一種純化制備赭曲霉毒素a和赭曲霉毒素b的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。該方法包括產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制備、毒素的提取濃縮、分離及重結(jié)晶等步驟。此工藝簡單有效，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。同時制備得到的赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B純度達到98％以上，可將其作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)應(yīng)用于糧食及食品中赭曲霉毒素的安全監(jiān)控及相關(guān)科學(xué)研究。
【專利說明】一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從人工接種的培養(yǎng)基中提取、分離純化真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的方法，屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株所產(chǎn)生的一類具有致癌、致畸、免疫抑制和肝腎毒性的有毒代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素主要包括赭曲霉毒素A(OTA)及甲酯化合物、赭曲霉毒素B(OTB)、赭曲霉毒素C(OTC)和赭曲霉毒素D(OTD)。其中，OTA和OTB是自然界中污染水平最為嚴(yán)重的兩種赭曲霉毒素，可廣泛存在于糧食、大豆、花生、飼料、咖啡、白酒、葡萄及葡萄酒、動物腎臟及牛奶等不同農(nóng)產(chǎn)品中。
[0003]研究表明，OTA主要對腎臟產(chǎn)生危害，可造成腎腫大。它也可破壞免疫系統(tǒng)，引起肝臟的急性功能性障礙、脂肪變性和腸炎等。人和動物長期攝入被OTA污染的食物或飼料可引起致癌、致畸、致突變等作用。因此，在1993年國際癌癥中心已經(jīng)將OTA列為可能的致癌物(2B類)。另外，在歐洲巴爾干地區(qū)，它被懷疑與地方流行性腎病有關(guān)。OTB是OTA的非氯同系物。在自然界中它的生物量約為OTA的1/5。OTB具有較小的毒性。但是在體外試驗表明它和OTA具有相同的細(xì)胞毒性。
[0004]鑒于赭曲霉毒素在食品中的廣泛污染及毒性,世界各國對赭曲霉毒素已經(jīng)建立了不同的限量標(biāo)準(zhǔn)及法律法規(guī)。歐盟頒布的《食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)(EC)N0.466/2001》規(guī)定谷物中的最大限量為5 μ g/kg,谷物制品中為3 μ g/kg,葡萄干中為10 μ g/kg ;我國于2011頒布了新修訂的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)即標(biāo)準(zhǔn)《GB 2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了谷物及谷物制品(玉米、大麥、小麥、玉米面、小麥粉、麥片)、豆類及其制品(干豆及以干豆磨成的粉)中OTA最大限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μ g/kg。目前國際上還沒有制定OTB的限量標(biāo)準(zhǔn)。
[0005]食品安全監(jiān)控及赭曲霉毒素毒理學(xué)的研究仍然需要大量的純品。目前國內(nèi)使用的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為美國、奧地利、新加坡等國外進口產(chǎn)品，價格昂貴OTA約為800元Mg, OTB價格約為3200元/mL(10 μ g/mL)。鑒于此，如果單純依靠購買國外標(biāo)準(zhǔn)物來進行國內(nèi)食品安全監(jiān)控及科學(xué)研究，可造成巨大的花費且易受到國外的條件限制。經(jīng)檢索我國至今尚未有赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方面的報道。因此，迫切需要開發(fā)赭曲霉毒素純化制備方法來填補國內(nèi)空白，從而促進相關(guān)領(lǐng)域的監(jiān)控及研究。
[0006]目前赭曲霉毒素的純化制備方法主要包括兩大類:化學(xué)合成法及天然提取法。(I)Sibi等通過結(jié)合O-芳香基氨基甲酸酯和苯甲酰胺介導(dǎo)的金屬化反應(yīng)合成出了 OTA及0ΤΒ。此制備方法需要多步的合成及純化，整個過程OTA產(chǎn)率約為14%，0TB產(chǎn)率約為6%。此制備工藝的低產(chǎn)率極大地限制了其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)；(2)從人工接種的培養(yǎng)基中提取純化目標(biāo)化合物是另一種制備真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法。目前從不同培養(yǎng)基中提取純化OTA的方法已經(jīng)有報道。Davis等通過人工接種曲霉菌孢子液至液體培養(yǎng)基中，然后通過反復(fù)的萃取及重結(jié)晶最終獲得OTA。Bunge等將侵染曲霉菌的谷物接種至小麥培養(yǎng)基中，然后經(jīng)過提取、萃取及多步柱色譜凈化，最后重結(jié)晶獲得目標(biāo)毒素。另外，Peterson等從人工接種的小麥培養(yǎng)基中提取0TA，經(jīng)過反復(fù)萃取，然后通過制備液相及重結(jié)晶獲得0TA。大多數(shù)的這些方法樣品前處理需要經(jīng)過復(fù)雜萃取及多步柱層析，生產(chǎn)周期長且消耗大量的有機溶劑，同時獲得的產(chǎn)物純度不高。最重要的是這些方法僅能夠純化制備0TA，不能夠同時制備OTA和OTB兩種毒素。
[0007]隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的色譜柱具有更加優(yōu)異的分離效率及柱效，可以在較短時間內(nèi)從復(fù)雜基質(zhì)中分離純化目標(biāo)化合物。本發(fā)明利用此技術(shù)開發(fā)出一種可同時純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。該方法操作簡單、生產(chǎn)成本低，可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。制備得到的OTA和OTB純度高，可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用于食品安全監(jiān)控及毒理學(xué)實驗。
[0009]本發(fā)明提供的一種制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，具體包括如下步驟:
[0010](I)孢子液的制備曲霉菌或青霉菌的菌株接種在馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上黑暗條件下28°C培養(yǎng)3d。將5mL滅菌水加入至PDA，使用滅菌后的接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面孢子。然后再用滅菌水反復(fù)沖洗PDA，合并洗液且在-20°C條件下保存。
[0011](2)產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制備稱取適量小麥于錐形瓶中，加入適量去離子水浸泡lh，然后高溫高壓滅菌。待冷卻至室溫后，將步驟(1)所制備的孢子液接種至培養(yǎng)基。在28°C條件下避光培養(yǎng)30d。
[0012](3)毒素的提取培養(yǎng)結(jié)束后小麥培養(yǎng)基在50°C干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎機粉碎。稱取適量粉碎后的樣品置于錐形瓶中加入80%甲醇/水超聲提取，提取液于4°C條件下放置12h以沉淀顆粒性物質(zhì)。雙層紗布過濾后在40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，然后使用酸化的二氯甲烷進行萃取，萃取液40°C條件下濃縮至干，得到固體殘渣。用30%乙腈/水溶液復(fù)溶后，正己烷進行脫脂處理，過0.22 μ m尼龍濾膜待進樣。
[0013](4)制備液相分離純化流動相為甲醇(A)和水(B);流速為3.5mL/min ;色譜柱為Pursuit XRs C18柱(250_X 10mm, 10 μ m);檢測波長為337nm ;進樣體積為3mL ;線性梯度洗脫程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持續(xù)3min,總運行時間為25min ;含OTA的餾分收集時間為17.7min至20.6min，含OTB的餾分收集時間為11.1至13.7min。各自餾分液50°C條件下旋蒸后在真空冷凍干燥機下干燥，獲得淡黃色固體粉末。
[0014](5)將(4)獲得的固體殘留物用加熱后的苯溶解(溫度不高于40°C)，置于4°C冰箱中有固體結(jié)晶狀物體出現(xiàn)，去除母液后，使用4°C苯?jīng)_洗兩次獲得白色的固體物質(zhì)。
[0015](6)將制備得到的OTA及OTB通過超高壓液相色譜進行純度分析，確定:0ΤΑ純度為 98.25 %，OTB 純度為 98.43 %。
[0016](7)通過液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在正離子模式下全掃描分析(m/z200~600)得到OTA為[M+H]+ = 404.04，OTB為[M+H]+ = 370.07，確定其分子量分別為403和369。質(zhì)譜全掃圖與sigma公司相應(yīng)的參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較幾乎完全一致，間接證明得到的化合物具有高純度；化合物的結(jié)構(gòu)通過產(chǎn)物離子掃描來確證。OTA和OTB產(chǎn)生的產(chǎn)物離子與先前文獻中的報道完全一致，確證了獲得的化合物為OTA和0ΤΒ。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下有益的技術(shù)效果:
(1)此技術(shù)可以同時制備OTA和OTB兩種赭曲霉毒素，通過檢索發(fā)現(xiàn)這是首次報道。此方法可以極大的提高生產(chǎn)效率和節(jié)約生產(chǎn)成本。
(2)優(yōu)化產(chǎn)毒培養(yǎng)基此方法通過比較優(yōu)化不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間下OTA和OTB的產(chǎn)量，最終確定小麥為曲霉菌或青霉菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基質(zhì)，可以獲得高量的赭曲霉毒素。
(3)優(yōu)化樣品凈化過程為了獲得高純度的OTA和OTB及減少有機溶劑的使用量，不同的萃取溶劑及萃取條件進行比較和優(yōu)化，最終選擇酸化的二氯甲烷做為最佳萃取溶劑。此萃取溶劑減少了萃取過程中有機溶劑的使用量。
(4)通過制備液相的分離純化最終從10g小麥培養(yǎng)基中得到69mgOTA和6mg OTBjife度均達到98%以上，優(yōu)于先前文獻中報道的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明
[0019]圖1為赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B純化制備流程圖。
[0020]圖2 (a)為赭曲霉毒素粗提液的制備液相圖譜；(b)為上樣體積為5mL時收集懼分液的超高壓液相色譜圖；(C)為上樣體積為3mL時收集餾分液的超高壓液相色譜圖。
[0021]圖3為超高壓液相色譜圖(a)萃取前粗提液；(b)萃取后粗提液；(c) OTA和OTB標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(d)純化后OTA ； (e)純化后OTB。
[0022]圖4為質(zhì)譜圖(a)OTA全掃描圖譜；(b)OTB全掃描圖譜；(c)OTA產(chǎn)物離子掃描圖譜；(d)OTB產(chǎn)物離子掃描圖譜。

【具體實施方式】
[0023]下面給出的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，特別需要指出的是所有類似的替換或更改，均被視為包括在本發(fā)明。
[0024]實施例1:
(1)曲霉菌接種至PDA培養(yǎng)基，在28°C條件下培養(yǎng)3d后加入5mL滅菌水，用滅菌后的接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面的孢子。用滅菌水反復(fù)沖洗，合并洗液。通過血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至1.0X 15個/mL，-20°C條件下保存。
(2)稱取75g小麥于500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121°C下高溫滅菌30min。冷卻至室溫后，孢子液接種至滅菌的小麥培養(yǎng)基，在28°C條件下培養(yǎng)30d。培養(yǎng)結(jié)束后，小麥培養(yǎng)基在50°C干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎機粉碎成均勻的粉末。
(3)稱取10g干燥粉末置于錐形瓶中加入400mL不同提取溶劑(80/20乙腈/水，79/20/1乙腈/水/乙酸，80/20甲醇/水，79/20/1甲醇/水/乙酸，乙酸乙酯，甲苯、含I %碳酸氫鈉水溶液)進行超聲提取。提取液于4°C條件下放置12h以沉淀顆粒性物質(zhì)，定性濾紙過濾。在40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液減少約4/5后，用含1%乙酸的二氯甲烷萃取，然后40°C下濃縮至干，得到黃色固體物質(zhì)。
(4)固體物質(zhì)用30%乙腈/水溶液復(fù)溶后，正己烷進行脫脂處理，過0.22 μ m尼龍濾膜后通過制備液相進行分離純化。流動相為甲醇㈧和水⑶；流速為3.5mL/min ;色譜柱為Pursuit XRs C18柱(250_X 1mm, 10 μ m);檢測波長為337nm ;進樣體積為3mL ;線性梯度洗脫程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持續(xù)3min，總運行時間為25min ;含OTA的餾分收集時間為17.7-20.6min，含OTB的餾分收集時間為11.1-13.7min。餾分液在50°C條件下旋蒸后于真空冷凍干燥機下干燥，獲得淡黃色固體粉末。
(5)淡黃色的固體粉末用加熱后的苯溶解(溫度不高于40°C )，置于4°C冰箱中有固體結(jié)晶狀物體出現(xiàn)，去除母液后，使用4°C苯?jīng)_洗兩次獲得白色的固體物質(zhì)。
[0025]實施例2:
曲霉菌孢子液制備同實施例1。稱取75g燕麥于500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30min ;其余步驟同實施例1。
[0026]實施例3:
曲霉菌孢子液制備同實施例1。稱取75g玉米于500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30min ;其余步驟同實施例1。
[0027]實施例4:
曲霉菌孢子液制備同實施例1。稱取75g大米于500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30 min ;其余步驟同實施例1。
【權(quán)利要求】
1.一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征在于: 該方法包括如下步驟: (1)將曲霉菌、青霉菌或其孢子液接種至滅菌后的培養(yǎng)基進行產(chǎn)毒培養(yǎng)； (2)培養(yǎng)基經(jīng)過提取、過濾及濃縮后使用有機溶劑進行萃取； (3)萃取后的溶液通過制備液相進行分離，分別收集餾分液蒸干復(fù)溶后重結(jié)晶獲得目標(biāo)毒素； (4)獲得的毒素通過超高壓液相色譜及液相串聯(lián)質(zhì)譜等進行純度分析、結(jié)構(gòu)確證。
2.如權(quán)利要求1所述一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征在于所述步驟(1)中的曲霉囷、青霉囷或其抱子液為可廣生赫曲霉毒素A和赫曲霉毒素B的囷株。
3.如權(quán)利要求1所述一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征在于所述步驟(1)中的培養(yǎng)基為:包括小麥、燕麥、蕎麥、大米、玉米及高梁等糧食類，及有利于步驟(1)中菌株生長產(chǎn)毒的培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征性為:步驟(2)中提取所用溶劑為甲醇、乙腈及其不同比例水溶液。萃取溶劑為可以從水溶液中萃取赭曲霉毒素的有機試劑，如二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯及乙酸乙酯等。
5.如權(quán)利要求1所述一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征性為:步驟(3)中制備液相色譜柱為:反相色譜柱，例如C8、C18柱等。
6.如權(quán)利要求1所述一種純化制備赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征性為:步驟(3)中重結(jié)晶中所用的溶劑為加熱后的苯，同時加熱溫度不能超過40°C。
【文檔編號】C12P17/06GK104178535SQ201410155926
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】武愛波, 趙志勇, 宋素泉, 王建華, 劉娜, 聶冬霞, 楊憲立, 林善海 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？屏⑻剞r(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)服務(wù)有限公司