專利名稱：一種誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法。
背景技術(shù)：
去分化是指將已分化的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化為另一較原始的具備更多分化潛能的細(xì)胞類型，如類似胚胎干細(xì)胞或前體細(xì)胞的狀態(tài)。去分化的研究對于細(xì)胞生物學(xué)的科學(xué)研究和干細(xì)胞的臨床應(yīng)用方面都具有重要意義。目前去分化研究主要采取轉(zhuǎn)基因的方法，但是由于基因組的改變，細(xì)胞面臨癌變的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞命運(yùn)不僅受內(nèi)部基因的調(diào)控，外部環(huán)境的影響也是很關(guān)鍵的，如能通過物理手段調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境實(shí)現(xiàn)細(xì)胞去分化將避免轉(zhuǎn)基因去分化所帶來的細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將成熟細(xì)胞在哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到球狀細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化；所述哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基為將哺乳動物細(xì)胞液體培養(yǎng)基與凝固劑混合，得到固體培養(yǎng)基。上述方法中，所述哺乳動物細(xì)胞液體培養(yǎng)基可以根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞不同進(jìn)行選擇，本發(fā)明培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，因此選用的哺乳動物細(xì)胞液體培養(yǎng)基為2 X DMEM基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基;所述凝固劑為瓊脂糖；凝固劑的加入量只要凝固即可，本發(fā)明的實(shí)施例為等體積的2 X DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和1%瓊脂糖溶液混勻。所述瓊脂糖為質(zhì)量百分含量為1%瓊脂糖水溶液；所述2 X DMEM基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基與質(zhì)量百分含量為1%瓊脂糖水溶液混合體積比為1:1。上述方法中，所述培養(yǎng)為將所述成熟細(xì)胞接種到裝有所述哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)的條件如下:在37°C、5%C02培養(yǎng)。上述方法中，所述培養(yǎng)的時間為5-10天；所述培養(yǎng)容器為培養(yǎng)皿；所述成熟細(xì)胞與所述固體培養(yǎng)基的配比為106-6X IO6個/5ml。上述方法中，所述成熟細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。上述方法中，所述球狀細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞全能性，但不是人胚胎干細(xì)胞；所述胚胎干細(xì)胞全能性具體體現(xiàn)在如下I)_5)中至少一種:1)提高iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量；所述iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子具體為0CT4、NANOG, S0X2、KLF4和/或LIN28 ；
2)提聞胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量；所述胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物具體為REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和/或FGF4 ；3)提高三胚層標(biāo)志物的相對表達(dá)量；所述三胚層標(biāo)志物為內(nèi)胚層標(biāo)志物FoxA2、Afp、Soxl7和Pdx-1中的至少一種、中胚層標(biāo)志物Brachyury、Msxl中的至少一種和/或外胚層標(biāo)志物Nestin、0tx2和Tp63中的至少一種；4)提高細(xì)胞成瘤能力；5)提高腎臟組織前體標(biāo)志物相對表達(dá)量。所述腎臟組織前體標(biāo)志物為ΡΑΧ2、WTl、INTEGRINa8、SALLl、LIMU NCAMl、SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b/ 或 NTRK2。由上述方法得到的球狀細(xì)胞也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述球狀細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞全能性，但不是人胚胎干細(xì)胞；所述胚胎干細(xì)胞全能性具體體現(xiàn)在如下I) _5)中至少一種:I)提高iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量；2)提高胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量；3)提高三胚層標(biāo)志物 的相對表達(dá)量；4)提高細(xì)胞成瘤能力；5)提高腎臟組織前體標(biāo)志物相對表達(dá)量。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將具有分化功能的HEK293細(xì)胞通過低貼附表面的培養(yǎng)方法，人胚胎腎上皮細(xì)胞系HEK293以三維立體球狀生長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三維球狀培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞發(fā)生了去分化，獲得了胚胎干細(xì)胞和腎臟前體細(xì)胞的特性。


圖1為細(xì)胞在二維貼壁培養(yǎng)皿和在低貼附培養(yǎng)皿上培養(yǎng)結(jié)果圖2為細(xì)胞在二維培養(yǎng)和低貼附培養(yǎng)后iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量圖3為細(xì)胞在二維培養(yǎng)和低貼附培養(yǎng)后內(nèi)胚層標(biāo)志物、中胚層標(biāo)志物和外胚層標(biāo)志物的相對表達(dá)量圖4為細(xì)胞在二維培養(yǎng)和低貼附培養(yǎng)后致瘤能力圖5為細(xì)胞在二維培養(yǎng)和低貼附培養(yǎng)后腎組織前體細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、誘導(dǎo)成熟細(xì)胞發(fā)生去分化形成具有干細(xì)胞功能細(xì)胞一、誘導(dǎo)成熟細(xì)胞發(fā)生去分化形成具有干細(xì)胞功能細(xì)胞方法1、低貼附培養(yǎng)皿的制備配制2 X DMEM基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基:將13.4g高糖培養(yǎng)基粉末(Gibco)和3.7g碳酸氫鈉用500ml去離子水溶解，0.22 μ濾膜過濾除菌，得到2XDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。上述高糖培養(yǎng)基粉末購自Gibco。2XDMEM基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基也可以按照如下配置:用水將下述物質(zhì)溶解成如下濃度，并補(bǔ)足體積為IL:無水氯化鈣(2Η20) 265.00mg/L、L-絲氨酸42.00mg/L、硝酸鐵(9H20)
0.10mg/L、L-蘇氨酸 95.00mg/L、氯化鉀 400.00mg/L、20L_ 色氨酸 16.00mg/L、無水硫酸鎂 97.67mg/L、L-酪氨酸 72.00mg/L、氯化鈉 6400.00mg/L、L-纈氨酸 94.00mg/L、無水磷酸二氫鈉 109.00mg/L、D-泛酸韓 4.00mg/L、丁二酸 75.00mg/L、酒石酸膽堿 7.20mg/L、丁二酸鈉 100.00mg/L、葉酸 4.00mg/L、L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L、肌醇 7.20mg/L、L-鹽酸胱氨酸63.00mg/L、煙酰胺4.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、核黃素0.40mg/L、L-鹽酸組氨酸42.00mg/L、鹽酸硫胺4.00mg/L、L_異亮氨酸105.00mg/L、鹽酸吡哆辛4.00mg/L、L_亮氨酸105.00mg/L、葡萄糖 1000.00mg/L、L_ 鹽酸賴氨酸 146.00mg/L、丙酮酸鈉 110.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、酹紅9.30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L和碳酸氫鈉7.4g/L。低貼附培養(yǎng)基皿的制備:將2XDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)熱至37° C，然后配制1%瓊脂糖溶液。將等體積的2 X DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和1%瓊脂糖溶液混勻，倒入60mm petridish, 5ml/dish。隨著溫度下降，2 XDMEM基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基和1%瓊脂糖溶液混合物會凝成膠狀，附著在培養(yǎng)皿底部，形成低貼附的表面，得到裝有低貼附固體培養(yǎng)基的低貼附培養(yǎng)基皿。二維貼壁培養(yǎng)皿的制備:將含有10% (質(zhì)量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)預(yù)熱至37° C，然后配制1%瓊脂糖溶液。將等體積的含有10% (質(zhì)量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)和1%瓊脂糖溶液混勻，倒入60mm petri dish, 5ml/dish。隨著溫度下降，含有10% (質(zhì)量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)和1%瓊脂糖溶液混合物會凝成膠狀，附著在培養(yǎng)皿底部，形成二維貼壁培養(yǎng)皿。

2、誘導(dǎo)成熟細(xì)胞發(fā)生去分化形成具有干細(xì)胞功能細(xì)胞成熟細(xì)胞為HEK293細(xì)胞，購自北京協(xié)和細(xì)胞中心，HEK293細(xì)胞源自人胚胎腎上皮，認(rèn)為是終端分化的細(xì)胞，不具有干細(xì)胞的分化能力。將誘導(dǎo)成熟細(xì)胞發(fā)生去分化形成具有干細(xì)胞功能細(xì)胞采用成球培養(yǎng)，并以常規(guī)的單層細(xì)胞培養(yǎng)為對照。成球培養(yǎng)組:采用如下的低貼附的培養(yǎng):將HEK293細(xì)胞按照每6 X IO6個細(xì)胞接種到低貼附培養(yǎng)皿上，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞每隔一天使用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行1:3傳代；培養(yǎng)5天后，得到三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞。單層培養(yǎng)組:將HEK293細(xì)胞按照每6X IO6個細(xì)胞接種到二維貼壁培養(yǎng)皿上，370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞每隔一天使用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行I:3傳代；培養(yǎng)5天后，得到二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。上述去成球培養(yǎng)組和單層培養(yǎng)組培養(yǎng)5天后，電子顯微鏡觀察(標(biāo)尺為200 μ m)細(xì)胞生長狀態(tài)，結(jié)果如圖1所示，圖1A為細(xì)胞在二維貼壁培養(yǎng)皿上培養(yǎng)結(jié)果(去分化組)，圖1B為細(xì)胞在低貼附培養(yǎng)皿上培養(yǎng)結(jié)果(常規(guī)培養(yǎng)對照組)，圖1A中可以看出，細(xì)胞在二維貼壁培養(yǎng)皿上成單層上皮樣生長；圖1B可以看出，在低貼附的培養(yǎng)下形成三維球狀結(jié)構(gòu)。

二、檢測三維球狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞為具有干細(xì)胞功能細(xì)胞
1、iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的定量PCR檢測iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞重編程的過程中發(fā)揮重要的作用，許多成體干細(xì)胞也有不同程度的這些因子的表達(dá)，因此這些轉(zhuǎn)錄因子在一定程度上可以反應(yīng)細(xì)胞干細(xì)胞特性。使用Trizol(Invitrogen)分別提取單層培養(yǎng)組(二維培養(yǎng))得到的二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和成球培養(yǎng)組(三維球狀培養(yǎng))得到的三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞的mRNA，殘余的 DNA 使用 DnaseI (Invitrogen)消化，米用 SuperScript III First-Strand SynthesisSystem 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Invitrogen),得到 cDNA。以上述各組cDNA 為模板，采用 Power SYBR Green RT-PCR Kit (AppliedBiosystems)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4和LIN28的相對表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄因子0CT4的熒光定量PCR引物為:上游CCCCTGGTGCCGTGAAG下游GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG轉(zhuǎn)錄因子NANOG的熒光定量PCR引物為: 上游CCAAAGGCAAACAACCCACTT下游CGGGACCTTGTCTTCCTTTTT轉(zhuǎn)錄因子S0X2的熒光定量PCR引物為:上游CCCCTTTATTTTCCGTAGTTGTATTT下游GATTCTCGGCAGACTGATTCAA轉(zhuǎn)錄因子KLF4的熒光定量PCR引物為:上游CATCTTGTGAGTGGATAATCAGGAA下游GACCCCATCTGTTCTTTGATTTTT轉(zhuǎn)錄因子LIN28的熒光定量PCR引物為:上游AGCCCAAGAAGTGCCACTTCT下游GGGCCTTCAGCGGACAT內(nèi)參基因?yàn)镚APDH的熒光定量PCR引物為上游ATGGAAATCCCATCACCATCTT下游CGCCCCACTTGATTTTGG結(jié)果如圖2A(以二維組相對表達(dá)量為I ;相對表達(dá)量為相對于內(nèi)參的表達(dá)量；其他基因的倍數(shù)為相對于二維組相對表達(dá)量的倍數(shù))所示，與二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞相比，三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞中的iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子0CT4、NANOG, S0X2、KLF4和LIN28的相對表達(dá)量顯著上調(diào)了，說明該細(xì)胞具有了一定干細(xì)胞特性。以上述各組cDNA 為模板，采用 Power SYBR Green RT-PCR Kit (AppliedBiosystems)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物REXl、TDGFl、LEFTB, EBAF,GRB7、PODXL和FGF4的相對表達(dá)量。胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物REXl的熒光定量PCR引物為:上游TCCAAGACTACCACCACCATCAT下游TTCTTTAAACTCTGTAAGGATGGACTGT
胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物TDGFl的熒光定量PCR引物為:上游ACGATGTGCGCAAAGAGAACT下游TGGGCAGCCAGGTGTCA胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)EFTB的熒光定量PCR引物為:上游GAGCTGGCGATGACTGAACTG下游GCAAATTCAGGGCTCACTAGAGA胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物EBAF的熒光定量PCR引物為:上游CATTTTCAGCTGGGAGTTTCTGT下游GGGTATTATTGTTCCAGACTCAGTGA胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物GRB7的熒光定量PCR引物為:上游TCTACGGGATGCCCACTGA下游GGCCATTTCGAAGCTTGTTG胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物PODXL的熒光定量PCR引物為:上游CTTTTATGGGCTCGGCAGTTA下游TCACCATGCCCACTGCTTAG胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物FGF4的熒光定量PCR引物為:上游AGTACCCCGGCATGTTCATC下游CGGTTCCCCTTCTTGGTCTT內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，序列同上。結(jié)果如圖2B所示(以二維組相對表達(dá)量為I ;相對表達(dá)量為相對于內(nèi)參的表達(dá)量；其他基因的倍數(shù)為相對于二維組相對表達(dá)量的倍數(shù))，與二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞相比，三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞中的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF, GRB7、PODXL和FGF4有顯著上調(diào)。從上述可以看出，HEK293細(xì)胞在三維成球條件下發(fā)生了細(xì)胞重編程并獲得了類似胚胎干細(xì)胞的特性。2、三胚層標(biāo)志物的定量PCR檢測胚胎干細(xì)胞的一個重要特性是可以發(fā)育為三個胚層各個譜系的細(xì)胞。鑒于HEK293在三維培養(yǎng)條件下獲得了類似胚胎干細(xì)胞的特性，檢測其是否也具有向三個胚層發(fā)育的能力和趨勢。提取二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞(單層培養(yǎng)HEK293細(xì)胞)和三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞(成球培養(yǎng)HEK293細(xì)胞)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。分別以上述cDNA為模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit (Appl ied Biosystems)進(jìn)行突光定量 PCR 反應(yīng),檢測內(nèi)胚層標(biāo)志物FoxA2、Afp、Soxl7和Pdx_l、中胚層標(biāo)志物Brachyury和Msxl、外胚層標(biāo)志物Nestin, 0tx2和Tp63的相對表達(dá)量。內(nèi)胚層標(biāo)志物FoxA2的熒光定量PCR引物為上游CTGAAGCCG GAACACCACTAC下游CGAGGACATGAGGTTGTTGATG內(nèi)胚層標(biāo)志物Afp的熒光定量PCR引物為上游CCAACAGGAGGCCATGCTT
下游GAGAATGCAGGAGGGACATATGT內(nèi)胚層標(biāo)志物Soxl7的熒光定量PCR引物為上游TGGCGCAGCAGAATCCA下游CGACTTGCCCAGCATCTTG內(nèi)胚層標(biāo)志物Pdx-1的熒光定量PCR引物為上游TGCCTTTCCCATGGATGAA下游TGCCCACTGGCCTTTCC中胚層標(biāo)志物Brachyury的熒光定量PCR引物為

上游GCTGTGGCTGCGCTTCA下游TCCTCCTGCCGTTCTTGGT中胚層標(biāo)志物Msxl的熒光定量PCR引物為上游CTCGCTCAGCCTCACTGAGA下游GGCGGCCATCTTCAGCTT外胚層標(biāo)志物Nestin的熒光定量PCR引物為上游AGCCCTGACCACTCCAGTTTAG下游CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTCT外胚層標(biāo)志物0tx2的熒光定量PCR引物為上游TCGGGCGCAGCTAGATGT下游TGTCTGGGTACCGGGTCTTG外胚層標(biāo)志物Tp63的熒光定量PCR引物為上游TTTCCCACCCCGAGATGA下游TGCGGCGAGCATCCAT內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，引物序列同上。結(jié)果如圖3所示(以二維組相對表達(dá)量為I ;相對表達(dá)量為相對于內(nèi)參的表達(dá)量；其他基因的倍數(shù)為相對于二維組相對表達(dá)量的倍數(shù))，與二維貼壁培養(yǎng)ΗΕΚ293細(xì)胞相比，三維球狀結(jié)構(gòu)ΗΕΚ293細(xì)胞中的顯示早期胚胎發(fā)育過程中內(nèi)胚層標(biāo)志物FoxA2、Afp、Soxl7和Pdx-1、中胚層標(biāo)志物Brachyury和Msxl、外胚層標(biāo)志物Nestin、0tx2和Tp63均有顯著上調(diào)。3、裸鼠成瘤能力的檢測胚胎干細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)可以形成畸胎瘤。檢測了三維球狀結(jié)構(gòu)ΗΕΚ293細(xì)胞(成球培養(yǎng)ΗΕΚ293細(xì)胞)的裸鼠成瘤能力，以二維貼壁培養(yǎng)ΗΕΚ293細(xì)胞(單層培養(yǎng)ΗΕΚ293細(xì)胞)為對照。具體實(shí)驗(yàn)如下:實(shí)驗(yàn)選用了 Balb/c裸鼠(購自維通利華，品系名稱401)，實(shí)驗(yàn)分三組:1、二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞；2、三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞；3、三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后的單細(xì)胞。每只老鼠的注射量均為5X IO5個細(xì)胞，每個實(shí)驗(yàn)組的樣本容量均為7只老鼠。注射后8周成瘤。結(jié)果如圖4所示，二維貼壁培養(yǎng)HEK293細(xì)胞沒有致瘤能力(圖4A);三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞成功誘導(dǎo)3只裸鼠成瘤(圖4B);消化為單個細(xì)胞的三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)I只裸鼠形成腫瘤。統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表I所示，可見三維球狀結(jié)構(gòu)HEK293細(xì)胞具備了裸鼠成瘤能力，說明成球培養(yǎng)可以促進(jìn)HEK293細(xì)胞形成具有干細(xì)胞功能的細(xì)胞。表I為形成腫瘤小鼠數(shù)目占實(shí)驗(yàn)組數(shù)目的比例
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法，包括如下步驟:將成熟細(xì)胞在哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到球狀細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化； 所述哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基為將哺乳動物細(xì)胞液體培養(yǎng)基與凝固劑混合，得到固體培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述凝固劑為瓊脂糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)為將所述成熟細(xì)胞接種到裝有所述固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上進(jìn)行培養(yǎng)； 所述培養(yǎng)的條件具體如下:在37°C、5%C02培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的時間為5-10天；所述培養(yǎng)容器為培養(yǎng)皿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述成熟細(xì)胞與所述哺乳動物細(xì)胞固體培養(yǎng)基的配比為106-6X 106個/5ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述球狀細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞全能性；所述胚胎干細(xì)胞全能性具體體現(xiàn)在如下I)_5)中至少一種: 1)提高iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量； 2)提聞胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量； 3)提高三胚層標(biāo)志物的相對表達(dá)量； 4)提聞細(xì)胞成瘤能力； 5)提高腎臟組織前體標(biāo)志物相對表達(dá)量。
7.按權(quán)利要求1-6中任一所述方法得到的球狀細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的球狀細(xì)胞，其特征在于:所述球狀細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞全能性；所述胚胎干細(xì)胞全能性具體體現(xiàn)在如下I)_5)中至少一種: 1)提高iPS重編程轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量； 2)提聞胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的相對表達(dá)量； 3)提高三胚層標(biāo)志物的相對表達(dá)量； 4)提聞細(xì)胞成瘤能力； 5)提高腎臟組織前體標(biāo)志物相對表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的方法，包括如下步驟將成熟細(xì)胞在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到球狀細(xì)胞，所述球狀細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞全能性；所述固體培養(yǎng)基為將2×DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基與凝固劑混合，得到固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將具有分化功能的HEK293細(xì)胞通過低貼附表面的培養(yǎng)方法，人胚胎腎上皮細(xì)胞系HEK293以三維立體球狀生長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三維球狀培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞發(fā)生了去分化，獲得了胚胎干細(xì)胞和腎臟前體細(xì)胞的特性。
文檔編號C12N5/0735GK103087981SQ20131001748
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者蘇冠男, 趙燕南, 魏建樹, 陳冰, 肖志峰, 戴建武 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所