專利名稱：可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙重PCR檢測方法，尤其是一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于臨床的可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法。
背景技術(shù)：
弧菌廣泛分布于近岸、河口海區(qū)，大多是存在于海水和海洋生物體表及腸道的優(yōu)勢菌群，同時(shí)也是引起海水養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的最重要的病原菌之一。大量的研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，弧菌病就是由弧菌屬細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病。獲弧菌iyibri0.anguillarum)和哈維氏弧菌{Vibrio, harveyi)是兩種重要的水產(chǎn)動物弧菌病病原菌，流行廣、發(fā)病率高。鰻弧菌是條件性致病菌，當(dāng)養(yǎng)殖動物在不良的環(huán)境條件下，遭遇不利刺激或是受傷時(shí)，會誘發(fā)疾病的發(fā)生，可感染至少40多種魚，如虹鱒、鰻鱺、香魚、鱸魚、大菱鲆、牙鲆、黃魚等。感染鰻弧菌的魚蝦病情會逐步加深，如感染鰻弧菌的魚體表最初出現(xiàn)局部褪色，鰭條、鰭基部及鰓骨下部充血發(fā)紅，肛門紅腫，繼而肌肉組織有彌散性或點(diǎn)狀出血，體表發(fā)黑，鰭部出現(xiàn)潰爛。解剖檢驗(yàn)時(shí)有明顯的黃色粘稠腹水，腸粘膜組織腐爛脫落，部分魚肝臟 壞死。哈維氏弧菌能引起大黃魚、石斑魚、鯛、尖吻鱸、斜帶石斑魚、高體螄、大菱鲆、文蛤、對蝦等多種水產(chǎn)動物的疾病，如感染哈維氏弧菌后的大黃魚體表發(fā)白，游動遲緩，經(jīng)常浮出水面離群獨(dú)游，體表多處皮膚潰爛，傷口周圍鱗片松散脫落，胸、腹部有彌散性出血，尾鰭基部充血，尾部嚴(yán)重潰爛。哈維氏弧菌給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的損失，而且還能通過食物鏈引起食用者中毒，是人魚共患病原菌。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中建立對弧菌病的早期檢測技術(shù)，是有效預(yù)防弧菌病的重要手段。目前，雙重PCR主要應(yīng)用于可引起人類疾病的弧菌檢測，如食品檢測等，而在水產(chǎn)動物弧菌病基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能檢測一種弧菌，檢測所需時(shí)間長且常常造成漏檢或誤檢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在上述問題，提供一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于臨床的可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行:
a.制備被檢測物的DNA模板并置于反應(yīng)管中；
b.將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ 1，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ I ；
所述鰻弧菌引物引物序列為:
Rpo-F:5’ - AGACCAAGAGATCATGGATT _3’
Rpo-R: 5’ - AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’
所述哈維氏弧菌引物序列為:Tox-F: 5， - GAAGCAGCACTCACCGAT -3，
Tox-R: 5， - GGTGAAGACTCATCAGCA -3，
所述雙重 PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s, 52.0-61°C 30s, 72°C lmin,共32個循環(huán)；72°C終延伸7min ；
所述雙重PCR反應(yīng)體系為25 μ 1:1 μ IDNA模板，2.5μ I不含Mg2+的IOXPCR buffer,
0.5μ1 的 IOmM 的(1ΝΤΡ，2μ1 的 25mM 的 Mg2+，0.15μ1 的 Taq 酶(50U)，引物各 I μ 1，雙蒸水17.85μ1。所述a步驟的制備被檢測物的DNA模板是取水產(chǎn)動物的組織勻漿液置于1.5ml的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于1.5ml滅菌離心管中；10，OOOg離心IOmin,除去上清液，加入100 μ I 0.1 M的TE緩沖溶液，100°C沸水浴IOmin ； 10，OOOg離心lOmin，上清液即水產(chǎn)動物DNA模板。本發(fā)明與現(xiàn)有普通PCR檢測哈 維氏弧菌和鰻弧菌技術(shù)相比，方法簡單、耗時(shí)短、成本低廉，引物檢測靈敏度高，適于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)及養(yǎng)殖場操作，對由這兩種弧菌引起的弧菌病的監(jiān)測與預(yù)防提供了有效的工具，可有效減少經(jīng)濟(jì)損失。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的PCR擴(kuò)增圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的PCR擴(kuò)增圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
a.以標(biāo)準(zhǔn)的兩株獲弧菌Vibrio anguillarum KCTC2711、Vibrio anguillaru ATCC19019為被檢測物，用現(xiàn)有DNA提取方法制備其DNA模板并置于反應(yīng)管中；
b.將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ 1，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ I ；
根據(jù)鰻弧菌rpoS基因設(shè)計(jì)合成 的鰻弧菌引物序列為:
Rpo-F:5’ - AGACCAAGAGATCATGGATT _3’
Rpo-R: 5’ - AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’
根據(jù)哈維氏弧菌toxR基因設(shè)計(jì)合成的哈維氏弧菌引物序列為:
Tox-F: 5， - GAAGCAGCACTCACCGAT -3，
Tox-R: 5， - GGTGAAGACTCATCAGCA -3，
所述雙重 PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s, 52.0-61°C 30s, 72°C lmin,共32個循環(huán)；72°C終延伸7min ；
所述雙重PCR反應(yīng)體系為25 μ 1:1 μ IDNA模板，2.5μ I不含Mg2+的10XPCR buffer,
0.5μ1 的 1OmM 的(1ΝΤΡ，2μ1 的 25mM 的 Mg2+，0.15μ1 的 Taq 酶(50U)，引物各 1 μ 1，雙蒸水
17.85μ1。檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中Μ: DNA marker ；1:陰性對照；2.3:鰻弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例1的方法可擴(kuò)增出目的條帶。
實(shí)施例2:
雙重PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系均同實(shí)施例1,與實(shí)施例1的所不同的是以標(biāo)準(zhǔn)的三株哈維氏弧菌 Vibrio harveyi ATCC14126、Vibrio harvesti HO50704-1 > Vibrio harvevGYCl 108-1為被檢測物。檢測結(jié)果如圖2所示，圖2中M: DNA marker ;1_3:哈維氏弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物；4.陰性對照。結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例2的方法可擴(kuò)增出目的條帶。實(shí)施例3:
雙重PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系均同實(shí)施例1,與實(shí)施例1所不同的是標(biāo)準(zhǔn)的鰻弧菌 Vibrio anguiIlaruA TCC 19019 和哈維氏弧菌 Vibrio harveyi HO50704-1 制成1.0X108cells/ml的菌懸液，感染健康大菱鲆(體長l(Tl3cm) 6小時(shí)后，取肝臟和腎臟各約
0.lg，制備組織勻漿液置于1.5ml的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于
1.5ml滅菌離心管中；10，000g離心lOmin，除去上清液，加入100μ I 0.1 M的TE緩沖溶液，100°C沸水浴I Omin ； 10, OOOg離心IOmin,上清液即DNA模板。檢測結(jié)果如圖3所示，圖3中1:哈維氏弧菌和鰻弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物；2:鰻弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物；3:哈維氏弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物；4.陰性對照。結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例3的方法可擴(kuò)增出目的條帶。
權(quán)利要求
1.一種可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行: a.制備被檢測物的DNA模板并置于反應(yīng)管中； b.將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ 1，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20 pmol/μ I ； 所述鰻弧菌引物引物序列為:Rpo-F:5’ - AGACCAAGAGATCATGGATT _3’Rpo-R: 5’ - AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’ 所述哈維氏弧菌引物 序列為:Tox-F: 5， - GAAGCAGCACTCACCGAT -3，Tox-R: 5， - GGTGAAGACTCATCAGCA -3， 所述雙重 PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s, 52.0-61°C 30s, 72°C lmin,共32個循環(huán)；72°C終延伸7min ； 所述雙重PCR反應(yīng)體系為25 μ 1:1 μ IDNA模板，2.5μ I不含Mg2+的IOXPCR buffer,0.5μ1 的 IOmM 的(1ΝΤΡ，2μ1 的 25mM 的 Mg2+，0.15μ1 的 Taq 酶(50U)，引物各 I μ 1，雙蒸水17.85μ1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于:所述a步驟的制備被檢測物的DNA模板是取水產(chǎn)動物的組織勻漿液置于1.5ml的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于1.5ml滅菌離心管中；10，OOOg離心IOmin,除去上清液，加入100 μ I 0.1 M的TE緩沖溶液，100°C沸水浴IOmin ； 10，OOOg離心lOmin，上清液即水產(chǎn)動物DNA模板。
全文摘要
本發(fā)明公開一種耗時(shí)短、效率高，靈敏度高，可直接應(yīng)用于臨床的同時(shí)檢測水產(chǎn)動物中哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法?？赏瑫r(shí)檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，制備被檢測物的DNA模板并置于反應(yīng)管中；將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20pmol/μl，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20pmol/μl；所述鰻弧菌引物引物序列為Rpo-F:5’-AGACCAAGAGATCATGGATT-3’、Rpo-R:5’-AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’、所述哈維氏弧菌引物序列為Tox-F:5’-GAAGCAGCACTCACCGAT-3’、Tox-R:5’-GGTGAAGACTCATCAGCA-3’。
文檔編號C12Q1/04GK103088132SQ20131001802
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李華, 李強(qiáng), 馮春明, 葉仕根, 王軼南 申請人:大連海洋大學(xué)