一種檢測(cè)赭曲霉毒素a的熒光免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)OTA的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材料、NaYF4:Yb,Tm納米顆?；騈aGd(WO4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的OTA單克隆抗體或者多克隆抗體。本發(fā)明的試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性高、安全性好、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，在便攜式熒光讀數(shù)儀下可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)，能滿足不同層次人員的需要。
【專利說明】
一種檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層 析試紙。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素是繼黃吐霉毒素后又一個(gè)引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。它是由曲霉 屬的7種曲霉和青霉屬的6種青霉菌產(chǎn)生的一組重要的、污染食品的真菌毒素，其包含7個(gè)結(jié) 構(gòu)類似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染最重，與人類健康 關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素 A(0chrat〇Xin Α,ΟΤΑΚΟΤΑ主要毒害動(dòng)物的腎臟和肝臟，腎臟 是第一靶器官，具有較強(qiáng)的致畸、致癌、致突變作用。我國GB2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中 規(guī)定，豆類及及其制品、谷物類及其碾壓制品中0ΤΑ限量標(biāo)準(zhǔn)為5yg/kg;2012年7月5日，歐盟 委員會(huì)發(fā)布(EU)N〇594/2012號(hào)法規(guī)，修訂(EC)1881/2006號(hào)法規(guī)，赭曲霉毒素 A在谷物產(chǎn)品 中的最大殘留限量為3. Oyg/kg;在胡椒中的最大殘留限量為15yg/kg;在辣椒中的最大殘留 限量自2015年1月1日起調(diào)整為15yg/kg(在此之前沿用30yg/kg的標(biāo)準(zhǔn)）；在小麥蛋白中的最 大殘留限量為8. Oyg/kg。
[0003] 目前常用的OTA殘留檢測(cè)方法是:微生物法、色譜法和免疫分析法。微生物法簡(jiǎn)單、 經(jīng)濟(jì)，但敏感度不高:色譜法是定性和定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有較高的精確性、準(zhǔn)確性和 敏感性，但其流程煩瑣，設(shè)備昂貴，需要專業(yè)技術(shù)人員，檢測(cè)速度慢;免疫法操作簡(jiǎn)單，成本 低，而且有較好的準(zhǔn)確性和靈敏性，亦能進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，適合于對(duì)大量樣品的篩查。 免疫試紙法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測(cè)物的初步信息，該法靈敏度高，分 析過程簡(jiǎn)單，用作篩查有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)。
[0004] 未修飾的氧化石墨烯表現(xiàn)出很弱的熒光，在紫外光照射下用肉眼基本上觀察不到 熒光。這是由于氧化石墨烯納米片表面有很多含氧基團(tuán)，例如納米片表面上的環(huán)氧鍵和羥 基，納米片側(cè)面的羧基，這些基團(tuán)通常能誘導(dǎo)電子-空穴對(duì)的非輻射復(fù)合，從而導(dǎo)致氧化石 墨烯的熒光很弱。經(jīng)過正丁胺修飾以后，氧化石墨烯納米片表面的環(huán)氧鍵和羧基都被反應(yīng) 掉，這將極大地降低其非輻射復(fù)合能力。因此修飾后，氧化石墨烯表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光可作為 新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。雖然膠體金試紙?jiān)诖朔矫鎽?yīng)用較廣，但其不能做到定量 檢測(cè)，作為更敏感、穩(wěn)定、靈活、安全的氧化石墨烯熒光層析試紙的研究，是膠體金免疫檢測(cè) 技術(shù)的有力補(bǔ)充。
[0005] 上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒經(jīng)過表面修飾與活化后，作為新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)等領(lǐng)域 進(jìn)行應(yīng)用。因其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，使上轉(zhuǎn)換熒光免疫試紙法與理化檢測(cè)與微生 物檢測(cè)技術(shù)相比，具有靈敏度高，操作過程簡(jiǎn)單，成本低及能進(jìn)行大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的特點(diǎn)； 與膠體金試紙相比，具備定量檢測(cè)的特色，作為更敏感、穩(wěn)定、靈活、安全的UPT-LF的研究， 是膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的有力補(bǔ)充。但是目前上轉(zhuǎn)換熒光材料的制備和試紙的研究仍存在 發(fā)光效率不夠，熒光材料種類少等缺陷，丞待加強(qiáng)該方面的研究和探討。
[0006] 下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒具有高靈敏度，是一種完全惰性的無機(jī)發(fā)光材料，具有獨(dú)特 物理結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，可作為新型標(biāo)記物應(yīng)用在生物檢測(cè)領(lǐng)域。將其與生物學(xué)、免疫學(xué)、材 料學(xué)相結(jié)合而開發(fā)的用于OTA快速檢測(cè)的下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記免疫層析方法，在靈敏、 穩(wěn)定、靈活方面顯示了優(yōu)異的特性，是膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的有利補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙， 該試紙具有特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，能定量檢測(cè)食品、飼料、中草藥中的赭曲霉毒素 A〇
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] -種檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸 附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料 層，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)0ΤΑ的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡和用羊抗小 鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡;所述的熒光抗體纖維層采 用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材料、NaYF4: Yb，Tm納 米顆?；蛩?(1(￥〇4)2 4113+納米顆粒標(biāo)記的014單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0010] 所述的支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層和設(shè)置在吸附層頂面的面層。
[0011] 所述的支撐體包括透明的中空管體，吸附層填充在中空管體內(nèi)部，吸附層從測(cè)試 端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。
[0012]所述的中空管體的上端裝有連接頭，連接頭上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的輔 助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊，氣囊 的出氣口依次經(jīng)連接套上部的進(jìn)氣通道、連接頭的內(nèi)腔與中空管體的上口部相連通，進(jìn)氣 通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無法向內(nèi)吸氣的單向出氣裝置。
[0013] 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔，換氣腔內(nèi) 設(shè)置有圓球形的密封球，換氣腔的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一出氣口，第一出氣口 經(jīng)出氣通道與進(jìn)氣通道相連通，換氣腔側(cè)面設(shè)置有與外界大氣相連通的第二出氣口，構(gòu)成 只能向外排氣、無法向進(jìn)氣通道吸氣的單向出氣結(jié)構(gòu)。
[0014] 所述的第一出氣口為圓形，其直徑小于密封球的直徑。
[0015]所述的連接頭為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體的上端呈密封連接，連 接頭上部的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)的盲孔，盲孔內(nèi)壁 上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套下部的盲孔 內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈。
[0016] 所述的隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡呈相間設(shè)置在纖維素膜層的表面，間距為5-8mm 〇
[0017] 所述的中空管體的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。
[0018] 所述的氧化石墨稀焚光納米材料是一種以氧化石墨稀為基質(zhì)通過酰氯化反應(yīng)和 烷基胺來修飾后，用銀納米顆粒進(jìn)行表征后得到的熒光納米材料。
[0019] 所述的氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0020] (1)氧化石墨烯熒光材料修飾：
[0021] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下 加熱回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽 真空氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應(yīng)72h，冷卻至室 溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨稀，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應(yīng)的正 丁胺，將剩余的反應(yīng)液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙蒸水中，配制成 濃度為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液；
[0022] (2)表面標(biāo)記0ΤΑ抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0023] (a)將100mg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸 檬酸鈉溶液，80°C加熱回流lh后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的 巰基乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應(yīng)的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸 干，加超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0024] (b)取O.lmM的EDC 10yL和O.lmM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納 米顆粒溶液中，反應(yīng)lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液；
[0025] (C)取0.1 mM的0TA單克隆抗體或多克隆抗體10yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒 溶液中，4 °C反應(yīng)過夜，得到表面標(biāo)記0ΤΑ抗體銀納米顆粒溶液；
[0026] (3)氧化石墨烯熒光納米材料0ΤΑ抗體的標(biāo)記：
[0027]取修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應(yīng)3h，離心，除 去未反應(yīng)的戊二醛，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標(biāo)記0ΤΑ抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)3h，經(jīng)離心，收集氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的 0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 所述他￥?4:丫13，1'111納米顆粒是以似￥?4為基質(zhì)、￥133+為敏化劑，由￥13和1'111共摻雜形成 的直徑為60~80nm的發(fā)藍(lán)色熒光的納米顆粒。
[0029]所述的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括以下步驟：
[0030] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0031] 分別取濃度均為0.5mo 1 /L的 Y (N〇3) 3溶液5.5mL、Yb (N〇3) 3溶液0.5mL和Tm (N〇3) 3溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應(yīng)lh;加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7mL，25 °C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調(diào)節(jié)pH值至7.4，靜置0.5h，加 雙蒸水稀釋至30mL;再在220 °C下反應(yīng)24h，冷卻到室溫，經(jīng)過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發(fā) 藍(lán)色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒；
[0032] (2)熒光納米顆粒的表面硅化：
[0033] 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖液中，配制成濃度 為lmg/mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米 顆粒溶液中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正硅酸四乙酯，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 6000r/min離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為10mg/mL的熒光納米顆粒甲醇溶液；
[0034] (3)熒光納米顆粒的表面氨基化：
[0035] 取3mL焚光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應(yīng)30min，再在70 °C水浴反應(yīng)lh，6000r/min 離心5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復(fù)洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保 存；
[0036] (4)0TA抗體的標(biāo)記：
[0037]用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃 度為10mg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液;取10mL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL 的OTA單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，OTA單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:100,4°C避光反應(yīng)4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下 透析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0038] 所述的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒是以氧化釓(Gd203)、鎢酸鈉(Na 2W〇4 · 2H20)為基 質(zhì)，銪離子(Eu3+)為敏化劑，在條件反應(yīng)下形成100~200nm的納米顆粒。
[0039] 所述的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0040] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0041 ] 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結(jié)晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N〇3)3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu(N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N〇3)3溶液、1 OmL Na2W〇4 溶液和5mL Eu(N03)3溶液，加入到反應(yīng)爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=5，攪拌均勻，封閉 反應(yīng)釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80 °C干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0042] (2)0TA抗體的標(biāo)記
[0043] 將0ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質(zhì)；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用〇.lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2;
[0044] 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態(tài)下，加入0ΤΑ單克隆抗體或多 克隆抗體溶液1〇〇μ1，〇ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/ min離心30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 所述的吸附纖維層由玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
[0046] 所述的吸水材料層由吸水濾紙制成。
[0047] 所述的纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
[0048] 所述的偶聯(lián)0ΤΑ的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
[0049] 所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡還可以為"十十"字型排列印跡、"π"字型排 列印跡、字型排列印跡、"卜卜"字型排列印跡或十'字型排列印跡。
[0050] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與熒光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的面層上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維層 一偵[JO · 3 ~Ο · 7cm。
[0051] 本發(fā)明的試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性高、安全性好、簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果 顯示形象、直觀、適用范圍廣、攜帶方便的特點(diǎn)。在便攜式熒光讀數(shù)儀下可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)定量檢 測(cè)。能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加 工、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者個(gè)人等。本發(fā)明在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要 的意義，將具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【附圖說明】
[0052] 圖1為實(shí)施例4的試紙的主視圖，圖中，2為吸附纖維層，3為熒光抗體纖維層，4為纖 維素膜層，7為吸水材料層，14為面層，15為底層。
[0053] 圖2為實(shí)施例4的試紙的俯視圖，圖中，4為纖維素膜層，5為隱形檢測(cè)印跡，6為隱形 對(duì)照印跡，14為面層，15為底層，16為樣品標(biāo)記線。
[0054]圖3為實(shí)施例5的試紙的主視圖，圖中，1為中空管體，2為吸附纖維層，3為熒光抗體 纖維層，4為纖維素膜層，5為隱形檢測(cè)印跡，6為隱形對(duì)照印跡，7為吸水材料層，8為連接頭， 9為連接頭的內(nèi)腔，10為密封圈，11為單向出氣裝置，12為氣囊，13為連接套。
[0055] 圖4為圖3的A-A向剖視圖，圖中，1為中空管體，4為纖維素膜層，6為隱形對(duì)照印跡。
[0056] 圖5為圖3中的連接頭的主視圖，圖中，1為中空管體，8為連接頭。
[0057]圖6為圖3中的連接頭的俯視圖，圖中，8為連接頭，9為連接頭的內(nèi)腔。
[0058] 圖7為圖3中的連接套的剖視圖，圖中，10為密封圈，12為氣囊，13為連接套，111為 換氣腔，112為第二出氣口，113為密封球，114為第一出氣口，115為出氣通道，131為盲孔， 132為進(jìn)氣通道。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0060] 實(shí)施例1
[0061] 檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙的制備，主要包括:0ΤΑ人工抗原的制備、 0ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體的制備、氧化石墨稀焚光納米材料標(biāo)記0ΤΑ抗體的制備、纖維 素膜層的制備以及免疫層析試紙的組裝等步驟。
[0062] 1、偶聯(lián)0ΤΑ載體蛋白的制備
[0063]采用活潑酯法，將0ΤΑ與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備人工合成抗原。
[0064] 其具體步驟為：準(zhǔn)確稱取1.3mg 0TA、2mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1.2mg N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)先后溶于1. OmL甲醇溶液中，室溫避光攪拌2h，進(jìn)行充分的化學(xué)反應(yīng)，命名 為A液。稱取牛血清白蛋白（BSA) 5mg溶于2mL PBS (0.01M，pH7.4)緩沖液中，命名為B液。在室 溫磁力攪拌下，將A液緩慢滴加入B液中，避光4°C條件下過夜，用PBS透析4天，換液6次/天。 透析完成后，4000r/min離心5min，取上清液，藏于-20 °C，備用。
[0065] 2、抗0ΤΑ抗體的制備
[0066] (1)單克隆抗體的制備
[0067]動(dòng)物免疫：用制備的0ΤΑ載體蛋白偶聯(lián)物以30yg~50yg/只的用量免疫6~8周齡 Balb/C小鼠3~4次，每次免疫間隔時(shí)間3~5周，確定抗體效價(jià)符合要求后進(jìn)行超強(qiáng)免疫，并 在融合之前檢測(cè)其抑制價(jià)。
[0068]細(xì)胞融合:超強(qiáng)免疫后3~4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清;脫頸致死， 用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼 龍紗布過濾，l〇〇〇r/min離心10min，收集脾細(xì)胞。將1 X 108的脾細(xì)胞與NSo骨髓瘤細(xì)胞按10:1 的比例混合，l〇〇〇r/min離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入0.7~ 1 · OmL的50%PEG4000，lmin內(nèi)加完，前30s加0 · 1 ~0 · 3mL，中間 15s加0 · 2~0 · 4mL，最后 15s加 完;然后緩緩加入無血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5~10min，1000r/ min離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（8 ~10塊），100yL~200yL/孔，置于37°C、5%的C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0069]單克隆抗體的篩選:培養(yǎng)10~14天，用間接ELISA法進(jìn)行陽性孔篩選，選擇強(qiáng)陽性、 抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3~6次有限稀釋克隆化(直到細(xì)胞克隆為單克隆，檢測(cè)各 個(gè)克隆孔效價(jià)、抑制價(jià)基本一致），而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞 分泌的單克隆抗體可特異地與0TA反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)到10 1()~1012,輕鏈亞型為κ或λ，重鏈 亞型為]^61、]^623、]^621 )、]^63，針對(duì)(1^特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備氧化石墨 烯熒光納米材料標(biāo)記抗體的玻璃纖維棉。
[0070] (2)多克隆抗體的制備
[0071]用0ΤΑ載體蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200yg~500yg/次，背部皮下 分4~6點(diǎn)注射。首免，用無菌PBS溶解制備的0TA載體蛋白偶聯(lián)物，與等量弗氏完全佐劑 (FCA)混合，充分乳化;加強(qiáng)免疫，用無菌PBS溶解0TA載體蛋白偶聯(lián)物，與等量弗氏不完全佐 劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2~3周進(jìn)行，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔2~3周，最后一次 免疫后10~15天，以ELISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到10 5以上時(shí)，采血并分離收集高免血清。
[0072]以飽和硫酸按鹽析法提取IgG抗體，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混勻，加等 體積飽和硫酸按溶液混勻，置4°C條件下靜止12h后，以2500r/min離心15min，棄上清，加 PBS (pH7 · 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS(pH7 · 2)透析72h，中間換液數(shù)次，12000r/min離心 15min，收集上清，得純化的抗0TA多克隆抗體，-20 °C凍存，用于制備氧化石墨稀焚光納米材 料標(biāo)記抗體的玻璃纖維棉。
[0073] 3、氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的0TA單克隆抗體或者多克隆抗體的制備
[0074] (1)氧化石墨烯熒光材料修飾：
[0075] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲混勻后，加入20mL二 氯亞砜，80°C下加熱回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次 后，干燥;再在抽真空氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應(yīng) 72h，冷卻至室溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨稀，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除 去未反應(yīng)的正丁胺，將剩余的反應(yīng)液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙 蒸水中，配制成濃度為lmg/mL的修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液；
[0076] (2)表面標(biāo)記0TA抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0077] (a)將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸 檬酸鈉溶液，80°C加熱回流lh后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的 巰基乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應(yīng)的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸 干，加超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0078] (b)取 O.lmM 的 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC)lOyL 和 O.lmM 的 NHSlOy L，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液中，反應(yīng)lh，得到羧基活化的銀納米顆粒 溶液；
[0079] (C)取0.1 mM的0TA單克隆抗體或多克隆抗體10yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒 溶液中，4 °C反應(yīng)過夜，得到表面標(biāo)記0ΤΑ抗體銀納米顆粒溶液；
[0080] (3)氧化石墨烯熒光納米材料0ΤΑ抗體的標(biāo)記：
[00811取修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應(yīng)3h，離心，除 去未反應(yīng)的戊二醛，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標(biāo)記0ΤΑ抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)3h，經(jīng)離心，收集氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的 0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存?zhèn)溆谩?br>[0082] 4、熒光抗體纖維層的制備
[0083]將1:100~1:500稀釋的氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的0ΤΑ抗體吸附于精制玻璃 纖維棉中，4°C低溫真空干燥，制備氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記抗體的玻璃纖維棉。
[0084] 5、吸附纖維素膜層的制備：
[0085]纖維素膜層由硝酸纖維素制成，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜層的不同位置分別噴點(diǎn)0ΤΑ 人工抗原檢測(cè)印跡和兔抗鼠 IgG抗體(或羊抗鼠 IgG抗體、羊抗兔IgG抗體)對(duì)照印跡，于37°C 烘干備用。
[0086] 6、免疫層析試紙的組裝
[0087]將吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從測(cè)試端開始依次貼在 帶有粘合劑的底層上，再在覆蓋上面層，并切成3-4cm寬的試紙即可。
[0088] 7、檢測(cè)反應(yīng)原理
[0089] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，在虹吸作用帶動(dòng)下，待測(cè)溶液中0ΤΑ和熒光抗 體纖維層中的熒光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，直至到吸水材料層。
[0090] 在擴(kuò)散過程中，待測(cè)0ΤΑ可與吸附在氧化石墨烯上的0ΤΑ抗體-銀納米顆粒相結(jié)合， 因抗原-抗體作用和靜電吸引作用，導(dǎo)致0ΤΑ抗體-銀納米顆粒從氧化石墨烯上剝離出來，進(jìn) 而釋放氧化石墨烯所散發(fā)的熒光，并和偶聯(lián)0ΤΑ的載體蛋白結(jié)合。而羊抗鼠抗體則能與0ΤΑ 抗原結(jié)合，在350nm紫外線激發(fā)下隱形檢測(cè)印跡線(T線）和隱形對(duì)照印跡線（C線）都會(huì)出現(xiàn) 吸收峰，通過熒光讀條儀讀取T線峰值定量檢測(cè)待測(cè)樣品中0ΤΑ中的含量。反之，樣品中無 0ΤΑ時(shí)，則T線和C線不會(huì)出現(xiàn)紫外吸收峰。
[0091] 實(shí)施例2
[0092] 實(shí)施例2中免疫層析試紙的制備和實(shí)施例1基本相同，主要不同之處在于：熒光抗 體為NaYF4:Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0093]所述的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括以下步驟：
[0094] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0095]分別取濃度均為0.5mo 1 /L的 Y (N〇3) 3溶液5.5mL、Yb (N〇3) 3溶液0.5mL和Tm (N〇3) 3溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應(yīng)lh;加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7mL，25 °C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調(diào)節(jié)pH值至7.4，靜置0.5h，加 雙蒸水稀釋至30mL;再在220 °C下反應(yīng)24h，冷卻到室溫，經(jīng)過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發(fā) 藍(lán)色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒；
[0096] (2)熒光納米顆粒的表面硅化：
[0097] 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖液中，配制成濃度 為lmg/mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米 顆粒溶液中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正硅酸四乙酯，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 6000r/min離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為10mg/mL的熒光納米顆粒甲醇溶液；
[0098] (3)熒光納米顆粒的表面氨基化：
[00"] 取3mL焚光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入3yL的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTSA)，密封后在40°C反應(yīng) 30min，再在70°C水浴反應(yīng)lh，6000r/min離心5min，得到表面氨基化的焚光納米顆粒，用乙 醇反復(fù)洗滌4次，真空干燥后，4 °C密封保存；
[0100] (4)0TA抗體的標(biāo)記：
[0101]用〇.〇lmol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃 度為10mg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液;取10mL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL 的OTA單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，OTA單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:100,4°C避光反應(yīng)4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下 透析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0102] 檢測(cè)反應(yīng)原理
[0103] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，在虹吸作用帶動(dòng)下，待測(cè)溶液中0TA和熒光抗 體纖維層中的熒光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，直至到吸水材料層。
[0104] 在擴(kuò)散過程中，待測(cè)0ΤΑ可與熒光抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉熒光抗體上0ΤΑ的抗原結(jié) 合點(diǎn)，阻止熒光抗體與纖維素膜上的0ΤΑ人工抗原的檢測(cè)印跡結(jié)合，不能顯示檢測(cè)印跡，而 羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與熒光抗體結(jié)合，在紅外線激發(fā)下通過熒光讀條 儀T線處就不會(huì)出現(xiàn)吸收峰，C線處會(huì)出現(xiàn)吸收峰。反之樣品溶液中無0ΤΑ時(shí)，則不能阻止熒 光抗體與纖維素膜上偶聯(lián)0ΤΑ載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，通過熒光讀條儀T線處就會(huì)出現(xiàn)吸 收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，通過熒光讀 條儀C線處也會(huì)出現(xiàn)吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸收峰，則表明試紙條已失效。
[0105] 實(shí)施例3
[0106] 實(shí)施例3中免疫層析試紙的制備和實(shí)施例1基本相同，主要不同之處在于：熒光抗 體為NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0107] 所述的似6(1(￥〇4)2 4113+納米顆粒標(biāo)記的(^4單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0108] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0109] 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結(jié)晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N〇3)3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu(N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N〇3)3溶液、1 OmL Na2W〇4 溶液和5mL Eu(N03)3溶液，加入到反應(yīng)爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=5，攪拌均勻，封閉 反應(yīng)釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80 °C干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0110] (2)0ΤΑ抗體的標(biāo)記
[0111 ] 將0ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質(zhì)；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用〇.lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2;
[0112] 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態(tài)下，加入OTA單克隆抗體或多 克隆抗體溶液1〇〇μ1，〇ΤΑ單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，lOOOOr/ min離心30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 檢測(cè)反應(yīng)原理
[0114] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)0ΤΑ及熒光 納米顆粒標(biāo)記抗體玻璃纖維棉中的下轉(zhuǎn)換焚光納米顆粒NaGd (W〇4) 2: Eu3+標(biāo)記抗體一起向 纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過程中，待測(cè)0ΤΑ可與熒光納米 顆粒標(biāo)記抗體纖維層中的下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉下轉(zhuǎn)換熒光納米 顆粒標(biāo)記抗體上0ΤΑ的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記抗體與纖維素膜上偶聯(lián) 0ΤΑ載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，試紙上無法顯示檢測(cè)印跡，而羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔 IgG)抗體則可與下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記抗體結(jié)合，在紅外線激發(fā)下通過熒光讀條儀T線 處就不會(huì)出現(xiàn)吸收峰，C線處會(huì)出現(xiàn)吸收峰。反之樣品溶液中若無0ΤΑ，則不能阻止下轉(zhuǎn)換熒 光納米顆粒標(biāo)記抗體與纖維素膜上偶聯(lián)0ΤΑ載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，通過熒光讀條儀T線 處就會(huì)出現(xiàn)吸收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與下轉(zhuǎn)換熒光納米顆 粒標(biāo)記抗體結(jié)合，通過熒光讀條儀C線處也會(huì)出現(xiàn)吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸 收峰，則表明試紙條已失效。
[0115]以下結(jié)合其他實(shí)施例具體說明免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法
[0116] 實(shí)施例4
[0117] 本實(shí)施例的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，參照?qǐng)D1-2,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層2、熒光抗體纖維層3、纖維 素膜層4及吸水材料層7,所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)0ΤΑ的載體蛋白溶液印制的隱形 檢測(cè)印跡5和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡6;所 述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納 米材料標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0118] 所述的支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層15和設(shè)置在吸附層頂面的面層14。
[0119] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與熒光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的面層上印制有樣品標(biāo)記線16,該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維 層一側(cè)0 · 3 ~0 · 7cm。
[0120] 為了更好的技術(shù)效果，所述的隱形檢測(cè)印跡5和隱形對(duì)照印跡6呈相間設(shè)置在纖維 素膜層4的表面，即兩條印跡帶平行排列成I I"，間距為5~8_。
[0121]覆蓋在吸附纖維層和熒光抗體纖維層上面的面層為白色，覆蓋在吸水材料層上面 的面層為其它顏色(如黃色），測(cè)試樣品標(biāo)記線位于吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對(duì) 應(yīng)的白色面層偏向吸附纖維層一側(cè)約0.5cm處，在標(biāo)記線右側(cè)面層上印有箭頭及max字樣。 [0122] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[0123] 檢測(cè)玉米樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0124] 操作方法:將0ΤΑ試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插入深度不超過標(biāo)記線，約10~20 秒鐘取出試紙，5min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0125] 結(jié)果判定：
[0126] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陽性， 說明在待測(cè)樣品中含有0ΤΑ;
[0127] (b)陰性判定：通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰 性，說明在待測(cè)樣品中不含0ΤΑ;
[0128] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，或T線處出現(xiàn) 吸收峰，C線處不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0129] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[0130] 靈敏性的檢測(cè)：用無水乙醇分別配置濃度為8、4、2、l、0.5、0.25、0.125、0ng/mL的 0ΤΑ標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例試紙上樣100yL，反應(yīng)5min后，通過熒光讀條儀直接讀取峰圖。以峰 值或峰面積為縱坐標(biāo)，以不同0ΤΑ濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行相關(guān)回 歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)0ΤΑ的IC 5Q和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙對(duì)0ΤΑ的曲線回歸方程為:y =-0.2356x+0.7659，相關(guān)系數(shù)為R 2 = 0.9889，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)OTA的1(：50為 13.44ng/mL，該試紙的最低檢測(cè)限為0.27ng/mL，表明免疫層析試紙對(duì)0ΤΑ具有較高的靈敏 度。
[0131]特異性的檢測(cè)：以黃曲霉毒素也、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、展青霉素、麥角毒素作 為競(jìng)爭(zhēng)物，配置上述標(biāo)品濃度均為lmg/mL，用氧化石墨烯熒光免疫層析試紙檢測(cè)其抑制率， 根據(jù)公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。
[0132] 測(cè)定結(jié)果見下表1，該氧化石墨烯-銀納米熒光免疫層析試紙的特異性較好，與其 他毒素均無交叉反應(yīng)。
[0133] 表1免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)
[0134]
[0135]
[0136] 本實(shí)施例的試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0137] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例的試紙條以氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的 0ΤΑ抗體為基礎(chǔ)制成，由于經(jīng)修飾過的氧化石墨烯熒光材料具有非凡光學(xué)特性和良好的生 物相容性，同時(shí)氧化石墨烯電子傳遞效率高，使得這種新型免疫方法靈敏度高，檢測(cè)極限 低，最低僅為〇. 27ng/mL。
[0138] (2)穩(wěn)定性高，安全性好。本實(shí)施例的試紙條氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的OTA 抗體為基礎(chǔ)制成，納米銀顆粒表面與蛋白質(zhì)帶有相反的電荷基團(tuán)，因靜電吸附而牢固結(jié)合； 石墨烯比表面積大，能與多種蛋白質(zhì)生物分子通過化學(xué)反應(yīng)結(jié)合，而對(duì)其生物活性影響很 小，穩(wěn)定性高，靈活性好。
[0139] (3)本實(shí)施例的氧化石墨烯熒光免疫層析試紙可對(duì)玉米、DDGS、飼料等進(jìn)行檢測(cè)。 通過銀納米和氧化石墨烯共同作用，檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)，降低抗體用量，節(jié)省抗體成本。
[0140] 實(shí)施例5
[0141]本實(shí)施例的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，參照?qǐng)D3-7,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，所述的支撐體包括透明的中空管體1，吸附層填充在中空管體內(nèi) 部，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層2、熒光抗體纖維層3、纖維素膜層4及吸水材料 層7,所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)0ΤΑ的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡5和用羊抗 小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡6;所述的熒光抗體纖維 層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克 隆抗體或者多克隆抗體。
[0142] 所述的中空管體1的上端裝有連接頭8,連接頭8上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的 輔助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套13和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊 12,氣囊12的出氣口依次經(jīng)連接套13上部的進(jìn)氣通道132、連接頭8的內(nèi)腔9與中空管體1的 上口部相連通，進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無法向內(nèi)吸氣的單向出 氣裝置11。
[0143] 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔111，換氣 腔111內(nèi)設(shè)置有圓球形的密封球113，換氣腔111的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一出氣 口 114,第一出氣口經(jīng)出氣通道115與進(jìn)氣通道132相連通，換氣腔111側(cè)面設(shè)置有與外界大 氣相連通的第二出氣口 112，構(gòu)成只能向外排氣、無法向進(jìn)氣通道吸氣的單向出氣結(jié)構(gòu)。
[0144] 為了更好的技術(shù)效果，所述的第一出氣口 114為圓形，其直徑小于密封球的直徑。 這樣的設(shè)置能夠使第一出氣口與圓球形的密封球更加緊密的結(jié)合，保證空間的密封性。
[0145] 所述的連接頭8為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體1的上端呈密封連接， 連接頭上部的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套13的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)得盲孔131，盲 孔131內(nèi)壁上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔131內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈10。
[0146] 所述的隱形檢測(cè)印跡5和隱形對(duì)照印跡6呈相間設(shè)置在纖維素膜層4的表面，間距 為5~8mm〇
[0147] 所述的中空管體1的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。
[0148] 測(cè)試樣品標(biāo)記線位于吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的透明中空管體 上偏向吸附纖維層一側(cè)約〇.5cm處，在標(biāo)記線右側(cè)的透明中空管體上印有箭頭及max字樣。
[0149] 使用時(shí)，將連接套和連接頭通過內(nèi)外螺紋連接在一起，輕輕擠壓氣囊，氣囊中的氣 體通過進(jìn)氣通道、連接頭的內(nèi)腔和連接套側(cè)壁的換氣腔向外排出，此時(shí)換氣腔內(nèi)的圓球形 密封球被從氣囊中擠壓出的氣體抬起，氣囊中的氣體通過第一出氣口順利向外排出；將試 紙插入待測(cè)樣品溶液中，然后松開氣囊，此時(shí)，中空管體的內(nèi)腔、連接頭的內(nèi)腔和進(jìn)氣通道 內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，在負(fù)壓的吸引下，密封球緊緊吸附在換氣腔的底面上的第一出氣口上，將其封 閉，從而幫助樣品溶液更加快速的浸潤(rùn)試紙，從而減少樣品溶液浸潤(rùn)試紙條的時(shí)間，提高檢 測(cè)效率。
[0150] 由上述情況可以清楚的看出，本實(shí)施例結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，簡(jiǎn)單合理，通過將支撐體整 體修改為密閉結(jié)構(gòu)，同時(shí)在支撐體的頂部增加氣囊，使吸收更加迅速，從而有效提高檢測(cè)的 速度和準(zhǔn)確度，同時(shí)氣囊部分和支撐體部分為密封拆裝式連接，檢測(cè)完畢后只需更換支撐 體部分即可，拆裝方便，易操作，使用效果好，是檢測(cè)試紙上的創(chuàng)新。
[0151] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[0152] 檢測(cè)DDGS樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0153] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內(nèi)的氣體排出，將0ΤΑ試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插 入深度不超過標(biāo)記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0154] 結(jié)果判定：
[0155] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線處不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè) 結(jié)果為陽性，說明在待測(cè)樣品中含有赭曲霉毒素 A;
[0156] (b)陰性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性， 說明在待測(cè)樣品中不含赭曲霉毒素 A;
[0157] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0158] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[0159] 靈敏性的檢測(cè)：用無水乙醇分別配置濃度為8、4、2、l、0.5、0.25、0.125、0ng/mL的 0ΤΑ標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例試紙上樣100yL，反應(yīng)4min后，通過熒光讀條儀直接讀取峰圖。以峰 值或峰面積為縱坐標(biāo)，以不同0ΤΑ濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行相關(guān)回 歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)0ΤΑ的IC 5Q和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙對(duì)0ΤΑ的曲線回歸方程為:y =-0.4319x+0.9367，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9689，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)OTA的1(：50為 10.26ng/mL，該試紙的最低檢測(cè)限為0.21ng/mL，表明免疫層析試紙對(duì)0ΤΑ具有較高的靈敏 度。
[0160]特異性的檢測(cè)：以黃曲霉毒素也、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、展青霉素、麥角毒素作 為競(jìng)爭(zhēng)物，配置上述標(biāo)品濃度均為lmg/mL，用NaYF4: Yb，Tm納米熒光免疫層析試紙檢測(cè)其抑 制率，根據(jù)公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。
[0161]測(cè)定結(jié)果見下表2,該NaYF4:Yb，Tm納米熒光免疫層析試紙的特異性較好，與其他 毒素均無交叉反應(yīng)。
[0162]表2免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)
[0163]
[0164] ~本實(shí)施例的試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn):
' '
[0165] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析試紙以發(fā)藍(lán)色光譜的上轉(zhuǎn) 換熒光納米材料NaYF4: Yb，Tm標(biāo)記的0ΤΑ抗體為基礎(chǔ)制成，由于NaYF4: Yb，Tm納米顆粒發(fā)光效 率高，能有效消除樣品檢測(cè)背景光，靈敏度大幅提高，最低檢測(cè)限為〇.21ng/mL。
[0166] (2)穩(wěn)定性高，安全性好。本實(shí)施例的試紙中上轉(zhuǎn)換熒光納米材料NaYF4: Yb，Tm能 有效發(fā)射藍(lán)色光譜，完全避免了其他條件引起的發(fā)光淬滅。NaYF4:Yb，Tm材料具有無機(jī)惰 性、紅外光激發(fā)、可見光發(fā)射的特點(diǎn)，使用該試紙進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于周圍人員與環(huán)境無任何危 害。
[0167] (3)簡(jiǎn)便、快速。利用熒光讀條儀，該試紙可直接讀值，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)。只 要將試紙插入被檢樣品3~5秒鐘，4分鐘后即可讀取結(jié)果，在T線處無吸收峰表示被檢樣品 中含有0ΤΑ;反之，不含0ΤΑ。結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，最大限度的避免了人為誤判。
[0168] (4)本實(shí)施例的試紙制備時(shí)，焚光抗體采用NaYF4:Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克 隆抗體或多克隆抗體，即將氨基化的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒直接與抗體相連，標(biāo)記過程簡(jiǎn) 單，偶聯(lián)率高，從而有效提高基于NaYF4: Yb，Tm材料的免疫試紙的靈敏度。
[0169] 實(shí)施例6
[0170] 本實(shí)施例的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)同實(shí)施例5,不同之處 在，本實(shí)施例的熒光抗體為NaGd(W〇4)2:Eu 3+納米顆粒標(biāo)記的0ΤΑ單克隆抗體或者多克隆抗 體。
[0171 ] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[0172] 檢測(cè)DDGS樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0173] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內(nèi)的氣體排出，將0ΤΑ試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插 入深度不超過標(biāo)記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0174] 結(jié)果判定：
[0175] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線處不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè) 結(jié)果為陽性，說明在待測(cè)樣品中含有赭曲霉毒素 A;
[0176] (b)陰性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性， 說明在待測(cè)樣品中不含赭曲霉毒素 A;
[0177] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0178] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[0179] 靈敏性的檢測(cè)：用無水乙醇分別配置濃度為8、4、2、l、0.5、0.25、0.125、0ng/mL的 0ΤΑ標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例試紙上樣100yL，反應(yīng)4min后，通過熒光讀條儀直接讀取峰圖。以峰 值或峰面積為縱坐標(biāo)，以不同OTA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行相關(guān)回 歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)0TA的IC5Q和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙對(duì)0TA的曲線回歸方程為:y =-0.4154x+l. 1123，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9779，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)OTA的1(：50為 9.83ng/mL，該試紙的最低檢測(cè)限為1.07ng/mL，表明免疫層析試紙對(duì)0TA具有較高的靈敏 度。
[0180]特異性的檢測(cè)：以黃曲霉毒素 Βι、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、展青霉素、麥角毒素作 為競(jìng)爭(zhēng)物，配置上述標(biāo)品濃度均為lmg/mL，用NaGd(W〇4)2:Eu3+納米熒光免疫層析試紙檢測(cè) 其抑制率，根據(jù)公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。
[0181]測(cè)定結(jié)果見下表3,該NaGd(W〇4)2:Eu3+納米熒光免疫層析試紙的特異性較好，與其 他毒素均無交叉反應(yīng)。
[0182] 表3免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)
[0183]
[0184]~本實(shí)施例的試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn):
' '
[0185] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例下轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記免疫層析試紙是以氧 化釓(Gd 2〇3)、鎢酸鈉(Na2W〇4 · 2H20)為基質(zhì)，銪離子(Eu3+)為敏化劑形成的100~200nm納米 顆粒，具有良好的光學(xué)特性，使0ΤΑ的檢測(cè)消除了背景光的干擾，靈明度大大提高，最低可檢 測(cè)到 1.07ng/mL。
[0186] (2)穩(wěn)定性高。NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒屬于完全惰性的無機(jī)發(fā)光材料，這些性質(zhì) 使得其具有非常好的光穩(wěn)定性，在紫外燈的照射下不發(fā)生光漂白，使得讀值穩(wěn)定。
[0187] (3)簡(jiǎn)便、快速。使用本實(shí)施例試紙可與熒光讀條儀結(jié)合使用，直接讀值，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng) 定量檢測(cè)，只需將試紙條插入被檢樣品中3-5秒鐘，取出后4分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0188] (4)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本實(shí)施例熒光納米顆粒標(biāo)記免疫層析試紙是以T線 是否出現(xiàn)吸收峰作為檢測(cè)陽性和陰性的標(biāo)準(zhǔn)。若T線處無吸收峰則表示被檢樣品中含有 0ΤΑ，反之則表示被檢樣品中不含0ΤΑ。結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤 判。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附 層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層(2)、熒光抗體纖維層(3)、纖維素膜層(4)及吸 水材料層(7)，其特征在于，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)OTA的載體蛋白溶液印制的隱 形檢測(cè)印跡(5)和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡 (6);所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯 熒光納米材料、NaYF4:Yb，Tm納米顆?；騈aGd(W〇4)2:Eu 3+納米顆粒標(biāo)記的OTA單克隆抗體或 者多克隆抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層(15)和設(shè)置在吸附層頂面的面層(14)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括透明的中空管體(1)，吸附層填充在中空管體內(nèi)部，吸附層從測(cè)試端開始依次為 吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 中空管體(1)的上端裝有連接頭(8)，連接頭(8)上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的輔助吸附 裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套（13)和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊（12)，氣 囊（12)的出氣口依次經(jīng)連接套（13)上部的進(jìn)氣通道（132)、連接頭(8)的內(nèi)腔(9)與中空管 體（1)的上口部相連通，進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無法向內(nèi)吸氣 的單向出氣裝置(11); 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔（111)，換氣腔 (111)內(nèi)設(shè)置有圓球形的密封球（113)，換氣腔（111)的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一 出氣口（114)，第一出氣口經(jīng)出氣通道（115)與進(jìn)氣通道（132)相連通，換氣腔（111)側(cè)面設(shè) 置有與外界大氣相連通的第二出氣口（112)，構(gòu)成只能向外排氣、無法向進(jìn)氣通道吸氣的單 向出氣結(jié)構(gòu)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 第一出氣口（114)為圓形，其直徑小于密封球的直徑。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 連接頭(8)為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體（1)的上端呈密封連接，連接頭上部 的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套（13)的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)的盲孔（131)，盲孔 (131)內(nèi)壁上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔（131)內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈 (10) 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 隱形檢測(cè)印跡(5)和隱形對(duì)照印跡(6)呈相間設(shè)置在纖維素膜層(4)的表面，間距為5-8mm; 所述的中空管體(1)的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的0TA單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步 驟： (1)氧化石墨烯熒光材料修飾： 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下加熱 回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽真空 氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應(yīng)72h，冷卻至室溫，得 到烷基胺修飾的氧化石墨烯，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應(yīng)的正丁胺， 將剩余的反應(yīng)液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙蒸水中，配制成濃度 為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液； (2) 表面標(biāo)記OTA抗體銀納米顆粒溶液的制備： (a) 將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸 鈉溶液，80 °C加熱回流1 h后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的巰基 乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應(yīng)的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加 超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液； (b) 取0.1 mM的EDC 10yL和0.1 mM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆 粒溶液中，反應(yīng)lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液； (c) 取0.1 mM的0TA單克隆抗體或多克隆抗體10yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒溶液 中，4°C反應(yīng)過夜，得到表面標(biāo)記0TA抗體銀納米顆粒溶液； (3) 氧化石墨烯熒光納米材料0TA抗體的標(biāo)記： 取修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應(yīng)3h，離心，除去未 反應(yīng)的戊二醛，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖溶液中，加入表面標(biāo)記 0TA抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)3h，經(jīng)離心，收集氧化石墨稀焚光納米材料標(biāo)記的0TA單 克隆抗體或者多克隆抗體，〇. 01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0TA單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒： 分別取濃度均為0.5111〇1/1的￥(觀3)3溶液5.511^、￥13(^)3) 3溶液0.511^和1'111(^)3)3溶液 0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應(yīng)lh;加入 1.5mol/L NH4F溶液7mL，25°C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調(diào)節(jié)pH值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30mL;再在220°C下反應(yīng)24h，冷卻到室溫，經(jīng)過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發(fā)藍(lán) 色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒； (2) 熒光納米顆粒的表面硅化： 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度為lmg/ mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶 液中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正娃酸四乙酯，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 6000r/min 離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制成濃度為 1 Omg/mL的焚光納米顆粒甲醇溶液； (3) 熒光納米顆粒的表面氨基化： 取3mL熒光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲波均 勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應(yīng)30min，再在70 °C水浴反應(yīng)lh，6000r/min離心 5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復(fù)洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保存； (4) 0TA抗體的標(biāo)記： 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃度為 lOmg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液；取lOmL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液與 5 · 6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL的 OTA單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，OTA單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液的 體積比為1:100，4°C避光反應(yīng)4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下透 析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的0TA單克隆抗體或多克隆抗體，置 于PBS緩沖溶液中，4°C保存。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)赭曲霉毒素 A的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的0TA單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步 驟： (1) 采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部結(jié) 晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N〇3) 3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu (N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd (N〇3) 3溶液、1 OmLNa2W〇4溶 液和5mL Eu (N〇3)3溶液，加入到反應(yīng)爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=5，攪拌均勾，封閉反 應(yīng)釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉淀 后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80°C干燥12h，得 到 NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒； (2) OTA抗體的標(biāo)記 將OTA單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質(zhì)；用去離子水溶 解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，然后 用O.lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2; 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態(tài)下，加入OTA單克隆抗體或多克隆抗 體溶液1 〇〇μ 1，0TA單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30miη，4 °C、 10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/min 離心30min，沉淀用0.02mo 1/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>【文檔編號(hào)】G01N33/558GK105974109SQ201610427117
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】李靖靖, 職愛民, 閔玉濤, 程麗英, 郭林, 王嵐, 張小梅, 聶卉, 趙國欣, 張曉宇, 楊聯(lián)芝
【申請(qǐng)人】中州大學(xué)