一種檢測(cè)赭曲霉毒素a的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬納米生物傳感以及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，結(jié)構(gòu)通式:R1 = C1SH;R2 = H、CH3SC2H5。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2 = H)毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見。
[0003]赭曲霉毒素A是一種無色結(jié)晶化合物。可溶于極性有機(jī)溶劑和稀碳酸氫鈉溶液。微溶于水。其苯溶劑化物熔點(diǎn)94?96°C，二甲苯中結(jié)晶熔點(diǎn)169°C。有光學(xué)活性[a]D-118°。其紫外吸收光譜隨PH值和溶劑極性不同而有別，在乙醇溶液中最大吸收波長為213nm和332nm。有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。動(dòng)物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現(xiàn)在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害動(dòng)物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動(dòng)物的腸黏膜炎癥和壞死。還在動(dòng)物試驗(yàn)中觀察到它的致畸作用。
[0004]因此對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)是十分必要的。
[0005]目前，對(duì)赭曲霉毒素A檢測(cè)方法主要是色譜技術(shù)，包括薄層色譜(TLC)，氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等。近年來，發(fā)展了基于核酸適體的真菌毒素新的檢測(cè)方法。如B1sensors and B1electronics 57(2014)226-231 公開了一種用于赭曲霉毒素A的檢測(cè)的基于DNA骨架的銀納米簇的熒光適體傳感器(AFluorescent Aptasensor based on DNA—scaffolded Silver-nanocluster forOchratoxin A Detect1n)。
[0006]中國專利CN102830113B公開了一種目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性內(nèi)切酶酶切循環(huán)的信號(hào)放大技術(shù)在赭曲霉素A超靈敏度檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0007]中國專利CN102517288A公開了一種赭曲霉毒素A核酸適體及其應(yīng)用，該核酸適體可以用于赭曲霉毒素A的檢測(cè)分析和分離富集。
[0008]通常，色譜法用于食品中痕量真菌檢測(cè)存在靈敏度不夠的問題，液-質(zhì)聯(lián)用法雖然靈敏度高、快速，但設(shè)備昂貴、應(yīng)具有專門操作技術(shù)人員才能進(jìn)行檢測(cè)，技術(shù)要求高，不宜大眾化和普及，而文獻(xiàn)所述的基于核酸適體檢測(cè)赭曲霉真菌毒素方法或存需要用到價(jià)格昂貴的經(jīng)標(biāo)記(生物材料等)的DNA，或操作復(fù)雜等不足之處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)赭曲霉毒素的方法，所述方法包括:
[0010](A)使抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)和可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)雜交，形成雜交鏈；
[0011](B)使該雜交鏈與待測(cè)樣品接觸，當(dāng)待測(cè)樣品中有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針DNA;
[0012](C)為了消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴(kuò)增使雜交鏈成雙鏈DNA，用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片，留下單鏈信號(hào)探針DNA;
[0013](D)利用銀離子在抗赭曲霉毒素A核酸適體-赭曲霉毒素A的結(jié)合體中不能還原生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇，只有單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)中銀離子還原并生成被(Sp)修飾的熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇的原理，在銀離子還原檢測(cè)體系中檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度，測(cè)定生物毒素赭曲霉毒素A的含量。
[0014]在本發(fā)明中，所述銀離子還原檢測(cè)體系包括先后添加的銀離子和使銀離子迅速還原成單質(zhì)銀的還原劑，例如硼氫化物例如硼氫化鈉。步驟(D)的檢測(cè)例如包括依次先后向體系中加入銀離子溶液和硼氫化鈉溶液，反應(yīng)后生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸適體為GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)為CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。
[0017]本發(fā)明的方法的檢測(cè)原理如下:抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)與單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)雜交(下劃線部分)；當(dāng)有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出Sp;體系中有Apt-Sp(剩余的)，Apt-赭曲霉毒素A和Sp ；銀離子在Apt-赭曲霉毒素A體系中不能還原生成焚光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇，Apt-赭曲霉毒素A的存在對(duì)測(cè)定無干擾；雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片。此時(shí)體系中只留下信號(hào)探針DNA，再先后向該體系中加入銀離子溶液和硼氫化鈉溶液，此時(shí)，溶液中生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的Sp修飾銀納米簇，通過檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度，測(cè)定真菌毒素赭曲霉毒素A的含量。
[0018]本發(fā)明另外提供了一種用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的試劑盒，其至少包括:抗赭曲霉毒素A核酸適體，可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA，DNA擴(kuò)增體系、外切酶、銀離子還原檢測(cè)體系。
[0019]在上述試劑盒的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸適體為GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0020]在上述試劑盒的一個(gè)實(shí)施方式中，所述單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)為CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29DNA聚合酶。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述外切酶為ExoIII核酸外切酶。
[0023]本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的抗赭曲霉毒素A核酸適體，其堿基序列為GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0025]根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒，方法簡(jiǎn)單、易于操作、并可以消除背景熒光的干擾，提尚赫曲霉毒素A的檢測(cè)靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0026]圖1為Sp修飾銀納米簇的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過【具體實(shí)施方式】來說明本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明的用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的試劑盒至少包括:抗赭曲霉毒素A核酸適體，可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA，DNA擴(kuò)增體系、外切酶、銀離子還原檢測(cè)體系。
[0029]在上述試劑盒的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸適體為GATCGGGTGTG