一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學，具體的說是一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應用。元件為嗜熱II型內含子元件TeI3c-4c，其由序列表SEQ ID NO.1和2中核酸序列所示。利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體應用于嗜熱微生物中，進而使嗜熱微生物基因靶向失活。本發(fā)明利用Thermotargetron應用于嗜熱微生物的基于II型內含子的靶向基因失活工具。具有基因失活效率高、可輕松改變靶位點（打靶載體構建周期短）、宿主范圍廣（可用于革蘭氏陽性、陰性細菌中）、無需營養(yǎng)缺陷篩選標記、對轉化效率要求低、可對較短基因序列進行失活（100-200bp）低等優(yōu)點。
【專利說明】一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應 用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學，具體的說是一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件 及其載體和應用。

【背景技術】
[0002] 基于targetron系統(tǒng)的基因敲除方法具有操作簡單、周期短、效率高、無需抗性篩 選、對轉化效率要求低等優(yōu)點，能夠彌補同源重組方法的缺點，已廣泛的應用于基礎研究和 工程菌株的改造。
[0003] II型內含子基因失活的原理是RNA "歸巢（retrohoming)"，以LI. LtrB內含子為 例，II型內含子的基因失活分兩階段進行（參見圖1):1) LI. LtrB內含子(核酶）自我切割 形成"套索"結構；2)自我剪切形成"套索"結構的II型內含子與具有反轉錄酶活性的IEP (intron-encoded protein)蛋白結合，形成RNP復合體。RNP復合體識別特定的DNA序列， 并將內含子RNA序列插入識別位點的DNA正義鏈。IEP部分消化反義鏈，并以內含子RNA為 模板，剩余反義鏈DNA為引物，逆轉錄出與內含子RNA互補的cDNA序列。隨后內含子RNA 被胞內RNA酶消化，最后DNA正義鏈缺口被胞內DNA修復系統(tǒng)修復，完成內含子的基因失活 過程[1]。
[0004] 目前嗜中溫targetron技術已廣泛應用與多種微生物的基因祀向失活，但目前使 用的targetron系統(tǒng)，都是建立在嗜中溫（37°C -42°C) II型內含子元件的基礎上，這種中 溫II型內含子元件，在高溫條件下（48°C -65°C)不能工作，因此不能應用嗜熱微生物(如 C.thermocellum)中[2, 3]。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應 用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術方案為：
[0007] -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件，元件為嗜熱II型內含子元件 TeI3c-4c,其由序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示。
[0008] -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，載體為具有嗜熱微生物遺傳改造的基因 元件打靶載體，其含有復制起始位點、耐熱復制蛋白、多克隆位點、嗜熱II型內含子元件 TeI3c_4c和啟動子元件。
[0009] 所述嗜熱II型內含子元件TeI3c_4c為序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示； 啟動子源于嗜熱微生物啟動子。
[0010] 進一步的說，嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體以PHK質粒為骨架，含有 嗜熱II型內含子元件TeI3c-4c和groEL啟動子。
[0011] 所述PHK質粒為以pNW33N (BGSC)質粒為骨架，含有多克隆位點、ColEl復制起點 (Rep Origin)、repB耐熱（50°C?55°C)復制蛋白和氯霉素抗性的氯霉素轉乙?；福–AT) 基因，能夠在大腸桿菌-熱纖梭菌中穿梭復制。
[0012] 所述含有多克隆位點為 PstI, NarI, SmaI, BamHI, XhoI, EcoRI, XbaI, HindIII, KpnI ，NdeI 和 NheI。
[0013] 一種嗜熱微生物遺傳改造的應用，利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶 載體應用于嗜熱微生物中，進而使嗜熱微生物基因靶向失活。
[0014] 由所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體中基因元件與嗜熱微生物的識 別位點結合，進而使嗜熱微生物基因靶向失活。
[0015] 所述識別位點為1)革E DNA識別位點17個堿基具有WAAnnnnnnnnnnnnnn( W=A或T， N=A，T，G，C)特征，確保能夠被TeI3c-4c正確識別；2) TeI3C-4cII型內含子元件EBS1，2, 3 與靶序列IBS1，2, 3 (DNA)滿足Watson-Crick堿基互補配對原則，確保能被RNA正確識別。
[0016] 所述識別位點為WAAnnnnnnnnnnnnnA/T/G/C，W代表A或T堿基，η代表任意堿基， A/T/G/C表示EBS3序列可以為任意一種堿基。
[0017] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0018] 本發(fā)明利用Thermotargetron應用于嗜熱微生物的基于II型內含子的祀向基因 失活工具。具有基因失活效率高、可輕松改變靶位點（打靶載體構建周期短)、宿主范圍廣 (可用于革蘭氏陽性、陰性細菌中）、無需營養(yǎng)缺陷篩選標記、對轉化效率要求低、可對較短 基因序列進行失活（100_200bp)低等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為Targetron工作原理圖，其中，左圖顯示II型內含子通過兩次轉酯化反應 自我拼接成RNA "套索"結構；右圖顯示內含子RNA "套索"與IEP蛋白形成RNP蛋白復合 體，RNP復合體通過反向拼接、反義鏈消化、cDNA合成、DNA修復四步完成內含子的歸巢。
[0020] 圖2為本發(fā)明實施例提供的pHK質粒的構建圖譜，由pNW33N (BGSC)質粒改造而 來，在刪除了 CAT基因和ColEl之間的一段760-bp的冗余序列的同時加入多克隆位點。其 中，Rep Origin質粒復制起點；CAT氯霉素抗性基因；r印B為復制蛋白；MCS為多克隆位點： PstI, NarI, SmaI, BamHI, XhoI, EcoRI, XbaI, HindIII, KpnI, NdeI 和 NheI。
[0021 ] 圖3為本發(fā)明實施例提供的用于熱纖梭菌基因打祀thermotargetron質粒 pHK-TTIA;其中，TeI3c II型內含子及TeI4c RT酶使用熱纖梭菌來源的groEL啟動子啟動 表達。
[0022] 圖4為本發(fā)明實施例提供的嗜熱II型內含子在大腸桿菌中不同溫度下"歸巢" 效率測定原理圖；在大腸桿菌宿主細胞E. coli HMS174DE3中借助TeI3c-4c供體質粒 (pA⑶2X-TeI3C-4c)，受體質粒（pBRR-3c (具有氨芐抗性，ampK))系統(tǒng)我們測定了溫度對 TeI3C-4cII型內含子在大腸桿菌中的歸巢效率的影響。我們在TeI3c內含子DIV區(qū)插入 一段?啟動子（acgcgtaatacgactcactataggg)(圖6)，并克隆進入質粒pAO)2X中獲得 TeI3c-4c II 型內含子供體質粒pACD2X-TeI3c-4c ;受體質粒pBRR-3c(ampR)含有TeI3c-4c II型內含子"E1-E2"識別序列且緊接一段無啟動子的四環(huán)素抗性（tet K)基因。一旦TeI3c 內含子"歸巢"至受體質粒"E1-E2"位點，tetR基因即啟動表達使得菌落具有 性（圖4)。因此不同溫度下ampK與tet K雙抗性菌落數(shù)量與ampK抗性菌落數(shù)量的比值即是 TeI3c-4c的"歸巢"效率即歸巢效率=(TetK+AmpK) /AmpK。
[0023] 圖5為本發(fā)明實施例提供的Thermotargetron重新編碼圖，其中Thermotargetron 重新編碼分為三步。第一步，在祀基因序列中尋找thermotargetron識別位點 WAAnnnnnnnnnnnnnA (W表示A/T，η表示任意堿基)，確定打祀位點；第二步，根據(jù)祀位點設 計TeI3c-4c內含子IBS1，2, EBS1，2(RNA)突變引物（圖6,圖8);第三步，通過重疊 （overlap PCR)獲得）獲得IBS1，2 (RNA)，EBS1，2突變的PCR擴增片段（兩端具有Spel，BsiwI酶切位 點）；第四步，PCR擴增片段SpeI-BsiWI雙酶切后替換pHK-TTIA對應片段，即獲得特異靶 DNA 位點 thermotargetron 打祀載體。
[0024] 圖6為本發(fā)明實施例提供的基因元件TeI3c_4c結構圖，包括Thermotargetron的 組成元件TeI3c II型內含子和TeI4c RT酶。（A)TeI3c II型內含子的二級結構，同時展 示了為完成"歸巢"試驗和構建thermotargetron所做的一些突變。小寫字母表示不同于 野生型TeI3c II型內含子序列；IBS1/2/3外顯子堿基用帶邊框的字母表示，且標明不同 的類型；質粒構建過程中使用的酶切位點使用粗體表示；在內含子DIV區(qū)插入的T7啟動子 (acgcgtaatacgactcactataggg)用斜體表示；希臘字母對應的堿基參與內含子形成三級結 構的形成；在DIVa區(qū)的兩個頸環(huán)結構（陰影方框)可能形成如圖所示的假結（pseudoknot)。 (B)TeMc RT的一級結構，該酶幫助前體TeI3c RNA完成自我拼接和"歸巢"。RT酶結構域具 有很高的保守型，黑框標示的RT1-7編碼RT酶"finger and palm"結構域，其中RT-0, RT-2a (斜陰影)相對non-LTR-retroelement RTs具有保守性[4-6] ;X/Thumb與D結構域參與DNA 結合；。RT與X/Thumb結構域可以特異的與內含子RNA結合，具有逆轉錄酶的活性，并且在 RNA拼接過程中穩(wěn)定RNA核酶活性與結構，幫助II型內含子歸巢至特異DNA靶點；D結構域 主要承擔DNA靶位點識別的功能；En結構域為DNA內切酶切割靶DNA反義鏈，形成II型內 含子RNA逆轉錄引物。
[0025] 圖7為本發(fā)明實施例提供的溫度對TeI3c-4c歸巢效率的影響圖，其中，溫度對 TeI3c_4c歸巢效率的影響。用于歸巢試驗的供體質粒為pACD2X-TeI3c-4c (Targetel為 野生型祀位點，Targete2為IacZ基因祀位點）。供體質粒和受體質粒轉化進入E. coli HMS174(DE3)宿主細胞后，在不同溫度使用500 μ M IPTG誘導1小時后，使用歸巢試驗方法 計算歸巢效率。TeI3C-4cII型內含子，對于兩個打靶位點在42°C以下其歸巢效率都為0,當 溫度超過45°C時歸巢效率急劇升高，48°C達到100m。以上結果表明來源于嗜熱藍聚藻來源 的TeI3c-4c II型內含子歸巢活性具有高溫依賴性。
[0026] 圖8為本發(fā)明實施例提供的TeI3c-4c堿基識別規(guī)律圖，其中，TeI3c-4c II型內 含子的靶DNA識別規(guī)律。（A)野生型TeI3c II型內含子的DNA識別位點，-13-+1位點 之間的堿基序列為表示RNA識別區(qū)域，-14, -15位堿基為IEP蛋白識別區(qū)域。IBS1，2, 3 表示內含子結合位點1，2,3 (intron-binding sitesl，2,3)，EBSl，2,3表示外顯子結合 位點1,2,3 (Exon-binding sitesl, 2, 3)，箭頭表示內含子在祀DNA序列中的插入位點 (intron-insertion SiteX(B)TeMc RT在DNA祀序列中的識別位點。在大腸桿菌（E. coli HMS174DE3)宿主中，使用TeI3c-4c II型內含子供體質粒pADC2X-TeI3c-4c對隨機受體質 粒庫（pBRR-3c，靶位點-35--13/+2- 20為隨機堿基，+1--12為野生型IBS1，IBS2)進行 基因打靶。IPTG誘導完成后，涂布氨芐青霉素/四環(huán)素抗性平板，獲得的陽性克隆測序鑒 定，統(tǒng)計TeI3c RT識別靶DNA序列的偏好性。105個發(fā)生歸巢事件的靶序列在不同位點的 堿基出現(xiàn)頻率使用WebLogo表示（100未篩選的打靶序列作為矯正對照）[7]。該結果表明 IEP蛋白識別位點具有明顯的AA堿基對識別偏好性[8]。（ C)IBS3 (DNA)與EBS3不同的堿 基配對類型對TeI3c-4c II型內含子歸巢效率的影響。將供體質粒pACD-TTIA，pACD-TTIC， pACD-TTIG，or pACD-TTIT 與受體質粒pBRR-3cA(WT, IBS3A)，pBRR-3cC, pBRR-3cG, pBRR-3cT 共同轉化E. coli HMS174 (DE3)(表I )，采用歸巢試驗相同方法，計算不同IBS3與EBS3堿基 配對類型對歸巢效率的影響。EBS3與IBS3 (DNA)不同配對方式對歸巢效率的影響如矩陣圖 所示，野生型的A-U配對用粗體字表示，淺陰影方格內為對應堿基互補配對是的歸巢效率， 白色方格表示堿基之間不形成互補配時的歸巢效率。該結果顯示，EBS3與IBS3(DNA)形成 堿基互補配對是保證高"歸巢"效率（22%-106%)的必要條件。
[0027] 圖9為本發(fā)明實施例提供的IacZ基因不同的thermotargetro識別位點 (60a，369a，2586a)，其中the;rmotarget;ronLacZ60a，lacZ369a，lacZ2586aTeI3cEBS與 IacZ基因 IBS(DNA)靶序列的相互作用。野生型TeI3c與靶DNA的識別在最上方展示；灰 色陰影表示與野生型對應位點堿基相同；IacZ基因使用方框表示，箭頭（IS)及數(shù)字表示 TeI3c II型內含子在IacZ基因中的插入位點，用于Southernblot檢測的Apal，EcoRI酶切 位點位于基因兩側。
[0028] 圖10為本發(fā)明實施例提供的TeI3c-4c II型內含子"歸巢"效率與誘導時間的關 系圖，其中 thermotargetron LacZ60a, lacZ369a, lacZ2586a轉化進入E. coli HMS174(DE3) 細胞后使用500mM IPTG于48°C誘導不同的時間。歸巢效率為白斑與總菌落數(shù)的比值；表 中的比值表示II型內含子單插入突變株數(shù)量/總插入突變株數(shù)量。
[0029] 圖11為本發(fā)明實施例提供的IacZ突變株PCR鑒定圖，其中，PCR檢測8個克?。? 個籃斑（B)和6個白斑（W))并使用野生型E. coli HMS174(DE3)菌株作為對照。使用外側 引物與TeI3c內部檢測引物檢測時（lacZ60a使用LacZ30s和Te680rc引物檢測；lacZ369a 使用 LacZ30s 和 Te680rc 引物檢測；lacZ2586a 使用 lacZ3060a 和 TeI3c608rc 引物檢測， 表2)，在TeI3c內含子插入后可觀察到PCR條帶（白斑有檢測條帶)，野生型和藍斑無檢 測條帶；使用插入位點兩端引物檢測時（lacZ60a使用LacZ30s和LacZ1850as引物檢測； lacZ369a 使用 LacZ30s_LacZ1850as 引物檢測；lacZ2586a 使用 LacZ1850s_LacZ3060as 引 物檢測，表2)，白斑由于外源DNA的插入PCR條帶增大，且增大的數(shù)值正好為II型內含子 RNA的長度。
[0030] 圖12為本發(fā)明實施例提供的Southernblot檢測效果圖，其中，Southerblot檢測 8個克?。?個籃斑（B)和6個白斑（W))并使用野生型E. coli HMS174(DE3)菌株作為對照。 分別檢測48°C誘導15-30分鐘的LacZ60a, lacZ369a轉化子或誘導1小時的lacZ2586a轉 化子。使用32P標記的DNA探針雜交Apal，EcoRI雙酶切的基因組DNA并顯影（IacZ基因 探針：30nt_185nt或TeI3c intron探針：lnt_342nt);當使用IacZ基因探針時，白斑（含 TeI3c)雜交條帶理論大小為4. 5-kb，藍斑(不含TeI3c)雜交條帶理論大小為3. 7kb。使用 TeI3c探針時，理論雜交條帶大小為4. 5kb ;出現(xiàn)多條雜交條帶提示有TeI3c脫靶。
[0031] 圖13為本發(fā)明實施例提供的Thermotargetron基因打祀（失活）原理圖，其中， Thermotargetron質粒TeI3c II型內含子和TeI4c RT由熱纖梭菌組成型啟動子PgroEL 啟動表達。TeI3c基因轉錄出具有核酶活性的II型內含子RNA ;RT酶基因轉錄出RT酶。 TeI3c RNA與RT酶結合形成核糖核蛋白復合體（RNP) ;RNP可以特異的識別靶DNA5'，3'外 顯子（ΕχοηΓ，Exon2' )，插入DNA正義鏈并部分消化反義鏈。RT酶以剩余反義鏈為引物，內 含子RNA為模板逆轉錄出RNA的cDNA序列；最后通過宿主DNA修復機制完成"歸巢"；由于 II型內含子DNA內部有許多終止密碼子（TAA)所以能夠在蛋白水平上終止目的基因的表 達，該過程稱為thermotargetron基因打祀或thermotargetron基因失活。
[0032] 圖14為本發(fā)明實施例提供的在熱纖梭菌中成功打祀的thermotargetron識別序 列及打祀效率圖，其中，圖示7個不同基因的thermotargetron識別位點、EBS/IBS相互作 用和"歸巢"效率。7個不同基因及其編碼產物分別為：(^?4((：1 〇1313_0627)，(^11111〇8〇1^ scaffoldin protein;hfat (Clol313_2343), hypothetical formate acetyltransferas e; hyd (C1〇1313_0554)，hydrogenase;Idh(Clo1313_1160)，lactate dehydrogenase;pta( Clol313_1185), phosphotransacetyIase;pyrF(Clol313_1266), orotidine5' -phosphate decarboxylase。野生型TeI3c的識別序列在圖片頂端展示；灰色陰影的堿基表示與野生型 TeI3c II型內含子識別序列相同；箭頭表示thermotargetron插入位點；歸巢效率等于發(fā) 生特異設計位點基因失活的轉化子占 PCR檢測轉化子的比例，標示在圖片的右側。
[0033] 圖15為本發(fā)明實施例提供的熱纖梭菌基因被thermotargetron失活示意圖，其 中，（A) 7個熱纖梭菌基因被thermotargetron失活示意圖。基因組DNA使用平行的線條 表不，基因的5端，3端標不在基因的兩端；基因 ORF使用帶箭頭的空心方框表不，箭頭方 向表示基因的轉錄方向。使用實心黑色方框表示插入基因組中的II型內含子基因，與ORF 空心方框交界處用黑色箭頭(短）標示出II型內含子基因的插入位點。外側檢測引物（黑 色箭頭）橫跨插入位點且任意一條引物與插入位點的距離至少是200bp。內側的檢測引物 (Te680rc)與II型內含子基因正義鏈互補（658nt675nt)。外側引物檢測野生型或突變株的 PCR產物大小如圖右側所示。（B)使用菌落PCR方法檢測7個基因突變株。泳道1，外側引 物檢測野生型熱纖梭菌DSM1313菌株；泳道2,外側引物檢測突變株（如檢測CipA基因失 活的外側引物對為CipA1827s-F與CipA1827s-R，表2);泳道3,以外側正向引物與Te680rc 引物檢測突變株（如檢測CipA基因失活的外側-內側引物對為CipA1827s-F與Te680rc， 表2) ;M，DNA分子質量標準。
[0034] 圖16為本發(fā)明實施例提供的Southerblot檢測TeI3c DNA在不同熱纖梭菌 DSMl 313突變株中的拷貝數(shù)，其中，Southerb lot檢測Te 13c對特異靶位點失活過程中是 否存在"脫靶"現(xiàn)象。提取thermotargetron突變株基因組DNA并使用BamHI，EcoRI雙 酶切后在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離的DNA片段轉印至尼龍膜上（Hybond-NX，GE Healthcare)與地高辛標記的TeI3c DNA特異探針（539nt_710nt)雜交過夜并顯色 (DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I, RocheXM, DNA分子量標 準。Southernblot結果表明，在熱纖梭菌中thermotargetron的"脫祀"率為50%左右（單 插入菌株/單插入菌株+多插入菌株）

【具體實施方式】
[0035] 下述實施例所涉及的質粒與引物具體參見表1和表2。同時所涉及的大腸桿菌 菌株 E.coli HMS174(DE3) (Novagen)用于"歸巢（retrohoming assays)，'試驗，DH5Ct (Life Technologies)用于基因克隆。E.coli細胞置于Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng) (37°C，200rpm)。用于質粒篩選的抗生素濃度為：氨節(jié)青霉素（ampicillin，amp)，100yg/ ml ;氣霉素（chloramphenicol, chi)，25-50 μ g/ml，四環(huán)素（tetracycline, tet) 25 μ g/ml 〇
[0036] 熱纖梭菌（Clostridium thermocellum DSM1313)菌株在改進的 GS-2 培 養(yǎng)[9]中培養(yǎng)，IL GS-2 培養(yǎng)基的配方為：KH2P041. 5g，K2HP04 · 3H202. lg，Urea2. lg， MgC12 · 6H201. 0g，CaC12 · 2H20150mg，F(xiàn)eS04 · 6H201. 25mg，Cysteine-HCllg，MOPS-NalOg， Yeast extract6. 0g，Trisodiumcitrate · 2H203. 0g，ResazurinO. lmg，5. 〇-10g/l 纖維二糖 (GS-2-CB)或微晶纖維素（GS-2-AV)作為主要碳源，pH7.4。熱纖梭菌采用半固體包埋法涂布 平皿[10, 11]，半固體瓊脂濃度為0. 8%(w/v)(GS-2-CB-SS)。質粒篩選時高溫條件下，使用 更穩(wěn)定的甲砜氯霉素（thiamphenicol)代替氯霉素（chloramphenicol),作為篩選抗生素， 其濃度為3-6 μ g/ml。培養(yǎng)基配制完成后，分裝至200ml厭氧瓶中，并使用高純氮（99. 999%) 爆氣5min，除去培養(yǎng)基中的溶氧，迅速蓋上橡膠塞，115°C滅菌高壓蒸汽滅菌20min備用。
[0037] 實施例1
[0038] 全基因合成嗜熱II型內含子元件TeI3c-4c :
[0039] 嗜熱藍聚藻 BP-1 菌株（Thermosynechococcus elongates BP-1)含有 28 種 IIB 型內含子。他們親緣關系很近，被認為是由同一祖先進化而來，橫向轉移進入該微生物的 基因組中[8，12，13]。其在全序列合成了了613〇11型內含子基因（873拉，5'端5?61，3' 端PstI)的同時將其20, 319, 321，337, 339位A，T，A，T，A序列分別突變?yōu)門，A，G，C，T形成 SpeI-BsiwI 酶切位點（序列）。SpeI-BsiwI 酶切片段長 357bp，覆蓋 IBS1-IBS2, EBSl, EBS2， 可以通過酶切連接快速的替換成靶DNA識別序列。另外，野生型TeI3c本身不編碼RT酶， TeI4c編碼的RT酶可以促進TeI3c的"歸巢（retrohoming)"。因此全序列合成了編碼TeI4c 的RT酶的基因（1701nt，5'端PstI, 3'端Xhol，序列)并連接至TeI3c下游，形成TeI3c-4c 內含子（Tel3c的intron，Tel4c的RT酶，圖6)，用于構建嗜熱t(yī)argetron。
[0040] SEQ ID NO. 1 所示為 TeI3c DNA，5'SpeI_3'PstI 的核酸序列：
[0041] actagtaacacccctatcagggtgcgacgcgaaagctagccagatgattgtcccactagcccaacaagc tagaacgggaccggttgttcccccaaccgtagcctaaggaggcatgcgtgactggtaacggtcaggtatgaagccct cccgacaatgaagcccgaaccggaaggttggagccgaatccgtgaggaggaagcaacttcaccagcgtcaggtgata gggagctaggcttgagggtatggtgaacgcaagtgaagtgacgctagaagcctcgttagggtgagcaggccaaagat gctgataggcctgagccaaaatggcaaagcggattggatacgctgctcctgattcagcgtacggggacagcaactcc gccggggtatagtcaccacctaacccctcgtgtcatctggttggaacgcggtaagcccgtatcttcgccttgaacat tcaaggcaggcaaaccgtaaggaatgctgatgggggtgcgggtagaggaggtgggaaaaagcgaatgctagcctgta atgggctagatagggattgagaatgctggcaggacattcaacatcatcccactcgaaagagggcagacttcccgccg gtccccccttacgagaaagtctatagaaccttcctaatggtgacaatgcaaatggcggtgatcttgagtcactggtg cggtcaccaacctgctcaaaaggtagagaggctgtagatgagtatcgtaaaggttgcatgcacaaccggttcctctt aaatgaggggtcctggggggctcgagccggatgcggggaaacttgcacgtccggttcctagggggctagggggcagc gatgcccccctgctacccgacaatgacgctgcag
[0042] (a)序列特征：
[0043] ?長度：873
[0044] 籲類型：核酸序列
[0045] ?鏈型：單鏈
[0046] ?拓撲結構：線性
[0047] (b)分子類型：DNA
[0048] (c)假設：否
[0049] (d)反義：否
[0050] (e)最初來源：嗜熱藍聚藻
[0051] SEQ ID NO. 2 所示為 TeI4c RT DNA, 5'PstI-3'XhoI 的核酸序列：
[0052] ctgcaggaaggagatatacatatgacggtggaccaaaccactggtgcggtcaccaaccaaacggaaaca agetggcacagcataaactggaccaaagccaaccgtgaggtaaagaggctgcaagtgcgtatcgcaaaggctgtgaa ggaaggacgctggggcaaagtgaaagctttgcaatggctcctgacccactcgttctacggcaaagccctcgccgtga aacgggtaactgacaactcaggcagtagaacacctggtgtggacgggataacctggtccacacaagagcagaaaacc caagccataaagtccctcaggagaagaggctataaaccccaacccctgaggcgggtatacatcccgaaagcaaacgg caaacagcgcccgctaggaatcccgacaatgaaggacagggcaatgcaggcactatatgccctagccctagaaccag tcgcggaaaccacagcggaccggaactcctatgggttccgccgagggcgatgtacggcagatgcggcaggacaatgc ttccttgctctggcaaaagccaagtcggctgaacacgtccttgacgctgacatatccggatgctttgataacatcag ccatgagtggctactagccaacactccactggacaaagggatcttacggaaatggcttaaatctgggttcgtctgga aacagcaactcttccccacccatgctgggacacctcagggaggggtaatctccccagttcttgccaatataacccta gatgggatggaagaactgttggccaaacacctcagaggtcaaaaagtcaacctcatccgatatgctgacgattttgt cgtgacgggaaaagatgaggaaaccctggagaaagccagaaacctaatccaggagttcctaaaagaacggggcttga ccctgtcccccgagaagacaaaaatcgtccatattgaggaaggcttcgactttctcggatggaacattcgcaagtac aacggggttcttctcatcaaacccgcgaagaagaacgtgaaagcgttcctcaagaaaatccgagacactctaaggga acttaggacagcaacccaggaaatcgtgatagacacactcaacccaatcattagaggttgggccaactatcacaaag gacaagtctctaaggaaaccttcaaccgagtggacttcgccacctggcacaaattgtggcgatgggcaaggcgccgg cacccaaacaaacctgcccaatgggtgaaggacaaatacttcatcaaaaacggaagcagagactgggtattcggtat ggtgatgaaagacaagaacggggaactgaggaccaaacgcctaatcaaaacctctgacacccgaatccaacgccacg tcaaaatcaaggcagacgccaatccgtttctcccagagtgggcagaatactttgagaaacgcaagaaactcaaaaaa gcccctgctcaatatcggcgcatccgccgagaactatggaagaaacagggtggtatctgtccagtatgcgggggtga aattgagcaagacatgctcactgacatccaccacatattgcccaaacacaagggtggttctgacgacctggataatc ttgtcttaatccacgccaactgccacaaacaggtgcacagccgagatggtcagcacagccggtccctcttgaaagag gggctttgactcgag
[0053] (a)序列特征：
[0054] ?長度：1701
[0055] 籲類型：核酸序列
[0056] 籲鏈型：單鏈
[0057] #拓撲結構：線性
[0058] (b)分子類型：DNA
[0059] (C)假設：否
[0060] (d)反義：否
[0061] (e)最初來源：嗜熱藍聚藻
[0062] 實施例2
[0063] 基于TeI3c_4c的高溫微生物基因打靶載體pHK-TTIA的構建一即 Thermotargetron
[0064] 構建thermotargetron質粒pHK-TTlA質粒過程分三步：
[0065] 第一步，將 C. thermcellum 分子伴侶蛋白 CpnlO (C1〇1313_0432)啟動子 PgroEL， 克隆至TeI3c intron/TeI4RT元件上游。具體過程為使用Ct_PgroEL5-BamHI, Ct_ PgroEL3-SpeI-XhoI-EcoRI引物（表2)從質粒熱纖梭菌DSM1313基因組中擴增groEL啟動 子，PCR產物BamHI, EcoRI酶切后連接入pIKMl質粒[14]獲得pIKMIPgroEL質粒；
[0066] 第二步，將實例 1 合成的 897nt TeI3c 內含子 DNA 序列（Spel/PstI)，SpeI, PstI 雙酶切后克隆進入PlKMlPgroEL質粒對應位點，獲得PIKMlPgr〇EL-TeI3 C質粒；將實 例1合成的1710nt TeI4c RT酶基因序列（PstI/XhoI)，PstI，XhoI雙酶切后連接進入 PIKMlPgroEL-TeI3c質粒對應位點，獲得pIKMI-TTIA質粒。
[0067] 第三步：EcoRI 和 BamHI 酶切 pIKMI-TTIA 質粒，克隆 2. 8-kbPgroEL-TeI3c/TeI4c 元件至pHK對應位點，即獲得thermotargetron質粒pHK-TTIA (參見圖3)。
[0068] 其中，基于TeI3c-4c的大腸桿菌打靶質粒pAC2-TTlA，C，G，T的構建分為兩步：
[0069] 第一步，pIKMI-TTIA質粒Spel，PstI雙酶切片段(含Spel/BsiWI突變位點的 TeI3c)替換 pADC2X-TeI3c-4c 質粒中[15]野生型 TeI3c 片段，獲得 pACD2X-TTlA 質粒；
[0070] 第二步，構建 pACD2X-TTlC，G，T 質粒。C，G，T 表示 IBS3 堿基。以 pACD2X-TeI3c-4c 作為模板，使用TeI3cEBS3mutA，C，G，T/TeI3cIBS3mutT，G，C，A作為引物，突變TeI3c內含 子IBS3 (RNA)和EBS3序列。PCR產物使用BsiWI和PstI酶切后，插入pAC2-TTlA質粒中， 獲得 PACD2-TTI A, C，G，T 質粒(表 1，表 2 )。
[0071] 實施例3
[0072] 以大腸桿菌為宿主測試嗜熱II型內含子元件TeI3c_4c的功能：
[0073] 1)溫度對TeI3c_4c II型內含子在大腸桿菌中的"歸巢"效率的影響 (TeI3c_4c "歸巢"試驗）：
[0074] TeI3c_4c "歸巢"試驗原理為：DIV區(qū)攜帶含有T7啟動子 (acgcgtaatacgactcactataggg)的 TeI3c_4c 內含子供體質粒 pACD2X_TeI3c_4c[15](參見 圖4)可以識別并插入具有氨芐抗性的內含子受體質粒pBRR-3C El，E2(exon)位點(表1)。 PBRR-3C質粒El，E2位點后攜帶一段沒有啟動子的四環(huán)素抗性基因。當供體質粒的TeI3c 內含子"歸巢"至受體質粒El，E2位點后，其DIV區(qū)攜帶的T7啟動子啟動四環(huán)素抗性基因 的表達，使得發(fā)生內含子"歸巢"的大腸桿菌菌株獲得四環(huán)素抗性，因此"歸巢"效率=四環(huán) 素+氨芐雙抗性菌落數(shù)/氨芐抗性菌落數(shù)[8]。
[0075] 具體過程為：
[0076] 將供體質粒 pACD2X-TeI3c-4c (ChlK)和受體質粒 pBRR-3c (AmpK)共同轉化 E. Coli HMS174(DE3)細胞[15]。轉化子培養(yǎng)物在5ml液體氨芐青霉素和氯霉素抗性（AmpK+Chl K) LB培養(yǎng)基37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。取5 μ 1過夜培養(yǎng)液轉接至相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ih 后加入500 μ M終濃度的IPTG，置于37°C -48°C培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后稀釋至合適濃度涂布于氨 芐(AmpK)或氨芐-四環(huán)素（AmpK+Tet K)抗性平皿中，37°C培養(yǎng)過夜。供體質粒內含子"歸巢" 至受體質粒E1，E2位點后，T7啟動子隨TeI3c RNA "歸巢"至四環(huán)素抗性（tetK)基因上游， 即啟動該基因的表達，從而使得發(fā)生RNA "歸巢"的菌株獲得四環(huán)素抗性，通過檢測群落中 四環(huán)素抗性轉化子的數(shù)量即可計算出嗜熱t(yī)argetron在不同溫度下的歸巢效率。"歸巢"效 率=(AmpK+TetK)/AmpK。為了排除自發(fā)突變對實驗結果的影響，E.Coli HMS174(DE3)對數(shù) 期細胞以50%接種量接種于含IPTG的抗性培養(yǎng)基中（AmpK+TetK，500 μ M IPTG)作為對照， 置于上述實驗相同溫度下培養(yǎng)。
[0077] 使用上述方法測定了 TeI3c-4c在不同的誘導溫度下的"歸巢"效率(參見圖7)。 與1^1.1^池11型內含子"歸巢"效率在371：以上迅速的降低不同[8]，1^13(3-4(311型內含子 在高溫時歸巢效率逐漸提高。TeI3 C-4cII型內含子在37°C時基本上沒有活性，但當溫度提 高至>42°C其歸巢效率迅速提高至100% (參見圖7)
[0078] 2) Tel3c/4c內含子靶位點識別規(guī)律及重新編碼：
[0079] ① Tel3c/4c內含子隨機打靶實驗
[0080] 將上述II型內含子受體質粒PBRR-3C靶位點-35--13/+2-20替換為隨機堿基， +1--12為野生型IBS1，IBS2位點替換成隨機序列(合成隨機序列)。進行TeI3c-4c"歸巢" 試驗（48°C)。具體過程為：將供體質粒pACD2X-TeI3c-4c (ChlR)和受體質粒pBRR-3c (隨 機，AmpK)共同轉化E. Coli HMS174(DE3)細胞。轉化子培養(yǎng)物在5ml液體氨芐青霉素和氯 霉素抗性（AmpK+Chl K) LB培養(yǎng)基37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。取5 μ 1過夜培養(yǎng)液轉接至 相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ih后加入500 μ M終濃度的IPTG，置于48°C培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后稀釋至合 適濃度涂布于氨芐（AmpK)或氨芐-四環(huán)素（Amp K+TetK)抗性平皿中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取四 環(huán)素/氨芐抗性的菌落進行測序，分析TeI3c-4c II型內含子高溫條件下（48°C )插入位點 的堿基偏好性。
[0081] TeI3c-4c對靶DNA位點的識別由TeI3c RNA(圖6)和RT酶共同決定(如圖8所示)。 TeI3c RNA可以識別靶DNA位點任意的IBS1，IBS2, IBS3序列但必須與TeI3c RNA EBS1， EBS2，EBS3滿足Watson-Crick堿基互補配對原則（圖8A)。如圖8-A所示TeI3c EBSl, 2位 點分別由6個和5個堿基組成且EBS2與EBSl間隔兩個隨機堿基，EBS3僅由1個堿基組成， 因此DNA祀位點IBS1，2, 3應由14個隨機堿基組成（即ηηηηηηηηηηηηηη，η代表隨機堿基， 圖8-Α)。另外，隨機打靶實驗表明TeI4c RT酶對IBS2上游-14, -15, -16位的WAA(W=A/ T)堿基具有偏好性(如圖8-B)，因此由TeI3c RNA(圖6)和RT酶共同決定的識別序列為 WAAnnnnnnnnnnnnnn(W=A/T, n=A/T/G/C)〇
[0082] 仔細觀察TeI3c II型內含子的二級結構我們發(fā)現(xiàn)（圖6)，RNA內部IBS3序列距離 IBS1，2 (RNA)，EBS1，2, 3序列較遠，不能通過一次突變PCR重新編碼。又因為針對A，G，C，T 四種不同IBS3(DNA)的打靶質粒pACD2-TTlA，G，C，T歸巢效率為22%-106% (圖8-C)，且 EBS3-IBS3為U-A配對時歸巢效率為100%。因此，為了方便嗜熱II型內含子打靶載體的重 新編碼，進而規(guī)定IBS3(DNA)為A，即TeI3c_4c識別序列為：WAAnnnnnnnnnnnnnA。
[0083] ②Thermotargetron載體重新編碼
[0084] 嗜熱II型內含子打靶載體重新編碼是指：根據(jù)特異DNA靶 點（WAAnnnnnnnnnnnnnA) 突變TeI3c_4c II型內含子革巴DNA識別序列 (EBS1，2, 3-IBS1，2, 3(RNA))，獲得特異DNA靶位點打靶載體的過程，通常分為三步：1)在靶 基因內部尋找WAAnnnnnnnnnnnnnA識別位點；2)根據(jù)識別位點IBS2, I (DNA)，使用PCR方 法突變 TeI3c RNA 中的 EBS2, 1-IBS2, I (RNA) ;3) SpeI-BsiWI 雙酶切 PCR 片段（? 400-bp) 替換打靶載體的對應區(qū)域(參見圖5)。
[0085] ③Tel3c/4c內含子失活大腸桿菌中IacZ基因
[0086] 根據(jù)TeI3c_4c II型內含子的祀DNA序列識別規(guī)律（WAAnnnnnnnnnnnnnA)構建了 基于實施例2中pA⑶2X-TT1A質粒的3個大腸桿菌β -半乳糖苷酶基因（IacZ)失活載體： lacZ60a，lacZ369a和lacZ2586a (圖9,表I) (a, s分別表示識別序列在反、正義鏈；阿拉伯 數(shù)字表示TeI3c插入位點p ;令基因起始密碼子第一位至IBS3 (包括A)的堿基數(shù)為n，當 插入s鏈時p=n-l，插入a鏈時p=n)。IacZ基因打祀載體構建僅需簡單三步：1)在IacZ基 因序列中尋找WAAnnnnnnnnnnnnnA內含子識別祀位點（圖8) ;2)根據(jù)祀位點IBSl, 2 (DNA) 序列，設計重疊 PCR(overlapPCR)引物，突變TeI3c內部EBSl，2;IBSl，2(RNA)序列(表2， 如用于構建 lacZ60a 的引物為 LacZ60aIBS12-TeI3cUNI，LacZ60aEBS2_LacZ60aEBSla，其中 TeI3cUNI為重編碼通用引物);3)將重疊 PCR擴增產物SpeI-BsiWI酶切后置換打靶載體中 對應區(qū)段，即完成特異基因打靶載體的構建(表1)。
[0087] IacZ基因打靶載體構建完成后，轉化E. coli HMS174(DE3)細胞，轉化子過夜培養(yǎng) 物轉接至LB培養(yǎng)基中48°C培養(yǎng)1小時后使用IPTG誘導15min-lh，獲得的培養(yǎng)物稀釋涂布 在含有IPTG/X-gal的平皿上。由于IacZ基因可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍，使整個培養(yǎng)菌落變 藍，該基因失活后在IPTG/X-gal平板上形成的菌落為白色，因此白色菌落與總菌落數(shù)的 比值即為IacZ基因的失活效率（圖10)。進一步使用lacZ30s/lacZ1850a, lacZ1850s/ lacZ3060a, lacZ3060a/TeI3c608rc，lacZ30s/TeI3c608rc，lacZ1850s/TeI3c420s (表 2)五 對引物檢測藍色或白色克?。↖acZ基因失活后失去將X-gal轉化成藍色顯色物質的能力） (圖11)。連續(xù)傳代丟失IacZ突變株thermotargetron質粒，使用southerblot檢測是否存 在內含子"脫靶"現(xiàn)象（圖12)。
[0088] 通過以上實驗測定了 500μΜ IPTG濃度下，不同誘導時間（15min-60min)對TeI3c 對IacZ基因的失活效率的影響。隨著IPTG量的增加和誘導時間的延長，白色菌落的數(shù)量逐 漸增加(誘導15分鐘，IacZ失活率0%-2%，誘導1小時，IacZ失活率14%-51%)(圖10)。檢 測PCR和測序結果顯示，所有白色克隆IacZ基因都被TeI3c-4c intron精確失活（圖11)。 另外，southern blot結果顯示，lacZ2586a在IPTG不同的誘導階段，對所有突變株中都為 單插入（圖12)。但是當IPTG誘導時間超過30min后lacZ60a，lacZ369a出現(xiàn)了多插入的 情況（即存在TeI3c脫祀現(xiàn)象)。同樣的脫祀現(xiàn)象在LL LtrB和EcI5intron中是很少見的 [2, 3]。
[0089] 實施例4
[0090] 使用thermotargetron失活6個熱纖梭菌基因：
[0091] pHK-TTIA由大腸桿菌-熱纖梭菌穿梭質粒pHK和嗜熱II型內含子元件 (TeI3c-4c)組成，其靶向基因失活的原理與LI. LtrB II型內含子相似（圖13)。
[0092] 選擇了熱纖梭菌中6個具有代表性的基因作為thermotargetron失活的革巴 基因，分別為纖維小體腳架蛋白基因 cipA (Cl〇1313_1827)，假定的甲酸脫氫酶的基因 hfat (Clol313_2343)，假定的氫酶的基因 hyd (C1〇1313_0554)，乳酸脫氫酶的基因 Idh (C1〇1313_1160)，磷酸乙?；D移酶的基因 pta (Clol313_1185)和乳清酸核苷-5'磷酸脫 羧酶 PyrF (Clol313_1266)(圖 14)。
[0093] 參照基因打祀載體重新編碼的步驟構建了 7個termotargetron基因打革巴載 體（圖14,表1，表2)，分別為：pHK-TTlA-CipA1827s (舉例，參照載體重編碼步驟，使用 CipA1827sIBS12-TeI3cUNI，CipA1827sEBS2-CipA1827sEBSla 引物構建），pHK-TTlA-Hfatl6 5s，pHK-TTlA-Hydl525a，pHK-TTlA-Ldh309s，pHK-TTlA-Ldh508s，pHK-TTlA-Pta318a，pHK-T TlA_PyrF281s(表1，表2)。將7個thermotargetron打祀載體，分別轉化熱纖梭菌DSM1313 菌株。轉化子使用PCR檢測（圖15,表2)，并進一步Southerblot驗證（圖16)。測序突變 株培養(yǎng)液轉接至4ml無抗性GS-2培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代至質粒丟失。質粒丟失后使用TeI3c 特異探針（TeI3c539_710nt，172bp，probel72_F/R 表 2) Southerblot (DIG-High Prime DNALabeling Detection Starter Kit I，Roche)檢測 TeI3c 在突變株基因組中的拷貝數(shù)。
[0094] Thermotargetron質粒轉化熱纖梭菌的效率通常為50-200CFU/ μ g DNA。轉化子 使用插入位點兩側或內側引物直接檢測TeI3c II型內含子在靶位點的插入情況（圖15,表 2)。PCR結果表明thennotargetiOn對靶基因進行的正確的失活且效率為67%-100%(圖14) (打靶效率等于基因失活克隆數(shù)與檢測克隆數(shù)的比值)。對突變株的Southemblot結果表 明 Cipal827s，Pta318a，Ldh508s，Hfatl65s 為單插入突變株；Ldh309s，Pyrf281s，Hydl525a 為多插入突變株。單插入率為57% (圖16)。
[0095] 參考文獻
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[0113] 表I質粒列表

【權利要求】
1. 一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件，其特征在于：元件為嗜熱II型內含子 元件TeI3c-4c，其由序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示。
2. -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，其特征在于：載體為具有嗜熱微生物遺傳 改造的基因元件打靶載體，其含有復制起始位點、耐熱復制蛋白、多克隆位點、嗜熱II型內 含子元件TeI3c_4c和啟動子元件。
3. 按權利要求2所述的適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，其特征在：所述嗜熱II型 內含子元件TeI3c-4c為序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示；啟動子源于嗜熱微生物 啟動子。
4. 一種嗜熱微生物遺傳改造的應用，其特征在于：利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基 因元件打靶載體應用于嗜熱微生物中，進而使嗜熱微生物基因靶向失活。
5. 按權利要求4所述的嗜熱微生物遺傳改造的應用，其特征在于：由所述嗜熱微生物 遺傳改造的基因元件打靶載體中基因元件與嗜熱微生物的識別位點結合，進而使嗜熱微生 物基因靶向失活。
6. 按權利要求5所述的嗜熱微生物遺傳改造的應用，其特征在于：所述識別位點為1) 革巴DNA識別位點17個堿基具有WAAnnnnnnnnnnnnnn (W=A或Τ，N=A, T, G, C)特征，確保能夠 被TeI3c-4c正確識別；2) TeI3c-4c II型內含子元件EBS1，2, 3與靶序列IBS1，2, 3(DNA) 滿足Watson-Crick堿基互補配對原則，確保能被RNA正確識別。
7. 按權利要求6所述的嗜熱微生物遺傳改造的應用，其特征在于：所述識別位點為 WAAnnnnnnnnnnnnnA/T/G/C，W代表A或T堿基，η代表任意堿基，A/T/G/C表示EBS3序列可 以為任意一種堿基。
【文檔編號】C12N15/63GK104293777SQ201410155715
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權日:2013年4月17日
【發(fā)明者】崔球, 洪偉, 喬治·莫爾, 艾倫·萊伯維茲, 劉亞君, 馮銀剛 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所, 德克薩斯大學體系董事會