專利名稱：不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用實時熒光PCR技術檢測水體和食品樣品中01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌和非01/非0139群霍亂弧菌的試劑盒及方法。尤其涉及檢測所使用的特異性引物和探針序列。
背景技術：
對霍亂疫區(qū)的外環(huán)境水體和食品樣品進行霍亂弧菌監(jiān)測是霍亂防治工作的重要組成部分，監(jiān)測結(jié)果可對評價外環(huán)境水體中霍亂弧菌污染狀況、制訂霍亂防控策略提供科學依據(jù)，另外，對環(huán)境水體和食品樣品中的霍亂弧菌的監(jiān)測可作為霍亂流行的預警指標。水體和食品樣品中的霍亂弧菌檢測通常是采用傳統(tǒng)的堿性蛋白胨增菌法，國家衛(wèi)生部編制的 《霍亂防治手冊》及GB15984-1995《霍亂診斷標準及處理原則》首選方法也是此法。但在霍亂的非流行期，霍亂弧菌在外環(huán)境水體中自然生存狀態(tài)下菌量較少，同時由于外環(huán)境水體中存在大量其它雜菌，會對霍亂弧菌的分離鑒定產(chǎn)生干擾；并且水體中含有大量的有機物， 常規(guī)法在增菌過程中有機物在微生物的作用下PH值迅速降低，嚴重抑制著霍亂弧菌的生長，致使霍亂弧菌不易檢出而容易出現(xiàn)假陰性，造成在疫情監(jiān)測和調(diào)查中產(chǎn)生誤差，不適應烈性傳染病的監(jiān)測需要。因此，有必要研究一種方法，可同時針對不同血清型霍亂弧菌進行快速且大批量檢測。在PCR反應中使用一對以上的引物和不同熒光標記物的探針進行檢測的多重實時 PCR技術在同一樣品的多種致病菌檢測中已經(jīng)有一定的應用，但現(xiàn)有技術中還未見有針對霍亂弧菌不同血清型檢測的多重實時PCR技術；另外，Taqman MGB探針是在Taqman探針基礎上提出的一種新型分子探針，它的熒光淬滅基團是一種基本無熒光本底的小溝結(jié)合物， 降低了本底，可以用較短的探針達到更好地分辨效果，增加了對指定目標檢測的可靠性，可以更好的實現(xiàn)多重實時PCR反應。本發(fā)明人旨在建立利用多重實時PCR技術快速、準確、靈敏檢測水體和食品樣品中不同血清型霍亂弧菌的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明所述的不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測試劑盒中包括如下引物和探針①霍亂弧菌的01群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID NO. 1) 5' -GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3‘，反向引物(SEQID NO. 2) 5' -CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3‘，探針(SEQID NO. 3) 5' FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)_3‘；②霍亂弧菌的hlyA基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID NO. 4) 5' -GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3‘，反向引物(SEQID NO. 5) 5' -ACTTCCACCCCACCAGTCA-3‘，探針(SEQID N0. 6) 5' NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)_3‘；
③霍亂弧菌的0139群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID NO. 7) 5' -AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3‘，反向引物(SEQID NO. 8) 5' -CCATCACCAGACAAGCATACAG-3‘，探針(SEQID NO. 9) 5' VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)_3‘。所述的試劑盒中還包括其它用于PCR擴增的試劑，這些試劑本領域的普通技術人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術選擇使用。本發(fā)明另一方面的目的在于提供一種不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測方法，主要針對食品和水體中存在的霍亂弧菌。所述方法使用上文所述本發(fā)明的檢測不同血清型霍亂弧菌的試劑盒，是利用特異性引物和探針進行多重PCR(m-PCR)擴增，并以擴增結(jié)果進行判定的方法。所述方法包括如下步驟 ①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應體系總體積20ul，包括步驟①制得的模板DNA溶液2 μ 1，2 X PCR TaqmanGEx酶預混液10 μ 1，霍亂弧菌的01群rfb基因上下游引物各0. 8 μ L、探針0. 4 μ L， 霍亂弧菌的hlyA基因上下游引物各0. 4 μ L、探針0. 2 μ L，霍亂弧菌的0139群rfb基因上下游引物各0. 4 μ L、探針0. 2 μ L、滅菌超純水4. 0 μ 1 ；其中各引物和探針的濃度均為10 μ M ；以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；③步驟②的反應體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測950C /lOmin, 1 個循環(huán)；95°C /15s,60°C /lmin, 40 個循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果。本發(fā)明中所應用的具體的判斷標準是Ct值> 40，可判斷樣品結(jié)果為陰性，可直接報告未檢出相應致病菌；Ct值彡35. 0，可判斷該樣品結(jié)果為陽性；Ct值>35.0而<40，建議重做樣本。重做結(jié)果Ct值彡40者為陰性，否則為陽性。與經(jīng)典方法的細菌分離、鑒定和血清學分型試驗方法相比，本發(fā)明的方法更快速、 準確。且較一般的多重PCR方法特異性強，靈敏度高，能夠同時檢測和鑒定01群霍亂弧菌、 0139群霍亂弧菌和非01/非0139群霍亂弧菌。對此三種菌的檢測特異性均為100%，檢測靈敏度分別為01群霍亂弧菌:19CFU/ml、0139群霍亂弧菌:22CFU/ml和非01/非0139群霍亂弧菌17CFU/ml。
具體實施例方式下面為本發(fā)明的具體實施例，它對本發(fā)明技術方案的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。若無特殊說明，本部分試驗所用生物樣品來自丹東出入境檢驗檢疫局微生物實驗室、沈陽出入境檢驗檢疫局微生物實驗室和遼寧出入境檢驗檢疫局微生物實驗室的水產(chǎn)品和外環(huán)境水體樣品。DNA提取試劑盒(貨號4318930)(美國應用生物系統(tǒng)公司)；2 X PCR Taqman GEx酶預混液(美國應用生物系統(tǒng)公司)；ABI 7300實時熒光PCR儀(ABI公司，美國)。
實施例1、檢測方法的建立一、引物和探針的設計根據(jù)同源性基因篩查比較結(jié)果，選擇具有很高特異性的霍亂弧菌的01群rfb基因 (SEQ ID NO. 10)、霍亂弧菌的hlyA基因(SEQ ID NO. 11)和霍亂弧菌的0139群rfb基因 (SEQ ID NO. 12)為檢測擴增的目標基因。據(jù)NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通過對檢測引物和探針的退火溫度的一致性以及GC含量的相似性等因素的綜合考慮，設計了如下特異性引物和探針①霍亂弧菌的01群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID NO. 1) 5' -GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3‘，反向引物(SEQID NO. 2) 5' -CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3‘，探針(SEQID N0. 3) 5' FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)_3‘；②霍亂弧菌的hlyA基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID N0. 4) 5' -GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3‘，反向引物(SEQID N0. 5) 5' -ACTTCCACCCCACCAGTCA-3‘，探針(SEQID N0. 6) 5' NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)_3‘；③霍亂弧菌的0139群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQID N0. 7) 5' -AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3‘，反向引物(SEQID N0. 8) 5' -CCATCACCAGACAAGCATACAG-3‘，探針(SEQID N0. 9) 5' VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)_3‘。二、霍亂弧菌的m-PCR檢測方法的建立1、制備模板DNA樣品溶液；本實施例基因組DNA的抽提采用美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒 (貨號4318930)并按其操作說明進行抽提樣品DNA。DNA濃度和純度的測定取5 μ L制得的DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和^Onm處的光密度值。DNA的濃度按照如下公式計算獲得C = AXNX 50/1000，式中C 為 DNA 濃度(μ g/ μ L)；A為^Onm處的吸光值；N為核酸稀釋倍數(shù)；IOD260nm = 50 μ g/mL 雙鏈 DNA ；當OD260/OD280比值在1. 7 1. 9之間時，適宜于PCR擴增。2、m-PCR 檢測①反應體系總體積20ul，包括步驟1制得的模板DNA溶液2 μ 1，2XPCR TaqmanGEx酶預混液10 μ 1，霍亂弧菌的01群rfb基因上下游引物各0. 8 μ L、探針0. 4 μ L， 霍亂弧菌的hlyA基因上下游引物各0. 4 μ L、探針0. 2 μ L，霍亂弧菌的0139群rfb基因上下游引物各0.4μ L、探針0. 2yL、滅菌超純水4.0μ 1 ；其中各引物和探針的濃度均為10μΜ ；②以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；③步驟②的反應體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測
950C /lOmin, 1 個循環(huán)；95°C /15s,60°C /lmin, 40 個循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果，其中 Ct值(cycle threshold)是指每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；3、結(jié)果判斷Ct值> 40，可判斷樣品結(jié)果為陰性，可直接報告未檢出相應致病菌；Ct值彡35. 0，可判斷該樣品結(jié)果為陽性；Ct值>35.0而<40，建議重做樣本。重做結(jié)果Ct值彡40者為陰性，否則為陽性。對于陽性結(jié)果，參照IS0/TS 21872-1方法做進一步的生化鑒定和報告。三、霍亂弧菌的m-PCR檢測應用應用上述三種特異性引物和探針及檢測方法檢測含有不同血清型霍亂弧菌的DNA 樣品，DNA樣品包括31株01群霍亂弧菌、27株非01/0139群霍亂弧菌和5株0139群霍亂弧菌，以及其它水體中能分離出的8種常見弧菌(包括擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥氏弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、嗜水氣單胞菌)。以對方法的在實際樣品檢測中的應用進行評估，檢測結(jié)果如下。陰性對照結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC通道均無熒光信號檢出，說明反應結(jié)果正常， 反應體系無污染。陽性對照結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC通道均有熒光信號檢出，反應結(jié)果正
堂
巾ο對霍亂弧菌的01群rfb基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為16左右時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。對霍亂弧菌中hlyA基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為28 34之間時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。對霍亂弧菌的0139群rfb基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為19左右時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。其他弧菌的rfb基因和hlyA基因檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC三通道，均無熒光信號檢出，檢測結(jié)果均為陰性。由上述實驗結(jié)果可見，采用三重實時熒光PCR法時三種目的片段均獲得擴增，結(jié)果互不干擾，并且能夠與其它弧菌相區(qū)別。說明01群、0139群特異性rfb基因霍亂弧菌和屬特異性的溶血素基因(hlyA)共同檢測時特異性高，沒有交叉反應和干擾現(xiàn)象。實施例2、特異性試驗應用實施例1的特異性引物和探針及檢測方法檢測含有不同血清型霍亂弧菌的 DNA樣品。同時檢測含有單增李斯特氏菌、麥氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形菌、志賀氏菌、 沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7、阪崎腸桿菌等其它致病菌DNA樣品，以對方法的特異性進行評估，檢測結(jié)果如下。陰性對照結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC通道均無熒光信號檢出，說明反應結(jié)果正常， 反應體系無污染。陽性對照結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC通道均有熒光信號檢出，反應結(jié)果正
堂
巾ο對霍亂弧菌的01群rfb基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為16. 5左右時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。對霍亂弧菌中hlyA基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為18左右時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。對霍亂弧菌的0139群rfb基因進行檢測結(jié)果顯示，在Ct值為17左右時，出現(xiàn)熒光曲線增幅現(xiàn)象，檢測結(jié)果為陽性。其他致病菌的rfb基因和hlyA基因檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM、NED和VIC三通道，均無熒光信號檢出，檢測結(jié)果均為陰性。由上述實驗結(jié)果可見，本發(fā)明具有很好的特異性。實施例3、靈敏度試驗一、標準菌株純培養(yǎng)物檢測靈敏度應用實施例1的特異性引物和探針及檢測方法，對01群、非01/非0139群(022) 和0 139群霍亂弧菌標準菌株純培養(yǎng)物進行檢測靈敏度的研究。取上述三種標準菌株于普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 左右后，測其OD值，估計其菌數(shù)，然后按十倍遞增進行梯度稀釋到10_7，取最后四個稀釋液的菌液進行平板計數(shù)，每個稀釋度重復3個，按照相應的方法培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)取平均值確定其真實的菌密度。同時每個稀釋液各取ImL菌液于2mL離心管中并作3管重復，用于提取DNA并應用本發(fā)明方法進行三重實時熒光PCR檢測，以確定本發(fā)明方法的檢測靈敏度。檢測結(jié)果陰性對照檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM通道、NED通道和VIC通道均無熒光信號檢出，說明反應結(jié)果正常，反應體系無污染；陽性對照檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM通道、NED通道和VIC 通道均有熒光信號檢出，反應結(jié)果正常；標準菌株純培養(yǎng)物靈敏度檢測結(jié)果顯示01群霍亂弧菌標準菌株濃度分別為1900CFU/ml、190CFU/ml和19CFU/ml時均能很好檢出；非01/ 非0139群霍亂弧菌標準菌株濃度分別為1700CFU/ml、170CFU/ml和17CFU/ml時均能很好檢出，0139群霍亂弧菌標準菌株濃度分別為2200CFU/ml、220CFU/ml和22CFU/ml時均能很好檢出。結(jié)果表明該標準方法對標準菌株純培養(yǎng)物檢測靈敏度分別為0 1群霍亂弧菌 19CFU/ml、0139群霍亂弧菌22CFU/ml和非01/非0139群霍亂弧菌17CFU/ml。二、樣品中添加01、非01/非0139和0139三種血清型霍亂弧菌標準菌株的靈敏度實驗應用實施例1的特異性引物和探針及檢測方法，對樣品中添加01、非01/非0139 和0139三種血清型霍亂弧菌標準菌株進行檢測靈敏度的研究。選用已經(jīng)確認霍亂弧菌陰性的樣品，分別取IOg樣品加入IOOmL增菌液中同時添加已知不同濃度梯度的上述三種血清型霍亂弧菌，均質(zhì)后取ImL均質(zhì)液提取DNA，用于三重靈敏度試驗，確定樣品中添加上述三種致病菌的靈敏度。同時提取陰性樣品均質(zhì)液ImL提 DNA用于PCR檢測。檢測結(jié)果陰性對照檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM通道、NED通道和VIC通道均無熒光信號檢出，說明反應結(jié)果正常，反應體系無污染；陽性對照檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM通道、NED通道和VIC 通道均有熒光信號檢出，反應結(jié)果正常；樣品中添加01、非01/非0139和0139三種霍亂弧菌標準菌株靈敏度檢測結(jié)果顯示，01群霍亂弧菌添加濃度分別為1900CFU/ml、190CFU/ml 和19CFU/ml時均能很好檢出，非01/非0139群霍亂弧菌菌株添加濃度分別為1700CFU/ml、170CFU/ml和17CFU/ml時均能很好檢出，0139群霍亂弧菌菌株添加濃度分別為2200CFU/ ml、220CFU/ml和22CFU/ml時均能很好檢出。結(jié)果表明該標準方法對樣品中添加01、非01/非0139和0139三種血清型霍亂弧菌標準菌株檢測靈敏度分別為01群霍亂弧菌19CFU/ml、非01/非0139群霍亂弧菌17CFU/ ml和0139群霍亂弧菌22CFU/ml。實施例4、應用于實際樣品檢測應用實施例1的特異性引物和探針及檢測方法，以傳統(tǒng)的檢測方法為對照(SN/ T1022-2010)。實際檢測樣品包括江瑤貝、海螺肉、凍牛肉及水樣等共885份。檢測結(jié)果如下表(表1)所示表1三重實時熒光PCR對食品樣品和水體標本中霍亂弧菌的檢測
權(quán)利要求
1.不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括如下引物和探針①霍亂弧菌的01群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO. 1) 5' -GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3‘， 反向引物(SEQ ID NO. 2) 5' -CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3‘， 探針(SEQ ID NO. 3) 5' FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)-3‘；②霍亂弧菌的hlyA基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO. 4) 5' -GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3‘， 反向引物(SEQ ID NO. 5) 5' -ACTTCCACCCCACCAGTCA-3‘， 探針(SEQ ID NO. 6) 5' NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3‘；③霍亂弧菌的0139群rfb基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO. 7) 5' -AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3‘， 反向引物(SEQ ID NO. 8) 5' -CCATCACCAGACAAGCATACAG-3‘， 探針(SEQ ID NO. 9) 5' VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3‘。
2.不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測方法，包括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應體系總體積20ul，其組成為 步驟①制得的模板DNA溶液2 μ 1，2 X PCR Taqman GEx 酶預混液 10 μ 1， 滅菌超純水4.0 μ 1，SEQ ID N0S. 1/2 的引物對 0. 8 μ L、SEQ ID NO. 3 的探針 0. 4 μ L， SEQ ID N0S. 4/5 的引物對 0. 4 μ L、SEQ ID NO. 6 的探針 0. 2 μ L, SEQ ID N0S. 7/8 的引物對 0. 4 μ L、SEQ ID NO. 9 的探針 0. 2 μ L, 其中各引物和探針的濃度均為IOyM;以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；③步驟②的反應體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測 950C /lOmin, 1 個循環(huán)；95°C /15s,60°C /lmin, 40 個循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果。
全文摘要
不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒中包括SEQ IDNOS.1/2、SEQ ID NOS.4/5、SEQ ID NOS.7/8的檢測引物和SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.9的探針序列。與經(jīng)典方法的細菌分離、鑒定和血清學分型試驗方法相比，本發(fā)明方法更快速、準確。且較一般的多重PCR方法特異性強，靈敏度高，能夠同時檢測和鑒定O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌和非O1/非O139群霍亂弧菌。對此三種菌的檢測特異性均為100％，檢測靈敏度分別為O1群霍亂弧菌19CFU/ml、O139群霍亂弧菌22CFU/ml、非O1/非O139群霍亂弧菌17CFU/ml。
文檔編號G01N21/64GK102367475SQ201110281129
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者于曉婕, 于杰, 王殿夫, 麻麗丹 申請人:于曉婕, 王殿夫, 麻麗丹