度的增加而升高；當PGG濃度達到10 μ M時，存活率達到峰值，并隨著濃度的增加而降低。
[0032]實施例二人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基
人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺4mM、還原型谷胱甘肽12 μ g/mL、重組人胰島素8 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3.5 μ g/mL和1，2，3，4，6-0-五沒食子酰葡萄糖10 μ M。
[0033]制備方法:向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重組人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和1，2，3,4, 6-0-五沒食子酰葡萄糖，混勻，過膜除菌即得。
[0034]實施例三人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基
人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺2mM、還原型谷胱甘肽10μg/mL、重組人胰島素5μg/mL、人血清白蛋白0.7mg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 μ g/mL和1，2，3，4，6-0-五沒食子酰葡萄糖5 μΜ。
[0035]制備方法與實施例二類似。
[0036]實施例四人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基
人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，包括低糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺6mM、還原型谷胱甘肽15μg/mL、重組人胰島素10μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3 μ g/mL和I, 2, 3, 4, 6-0-五沒食子酰葡萄糖15 μΜ。
[0037]制備方法與實施例二類似。
[0038]實施例五人脂肪間充質(zhì)干細胞在不同培養(yǎng)基中的增殖
將Pl代人脂肪間充質(zhì)干細胞以5000個/mL的密度接種到6孔板中，接種2mL，分別用培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2培養(yǎng)，置于37°C、5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天將細胞用0.25%胰酶消化，計算細胞量，然后以5000個/mL的密度再次接種培養(yǎng)，直到第5代，根據(jù)每個代次的細胞數(shù)量，繪制細胞增殖曲線，結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，本發(fā)明優(yōu)選的無血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的細胞增殖速率明顯大于傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基。
[0039]分別用培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2對Pl代人脂肪間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至PlO代時的細胞形態(tài)圖如圖3所示。從圖3可知，經(jīng)培養(yǎng)基I培養(yǎng)的細胞保持了較好的干細胞幼稚形態(tài)，未出現(xiàn)老化跡象，而經(jīng)培養(yǎng)基2培養(yǎng)的細胞呈現(xiàn)老化跡象。
[0040]實施例六人脂肪間充質(zhì)干細胞在不同培養(yǎng)基中的干性基因表達
將Pl代人脂肪間充質(zhì)干細胞以3X 15個人脂肪間充質(zhì)干細胞的密度接種到6孔板中，接種2mL，分別用培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2培養(yǎng)，置于37°C、5%0)2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h之后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，采用實時熒光定量q-PCR檢測干性相關(guān)基因0ct-4、SOX-2、NanOgmRNA相對表達量，結(jié)果如圖4至圖6所示。從圖4至圖6可知，培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞的干性基因表達明顯優(yōu)于培養(yǎng)基2培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞。
[0041]實施例七人脂肪間充質(zhì)干細胞的表面抗原分析
使用實施例二提供的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至P5代人脂肪間充質(zhì)干細胞時，使用流式細胞儀對人脂肪間充質(zhì)干細胞進行⑶29、⑶45、⑶105、⑶34、⑶44、HLA-DR等表面抗原的分析，結(jié)果:CD29、CD44、CD105的表達為陽性；CD45、CD34、HLA-DR的表達為陰性。
[0042]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺l~6mM、谷胱甘肽l~20yg/mL、重組人胰島素l~10yg/mL、人血清白蛋白 0.01~lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.15-10 μ g/mL 1，2，3，4，6_0_ 五沒食子酰葡萄糖2.5-20 μ Mo2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺2~6mM、谷胱甘肽10~20 μ g/mL、重組人胰島素5~10 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3~5yg/mL和I,2, 3, 4, 6-0-五沒食子酰葡萄糖5~15 μ Mo3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:L-谷氨酰胺4mM、谷胱甘肽12 μ g/mL、重組人胰島素8 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白3.5 μ g/mL和1，2，3，4，6_0_五沒食子酰葡萄糖10 μ M。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基或低糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:還包括鏈霉素，鏈霉素的濃度為100 μ g/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述谷胱甘肽為還原型谷胱甘肽。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重組人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和1，2，3,4, 6-0-五沒食子酰葡萄糖，混勻，過膜除菌即得。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基在人脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分：L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重組人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖。本發(fā)明屬于干細胞技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的人脂肪間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，能促進細胞的快速貼壁和快速增殖，保持良好的干細胞幼稚形態(tài)和干細胞特性。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105112363
【申請?zhí)枴緾N201510505090
【發(fā)明人】王一飛, 廖曉鳳, 王巧利, 劉秋英
【申請人】廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月18日