專利名稱：一種檢測水體中弧菌的多重?zé)晒鈖cr試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及弧菌的檢測，具體涉及一種檢測水體中弧菌的多重?zé)晒釶CR試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
目前致病性弧菌傳統(tǒng)的檢測方法還是通過微生物培養(yǎng)進(jìn)行分離鑒定，尚不夠完善，其需經(jīng)過多個(gè)篩選步驟，需要多種培養(yǎng)基，耗時(shí)較長；另有利用弧菌的單克隆抗體檢測的方法，該方法要求挑取單一的菌落大量增菌后利用免疫學(xué)方法鑒定，特異性較高，但兩種方法檢測所需時(shí)間均較長。在分子生物學(xué)檢測方 面，F(xiàn)DA標(biāo)準(zhǔn)仍是以檢測一種致病性弧菌為目的設(shè)計(jì)PCR程序。國內(nèi)的檢測試劑設(shè)計(jì)PCR檢測方法時(shí)也只是能夠同時(shí)檢測3種弧菌，而且關(guān)注的都是01型和0139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，檢測樣品也主要是針對食品當(dāng)中的弧菌的檢測。但是除了常見的霍亂弧菌和副溶血弧菌外，許多國家已開始關(guān)注其他致病性弧菌以及弧菌在環(huán)境水體中的存在。例如，有害的水生生物和病原體通過船舶壓艙水進(jìn)入新環(huán)境已被世界環(huán)保基金(GEF)確定為全球海洋面臨的重大威脅之一?！秶H衛(wèi)生條例(2005)》將國際航行船舶壓艙水作為口岸的重要監(jiān)管對象，作為檢驗(yàn)檢疫部門承擔(dān)著對壓艙水?dāng)y帶病原生物的監(jiān)管職責(zé)，其中壓艙水中就包括霍亂弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌的存在。四重?zé)晒釶CR技術(shù)原理是基于單色熒光PCR技術(shù)，是指在同一個(gè)熒光PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時(shí)擴(kuò)增四個(gè)目的基因，探針為多種熒光標(biāo)記比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴(kuò)增過程中所產(chǎn)生的熒光信號不同。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高且容易漏檢的問題。由于在水體中存有多種弧菌，因此，有必要研究一種方法，可有效富集水體中的細(xì)菌數(shù)量并可同時(shí)檢測多個(gè)致病性弧菌。這樣，可以在加快檢測速度的同時(shí)大幅提高檢出率，減少工作量和檢測成本，以適應(yīng)衛(wèi)生檢驗(yàn)的新的形式需求，與國際方法接軌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水體中致病性弧菌的四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及檢測方法，具有有效富集水體中的細(xì)菌數(shù)量，無需前增菌過程，并可同時(shí)檢測創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌等4種致病性弧菌的優(yōu)點(diǎn)，可以在加快檢測速度的同時(shí)大幅提高檢出率，減少工作量和檢測成本。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種檢測水體中弧菌的多重?zé)晒釶CR試劑盒，該試劑盒是在創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌核酸序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計(jì)出一對特異性引物，利用PCR技術(shù)結(jié)合細(xì)菌富集方法對創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌進(jìn)行快速檢測；此技術(shù)無需前增菌步驟，大大縮短了操作時(shí)間，同時(shí)減少了污染，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。具體的說，該試劑盒包括濃度為5U/ul的TaqDNA聚合酶、多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液、細(xì)菌富集試劑、DNA提取試劑。其中多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液含有多重IOX熒光PCR反應(yīng)緩沖液、創(chuàng)傷弧菌引物、創(chuàng)傷弧菌探針、溶藻弧菌引物、溶操弧菌探針、擬態(tài)弧菌引物、擬態(tài)弧菌探針、河弧菌引物、河弧菌探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光PCR反應(yīng)緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂；細(xì)菌富集試劑含有PEG8000、氯化鈉；DNA提取試劑含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、乙二胺四乙酸、NP40。具體細(xì)菌富集試劑配制PEG8000和氯化鈉溶于純水配成PEG8000質(zhì)量百分濃度為20%、氯化鈉終濃度為200mM的細(xì)菌富集試劑，冰箱4 oC保存。DNA提取試劑含有終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的乙二胺四乙酸、質(zhì)量百分終濃度1%的NP40，余量為超純水，冰箱4 oC保存。多重10XPCR反應(yīng)緩沖液含有終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質(zhì)量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP (四種單核苷酸單體)，終濃度2mM的氯化鎂，余量為超純水；多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液按下述體積比配制多重10XPCR反應(yīng)緩沖液 2. 5ul，濃度 20mg/ml 牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VV Pf、VVPr、VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各
O.2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul，探針 VVPb、VAPb、VMPb、VFPb 各 O. 4ul，無 RNA 酶 DEPC 水18. 3ul，配制混合后于冰箱-20°C保存。還可以有陽性對照品和陰性對照品，陽性對照品為連接有創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆載體；陰性對照品為無DNA酶的DEPC水。上述引物和探針是依據(jù)創(chuàng)傷弧菌WhA基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
VVPf: GTTAACGGCTGGAGCTGTC，
VVPr: ACGGTCAAACAACGATCGGA,
VVPb: ROX-CGGCAAACTTGGTTCCAACTGCCG-DABCYL,
依據(jù)溶藻弧菌collagenase基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
VAPf: GTGGAACGAGCAATTTGTGC,
VAPr: CCCGACCATACATTTCATACTGT,
VAPb: HEX-CCGGGACAACAGAACTCGCGTTACCCGG-DABCYL,
依據(jù)擬態(tài)弧菌toxR基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
VMPf: AGGAAACTGGAATCGATTTTTCC,
VMPr: GCTAACGGAATCAACATCGC,
VMPb: FAM-CGGGGATCAACAAAATCAGCCGAGTCCCCG-DABCYL ；
依據(jù)河弧菌toxR基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
VFPf: GCCGTATCCTCTTCAGAACTT,
VFPr: GACGGCAACCAACAGAATCAA,
VFPb: CY5-CGGCGCAGTTATTACTCAGACGTCGCCG-DABCYL。利用該試劑盒檢測水體中弧菌的方法，由下述步驟組成
a、細(xì)菌富集在無菌條件下，取待檢水樣與上述細(xì)菌富集試劑按100 1的比例充分混合，繼而13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，并加入O. 5ml的質(zhì)量百分濃度O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散得到細(xì)菌富集液；b、核酸DNA提取取50ul細(xì)菌富集液及50ul DNA提取試劑于I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin，13000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20°C環(huán)境下儲存?zhèn)溆茫?br> c、25ul反應(yīng)體系配制取2ulDNA模板或陽性對照或陰性對照至PCR管中，加入22.6ul多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增；
d、多重?zé)晒釶CR反應(yīng)在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌；反應(yīng)條件940C預(yù)變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s，72°C延伸15s，40次循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
e、檢測結(jié)果判斷出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性，沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，或者有擴(kuò)增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線 ，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。本發(fā)明采用了創(chuàng)新的細(xì)菌富集試劑技術(shù)、DNA提取試劑技術(shù)、特異性熒光探針雜交PCR檢測技術(shù)以及多重PCR技術(shù)，樣本無需增菌培養(yǎng)，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾，且一次能檢測4種弧菌。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在無需樣本前增菌，細(xì)菌的檢測敏感性高、特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率；可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌的快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I
一種檢測水體中致病性弧菌的多重?zé)晒釶CR試劑盒，該試劑盒由多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液、細(xì)菌富集試劑(含有質(zhì)量百分終濃度20%的PEG8000、終濃度200mM的氯化鈉)、DNA提取試劑(內(nèi)含終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的乙二胺四乙酸、質(zhì)量百分終濃度1%的NP40)、濃度為5U/ul的Taq DNA聚合酶組成，其中多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液按下述體積比配制多重IOX熒光PCR反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質(zhì)量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，終濃度2mM的氯化鎂)2. 5ul，濃度20mg/ml牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VVPf、VVPr, VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各 O. 2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul,探針VVPb、VAPb、VMPb、VFPb各O. 4ul，無RNA酶DEPC水18. 3ul。還可以有陽性對照品連接有創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆載體；陰性對照品無DNA酶的DEPC水。上述引物及探針針對溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用Clustalw等軟件分析序列的同源性，設(shè)計(jì)并篩選本發(fā)明的各引物和探針序列，由上海英駿公司合成。實(shí)施例2
I、選取如下病原微生物，實(shí)驗(yàn)組溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌；對照組01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌和沙門氏菌，上述病原菌株均自環(huán)境樣本分離培養(yǎng)保存溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌、Ol群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌由本研究院周冬根等同志，在2011年3月左右于寧波市內(nèi)各水體中采集、分離培養(yǎng)，聯(lián)系電話為0574-87169626。2、模擬環(huán)境樣本制備分別將O. 5ml的濃度均為I X 105CFU/ml的溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌、01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌與500ml的飲用水充分混合，制成濃度均為103CFU/ml的模擬環(huán)境樣本。3、細(xì)菌富集在無菌條件下，取5份采集自船舶壓艙水的待檢水樣50ml與O. 5ml細(xì)菌富集試劑充分混合，繼而13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，并加入O. 5ml的O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散；
4、核酸DNA提取取50ul各模擬環(huán) 境樣本和各份細(xì)菌富集液分別與50ulDNA提取試劑加入I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin, 13000rpm離心5min,取上清液作為DNA模板，_20°C環(huán)境下儲存?zhèn)溆茫?br> 5、25ul反應(yīng)體系配制取2ulDNA模板或陽性對照或陰性對照至PCR管中，加入22.6ul多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增；
6、多重?zé)晒釶CR反應(yīng)在四色熒光定量PCR儀(市售)上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為Reporter Dye: ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌；反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s (檢測熒光)，72°C延伸15s，40次循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
7、檢測結(jié)果判斷方法出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性，沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，或者有擴(kuò)增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌及創(chuàng)傷弧菌檢測均為陽性，而對照組中的01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌均為陰性，特異性高，用陽性對照品倍比稀釋后檢測靈敏度達(dá)到lOOOcopies/ml。待檢水樣結(jié)果4份樣本檢測結(jié)果為HEX通道呈S形擴(kuò)增曲線，Ct值在19-23之間，為溶藻弧菌感染；1份樣本檢測結(jié)果為ROX通道呈S形擴(kuò)增曲線，Ct值為37. 4，重復(fù)檢測仍出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，為陽性創(chuàng)傷弧菌感染。實(shí)施例3
3份待檢飲用水水樣與實(shí)施例2中步驟3、4、5、6、7相同方式檢測，結(jié)果I份待檢飲用水水樣CY5通道呈S形擴(kuò)增曲線，Ct值在32，有河弧菌感染。
權(quán)利要求
1.一種檢測水體中弧菌的多重?zé)晒釶CR試劑盒，包括濃度為5U/ul的Taq DNA聚合酶、多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液和DNA提取試劑，其特征在于還包括細(xì)菌富集試劑，所述細(xì)菌富集試劑含有質(zhì)量百分終濃度20%的PEG8000和終濃度200mM的氯化鈉，所述DNA提取試劑含有終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的こニ胺四こ酸、質(zhì)量百分終濃度1%的NP40，所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液按體積比多重10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5ul，濃度20mg/ml牛血清白蛋白O. 5ul，引物VVPf、VVPr、VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各 O. 2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul,探針 VVPb、VAPb, VMPb, VFPb 各 O. 4ul,無 RNA酶DEPC水18. 3ul組成，所述多重10XPCR反應(yīng)緩沖液含有終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質(zhì)量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，終濃度2mM的氯化鎂，引物VVPf的核苷酸序列為GTTAACGGCTGGAGCTGTC,引物VVPr的核苷酸序列為ACGGTCAAAC AACGATCGGA,探針VVPb的核苷酸序列為 ROX-CGGCAAACTT GGTTCCAACT GCCG-DABCYL,引物 VAPf 的核苷酸序列為 GTGGAACGAGCAATTTGTGC,引物 VAPr 的核苷酸序列為 CCCGACCATA CATTTCATAC TGT，探針 VAPb 的核苷酸序列為 HEX-CCGGGACAAC AGAACTCGCG TTACCCGG-DABCYL,弓丨物 VMPf 的核苷酸序列為AGGAAACTGG AATCGATTTT TCC，引物 VMPr 的核苷酸序列為 GCTAACGGAA TCAACATCGC，探針VMPb 的核苷酸序列為 FAM-CGGGGATCAA CAAAATCAGC CGAGTCCCCG-DABCYL，引物 VFPf 的核苷酸序列為 GCCGTATCCT CTTCAGAACT T，引物 VFPr 的核苷酸序列為 GACGGCAACC AACAGAATCAA，探針 VFPb 的核苷酸序列為 CY5-CGGCGCAGTT ATTACTCAGA CGTCGCCG-DABCYL。
2.權(quán)利要求I所述的ー種檢測水體中弧菌的多重?zé)晒釶CR試劑盒檢測水體中弧菌的方法，其特征在于步驟如下 a、細(xì)菌富集在無菌條件下，取待檢水樣與所述細(xì)菌富集試劑按100 1的比例充分混合，13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，加入O. 5ml的質(zhì)量百分濃度O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散得到細(xì)菌富集液； b、核酸DNA提取取50ul細(xì)菌富集液及50ul所述DNA提取試劑于I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin，13000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20°C環(huán)境下儲存?zhèn)溆茫? c、25ul反應(yīng)體系配制取2ul所述DNA模板至PCR管中，加入22.6ul多重?zé)晒釶CR反應(yīng)母液和O. 4ul濃度5U/ul的Taq DNA聚合酶，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增； d、多重?zé)晒釶CR反應(yīng)在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌；反應(yīng)條件940C預(yù)變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s，72°C延伸15s，40次循環(huán)，設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序； e、檢測結(jié)果判斷通道中出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為對應(yīng)弧菌陽性，沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，或者有擴(kuò)增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為對應(yīng)弧菌可疑，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為對應(yīng)弧菌陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水體中致病性弧菌的四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及檢測方法，采用了創(chuàng)新的細(xì)菌富集試劑技術(shù)、DNA提取試劑技術(shù)、特異性熒光探針雜交PCR檢測技術(shù)以及多重PCR技術(shù)，樣本無需增菌培養(yǎng)，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾，且一次能檢測4種弧菌。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在無需樣本前增菌，細(xì)菌的檢測敏感性高、特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率；可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌及河弧菌的快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102816840SQ20121024989
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者孫大為, 周冬根, 李紅, 龍?jiān)俸? 倪敏君, 張升, 楊天賜 申請人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院