一種大曲中赭曲霉毒素a的提取、純化方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品加工工藝領(lǐng)域，涉及固態(tài)食品發(fā)酵產(chǎn)物中毒素的檢測方法，具體為一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法。該方法包括以下步驟：①取一定量粉碎后的大曲樣品，置于離心管內(nèi)，然后加入一定量的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩；②采用離心機(jī)進(jìn)行離心；③取上清液，通過玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾；④準(zhǔn)確量取一定量的過濾后液體于離心管內(nèi)，加入三氯甲烷試劑，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置；⑤待分層后，取下層三氯甲烷相于離心管內(nèi)，在溫度為50℃的條件下用氮?dú)獯蹈?；⑥取色譜級甲醇于氮?dú)獯蹈珊蟮碾x心管內(nèi)，劇烈震蕩，溶解赭曲霉毒素A。本提取純化方法成本低，效果好，簡單易行，提取率高。
【專利說明】—種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品加工工藝領(lǐng)域，涉及固態(tài)食品發(fā)酵產(chǎn)物中毒素的檢測方法，具體為一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素A是一種無色結(jié)晶化合物?？扇苡跇O性有機(jī)溶劑和稀碳酸氫鈉溶液。微溶于水。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現(xiàn)在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。在動物試驗(yàn)中還觀察到它的致畸作用。
[0003]近年來，食品安全已引起社會廣泛的關(guān)注。采用ELASA (酶聯(lián)免疫法)可以很快的檢測待測樣品中赭曲霉毒素含量。然而如何快速、有效的提取和純化毒素已成為制約該技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。應(yīng)用本技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確提取大曲、酒醅、固態(tài)發(fā)酵法制備的食品樣品等中的赭曲霉毒素，用于后續(xù)的ELASA或液相色譜檢測。
[0004]酶聯(lián)免疫法是指利用抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用，在一定條件下呈現(xiàn)色澤反應(yīng)，通過分光光度計(jì)對其進(jìn)行定性定量測定。該方法有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以快速的針對待測樣品中赭曲霉毒素A含量進(jìn)行定性、定量檢測。
[0005]ELASA方法對待測樣品中赭曲霉毒素A含量進(jìn)行定量檢測時(shí)精確度不高是一個(gè)長期困擾該方法推廣使用的主要問題，傳統(tǒng)意義上的使用免疫親和柱進(jìn)行提取純化，效果雖好，但對設(shè)備要求高，步驟復(fù)雜，且價(jià)格昂貴、花費(fèi)較高，因此如何簡便快捷、經(jīng)濟(jì)有效的提取和純化毒素成為制約該技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。
[0006]通過比較赭曲霉毒素ELASA試劑盒內(nèi)赭曲霉毒素提取效果和國標(biāo)GBT25220-2010免疫親和柱法的提取效果，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的ELASA試劑盒內(nèi)赭曲霉毒素A提取效果比免疫親和柱純化法得到的赭曲霉毒素含量要低；而采用赭曲霉毒素免疫親和柱提取純化赭曲霉毒素?zé)o疑會大大增加檢測成本。因此通過對固態(tài)成品大曲樣品中赭曲霉毒素A提取、純化工藝的改進(jìn)來解決這一問題非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明正是針對以上技術(shù)問題，提供一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，該方法的檢測成本低，效果好，對設(shè)備要求低，步驟簡單且快捷。
[0008]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
[0009]①取一定量粉碎后的大曲樣品，置于離心管內(nèi)，然后加入一定量的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩；所述的樣品提取液為去離子水與甲醇按體積比為7:3的比例進(jìn)行混合的液體，甲醇為色譜純；大曲樣品的質(zhì)量:樣品提取液的體積=1:4，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩的時(shí)間為lOmin。[0010]②采用離心機(jī)進(jìn)行離心；所采用的離心機(jī)為4000rpm，離心時(shí)間為5min。
[0011]③取上清液，通過玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾；
[0012]④準(zhǔn)確量取一定量的過濾后液體于離心管內(nèi)，加入三氯甲烷試劑，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置；所述的三氯甲烷試劑為色譜純，過濾后的液體與三氯甲烷的體積比為1:1。在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置，其劇烈震蕩的時(shí)間為5min，靜置IOmin
[0013]⑤待分層后，取下層三氯甲烷相于離心管內(nèi)，在溫度為50°C的條件下用氮?dú)獯蹈?
[0014]⑥取色譜級甲醇于氮?dú)獯蹈珊蟮碾x心管內(nèi)，劇烈震蕩，溶解赭曲霉毒素A。最后0.5mL甲醇中赭曲霉毒素A的含量與0.5g大曲中的含量相等。
[0015]本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在:
[0016](一)、提取成本低，效果好，提取和純化率高；
[0017](二)、對設(shè)備要求低，步驟簡單且快捷；
[0018](三)、本提取和純化的方法比較省時(shí)，國標(biāo)法由于需要親和柱純化法，至少需要4-6的時(shí)間，而本方法僅需要半小時(shí)左右的時(shí)間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為赫曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖1可以看出，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9994，且變異率小于10%，符合實(shí)驗(yàn)要求。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1:
[0022]一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，具體包括以下步驟:
[0023]①取5g粉碎后的大曲樣品，置于50ml的離心管內(nèi)，然后加入20ml的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩IOmin ;樣品提取液為去離子水與甲醇按體積比為7:3的比例進(jìn)行混合的液體，甲醇為色譜純，大曲樣品的質(zhì)量:樣品提取液的體積=1:4。
[0024]②采用4000rpm的離心機(jī)進(jìn)行離心5min ；
[0025]③取IOml的上清液，通過玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾；
[0026]④準(zhǔn)確量取4ml過濾后液體于20ml的離心管內(nèi)，加入4ml三氯甲烷試劑，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩5min后再靜置IOmin ；
[0027]⑤待分層后，取下層三氯甲烷相2ml于5ml的離心管內(nèi)，在溫度為50°C的條件下用氮?dú)獯蹈桑?br> [0028]⑥取0.5ml色譜級甲醇于氮?dú)獯蹈珊蟮碾x心管內(nèi)，劇烈震蕩，溶解赭曲霉毒素A，0.5mL甲醇中赭曲霉毒素A的含量與0.5g大曲中的含量相等。
[0029]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3倍稀釋后得到工作濃度梯度分別為0ppb，0.lppb,0.3ppb,0.9ppb，
2.7ppb，8.1ppb (ppb 相當(dāng)于 ii g/kg)，標(biāo)號為 C1、C2、C3、C4、C5、C6。設(shè)置酶標(biāo)儀于 450nm 處進(jìn)行OD值的檢測，檢測數(shù)據(jù)通過RIDAWIN軟件分析后得到的檢測結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1與圖1所示:
[0031]表1.赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于包括以下步驟: ①取一定量粉碎后的大曲樣品，置于離心管內(nèi)，然后加入一定量的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩； ②采用離心機(jī)進(jìn)行離心； ③取上清液，通過玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾； ④準(zhǔn)確量取一定量的過濾后液體于離心管內(nèi)，加入三氯甲烷試劑，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置； ⑤待分層后，取下層三氯甲烷相于離心管內(nèi)，在溫度為50°C的條件下用氮?dú)獯蹈桑? ⑥取色譜級甲醇于氮?dú)獯蹈珊蟮碾x心管內(nèi)，劇烈震蕩，溶解赭曲霉毒素A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于:步驟①中所述的樣品提取液為去離子水域甲醇按體積比為7:3的比例進(jìn)行混合的液體，甲醇為色譜純。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于:步驟④所述的三氯甲烷試劑為色譜純，過濾后的液體與三氯甲烷的體積比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于:步驟①中所述的大曲樣品的質(zhì)量 :樣品提取液的體積=1:4，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩的時(shí)間為IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于:步驟②中所述的采用離心機(jī)進(jìn)行離心，所采用的離心機(jī)為4000rpm，離心時(shí)間為5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，其特征在于:步驟④中在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置，其劇烈震蕩的時(shí)間為5min，靜置lOmin。
【文檔編號】G01N1/28GK103604674SQ201310601670
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】羅惠波, 葉光斌, 邊名鴻, 衛(wèi)春會, 楊曉東, 李丹宇 申請人:四川理工學(xué)院