利用dpo-pcr方法檢測溶藻弧菌的dpo引物序列及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用DPO-PCR方法檢測溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測試劑盒。選擇溶藻弧菌collagenase基因為靶基因，設計DPO引物，其核苷酸序列為：VA-DPOF：5′-TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT-3′，VA-DPOR：5′-ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA-3′；建立DPO-PCR檢測方法，可對溶藻弧菌進行精確定性檢測。本發(fā)明還涉及檢測用試劑盒，含有如上所述的DPO引物對、陽性對照品、陰性對照品、TaqDNAPolymerase和PCR反應液，具有檢測特異性高、準確性高、靈敏度好的優(yōu)點。
【專利說明】利用DPO-PCR方法檢測溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測試
劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術領域】，具體涉及一種利用DPO-PCR方法檢測溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌,分布于河口和海洋環(huán)境中，是引起魚、蝦、貝等多種海水養(yǎng)殖動物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起傷口感染、胃腸炎和敗血癥等癥狀，嚴重威脅著水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造成的經濟損失巨大。此外該菌對人的致病性也有大量報道，可引起人食物中毒、耳炎、腹渴等，己經引起人們的重視。近年來，國內外報道溶藻弧菌引起急性腹灣和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌在自然界中廣泛分布，尤其以海產品中攜帶率最高，是一種重要的引起細菌性食物中毒的致病菌。世界上各個國家食品衛(wèi)生法規(guī)中均把該菌列入法定檢測項目，一經發(fā)現(xiàn)禁止進口和出口。
[0003]目前，對溶藻弧菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進而結合生化及血清學方法進行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測結果準確，但是存在檢測效率低、檢測目標單一、靈敏度低且 耗時長、操作繁瑣等不足。為滿足致病菌快速檢測的要求，發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶鏈式反應(PCR)、膠體金試紙條法、API生化鑒定試紙條法、環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)技術和實時熒光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、膠體金試紙法和API法均存在特異性差、靈敏度低等缺陷，而沒有得到廣泛應用；LAMP法，作為一種新興的檢測方法，盡管極大地提高了檢測效率，又降低了檢測成本，但是產生的假陽性率較高；PCR技術作為一種高度靈敏、快速簡便的檢測方法在諸多領域得到廣泛應用，尤其在病原體檢測方面取得了革命性的成果，成為核酸快速檢測的一個金標準，并在此基礎之上，又發(fā)展了 DNA探針技術、實時熒光PCR技術和PCR結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術等，而PCR引物的設計成為了制約該類檢測方法成敗的關鍵性因素。常規(guī)的PCR引物設計，不僅需要反復比對引物的特異性，而且需要優(yōu)化引物的各項參數(shù)與反應條件，尤其是退火溫度，以防止非特異性擴增，特別是涉及多重PCR時，需要大量的實驗以驗證檢測方法的特異性，費時又費力。
[0004]Dual priming oligonucleotide (DPO)引物設計方法，簡化了建立常規(guī)PCR方法的操作步驟。該引物的設計分為兩部分，中間用多聚次黃嘌呤肌苷連接，5’-端長18-25bp，3’-端長6-15bp。由于該類引物特殊的結構，引物自身以及引物間難形成二級結構且對退火溫度不敏感，試驗過程中不需要對引物進行篩選以及對退火溫度進行優(yōu)化。同時，DPO引物與模板發(fā)生錯配的幾率小，因為只要有3個以上堿基發(fā)生錯配，就不會成功擴增，比常規(guī)PCR引物的特異性更強，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其檢測結果比常規(guī)PCR方法更為精確。
[0005]在此情況下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法對致病性微生物實施精準檢測，對保障公共衛(wèi)生安全具有現(xiàn)實意義。本發(fā)明根據(jù)溶藻弧菌膠原酶collagenase靶基因的保守區(qū)設計合成了一對DPO引物，通過反應體系與反應條件的優(yōu)化，建立了溶藻弧菌DPO-PCR精準檢測方法。本發(fā)明可用于臨床病例的快速診斷和流行病學調查，具有一定的實用性。

【發(fā)明內容】

[0006]基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供利用DPO-PCR方法檢測溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測試劑盒。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術實現(xiàn):
一種基于DPO引物精準檢測溶藻弧菌的PCR方法檢測用引物對，
上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示，
下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明還具有如下技術特征:
1、一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法制備陽性對照品的PCR擴增引物， 上引物VA-F:如序列表Seq ID N0.3所示，
下引物VA-R:如序列表Seq ID N0.4所示。
[0009]2、一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法陽性對照品pMD-T-colIagenase的制備方法，包括以下步驟:
(I )、PCR模板的制備:溶藻弧菌基因組DNA的提取和純化
(2)、選擇溶藻弧菌collagenase基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物:上引物VA-F ,如序列表Seq ID N0.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID N0.4所示，并進行靶基因的PCR擴增；
(3)、陽性對照品pMD-T-colIagenase的制備；
步驟(2)中，靶基因的PCR反應體系如下:
【權利要求】
1.一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法檢測用引物對，其特征在于， 上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示， 下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示。
2.一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法制備陽性對照品的PCR擴增引物對，其特征在于， 上引物VA-F:如序列表Seq ID N0.3所示， 下引物VA-R:如序列表Seq ID N0.4所示。
3.一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法陽性對照品pMD-T-collagenase的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、PCR模板的制備:溶藻弧菌基因組DNA的提取和純化； (2)、選擇溶藻弧菌collagenase基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物:上引物VA-F ,如序列表Seq ID N0.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID N0.4所示，并進行靶基因的PCR擴增； (3)、陽性對照品pMD-T-colIagenase的制備； 步驟(2)中，靶基因的PCR反應體系如下:

4.一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于， 檢測溶藻弧菌的PCR反應體系如下:

5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法檢測用引物對，其特征在于，所述的引物對退火溫度不敏感，有效溫度范圍為48°C~68°C。
6.一種基于DPO引物檢測溶藻弧菌的PCR方法檢測用試劑盒，其特征在于， 包括引物對:上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示，下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示； 陽性對照品(pMD-T-collagenase):如序列表Seq ID N0.5所示； 陰性對照品(ddH20)和 PCR 反應液:10 X PCR Buffer (Mg2+ free) ；dNTP, Mg2+，上游 引物 VA-DPOF,下游引物VA-DP0R和 Taq DNA Polymerase。
【文檔編號】C12Q1/04GK103952483SQ201410162619
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權日:2014年4月21日
【發(fā)明者】李丹丹, 徐義剛, 高慎陽, 王綏家 申請人:海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心