一種基于高通量測(cè)序的多樣本的一個(gè)或多個(gè)靶序列的檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多樣本的一個(gè)或多個(gè)靶序列的方法或試劑盒。本發(fā)明整合了多重?cái)U(kuò)增技術(shù)、連接技術(shù)和PCR?index技術(shù)，提供了一種新型標(biāo)記技術(shù)方案，使用特異性捕獲引物擴(kuò)增靶序列，利用連接反應(yīng)在PCR產(chǎn)物的兩端各引入一個(gè)帶U堿基且序列已知的接頭，用USER酶切開(kāi)U堿基，根據(jù)接頭已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，并利用PCR反應(yīng)在PCR產(chǎn)物兩端分別引入標(biāo)簽引物，通過(guò)PCR產(chǎn)物兩端引入的標(biāo)簽引物序列特異地得到PCR產(chǎn)物的樣本信息，再根據(jù)每個(gè)靶序列的捕獲引物序列將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的每個(gè)靶序列上。
【專利說(shuō)明】
一種基于高通量測(cè)序的多樣本的一個(gè)或多個(gè)靶序列的檢測(cè) 方法和試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的靶序列的方法和試劑 盒，特別是涉及一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多樣本的一個(gè)或多個(gè)靶序列的方法或試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 新一代高通量測(cè)序儀的出現(xiàn)大大降低了核酸測(cè)序成本，其具有高通量、低成本、測(cè) 序錯(cuò)誤率低等特點(diǎn)。應(yīng)用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)混合的核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，同 時(shí)分辨和測(cè)出每個(gè)獨(dú)立的序列，使得該測(cè)序技術(shù)在高通量標(biāo)記開(kāi)發(fā)成為可能。
[0003] 隨著高通量測(cè)序技術(shù)在人類疾病研究、微生物基因組測(cè)序等方面的廣泛開(kāi)展，如 何最大限度發(fā)揮第二代測(cè)序技術(shù)的高通量和大數(shù)據(jù)量等特點(diǎn)，降低單樣本測(cè)序成本成為下 一步測(cè)序技術(shù)的發(fā)展方向，具有很大的市場(chǎng)前景和價(jià)值。
[0004] 然而，常規(guī)的PCR-index技術(shù)，對(duì)于每個(gè)PCR產(chǎn)物的index標(biāo)簽都是需要單獨(dú)進(jìn)行 擴(kuò)增標(biāo)記，然后將所有的產(chǎn)物混合測(cè)序，當(dāng)PCR片段較多時(shí)，不僅操作繁瑣，而且很難控制 片段混合的均一性，會(huì)導(dǎo)致最終測(cè)序結(jié)果中片段之間數(shù)據(jù)量差距巨大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大量樣本中的靶序列相關(guān)序列同時(shí)進(jìn)行 測(cè)序分析，解決傳統(tǒng)方法通量低、測(cè)序成本高的問(wèn)題，擴(kuò)大第二代測(cè)序技術(shù)在PCR測(cè)序領(lǐng)域 的應(yīng)用。
[0006] 針對(duì)本發(fā)明的目的，本發(fā)明整合了多重?cái)U(kuò)增技術(shù)、連接技術(shù)和PCR-index技術(shù)，提 供了一種新型標(biāo)記技術(shù)方案，使用特異性捕獲引物擴(kuò)增靶序列（第一輪擴(kuò)增），利用連接反 應(yīng)在第一輪PCR產(chǎn)物的兩端各引入一個(gè)帶U堿基且序列已知的接頭，用USER酶切開(kāi)U堿 基，根據(jù)接頭已知序列設(shè)計(jì)標(biāo)簽引物，并利用PCR反應(yīng)（第二輪擴(kuò)增）在第二輪PCR產(chǎn)物兩 端分別引入標(biāo)簽引物序列，通過(guò)第二輪PCR產(chǎn)物兩端引入的標(biāo)簽引物序列可以特異地得到 PCR產(chǎn)物的樣本信息，再根據(jù)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物中所含有的捕獲引物序列將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到 樣本的每個(gè)靶序列上。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè) 或多個(gè)靶序列的方法，包括以下步驟：
[0008] 第一輪擴(kuò)增：使用根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的捕獲引物，在適于多重?cái)U(kuò)增目的核酸的條件 下分別對(duì)各樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶； [0009] 第二輪擴(kuò)增：使用第一輪擴(kuò)增得到的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增以使第二輪擴(kuò) 增產(chǎn)物上帶有可對(duì)各樣本進(jìn)行區(qū)分的標(biāo)簽；
[0010] 混合與回收：將各樣本的富集擴(kuò)增產(chǎn)物均一地混合在一起，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū) 域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶；
[0011] 測(cè)序：將回收的DNA混合物進(jìn)行測(cè)序；
[0012] 分析：基于每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先與樣本 --對(duì)應(yīng)；根據(jù)每個(gè)靶序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的靶序列上。
[0013] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣 本的一個(gè)或多個(gè)靶序列的方法，包括以下步驟：
[0014] 第一輪擴(kuò)增：使用根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的捕獲引物，在適于多重?cái)U(kuò)增目的核酸的條件 下分別對(duì)各樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶， 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)并加 A尾；
[0015] 接頭設(shè)計(jì)：所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3'T末端，其中，一個(gè)回文序列位 于所述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn)定形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
[0016] 連接接頭（Adaptor):通過(guò)連接反應(yīng)在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端加上帶U堿基的接 頭；進(jìn)行U堿基剪切，并用單鏈消化酶消化剩余的引物；
[0017] 標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)：所述標(biāo)簽引物包含標(biāo)簽序列和與所述接頭的5'端回文序列互補(bǔ) 的序列，其中，所述標(biāo)簽序列位于所述標(biāo)簽引物的5'端，其中，標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù) 量>樣本數(shù)量；
[0018] 第二輪擴(kuò)增：使用針對(duì)接頭和各樣本設(shè)計(jì)的標(biāo)簽（index)引物，以對(duì)應(yīng)樣本連接 接頭后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行富集擴(kuò)增，并用單鏈消化酶消化剩余的引物，以分別給每個(gè)樣 本的擴(kuò)增產(chǎn)物都加上可以區(qū)分的標(biāo)簽引物序列；
[0019] 混合與回收：將各樣本的富集擴(kuò)增產(chǎn)物均一地混合在一起，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū) 域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶；
[0020] 測(cè)序：將回收的DNA混合物進(jìn)行測(cè)序；
[0021] 分析：基于每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先 與樣本--對(duì)應(yīng)；根據(jù)每個(gè)靶序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的每個(gè)靶序 列上。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè) 靶序列的方法，包括以下步驟：
[0023] 1)引物和接頭設(shè)計(jì)：
[0024] 第一輪擴(kuò)增引物：根據(jù)待測(cè)的靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲引物，組成第一輪擴(kuò)增引物 組合；
[0025] 接頭序列：設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)接頭序列，所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3' T 末端，其中，一個(gè)回文序列位于所述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn) 定形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
[0026] 第二輪擴(kuò)增引物：根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)計(jì)不同的標(biāo)簽序列，并在其3'端加上與所述接 頭的5'端回文序列互補(bǔ)的序列組成富集擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物，組成第二輪擴(kuò)增引物組合， 其中，由于第二輪擴(kuò)增的靶序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引物和反 向標(biāo)簽引物相同，設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物的數(shù)量遵循以下規(guī)則：標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù)量> 樣本數(shù)量，以及其中，在第二輪擴(kuò)增引物中，標(biāo)簽序列上添加的序列與第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中連 接的接頭的5'端回文序列互補(bǔ)；
[0027] 2)第一輪擴(kuò)增（PCR捕獲）：將擴(kuò)增靶序列的捕獲引物混合，在適于多重?cái)U(kuò)增目的 核酸的條件下分別對(duì)各樣本進(jìn)行擴(kuò)增；回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶， 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)末端都加上A尾；
[0028] 3)連接接頭（Adaptor):通過(guò)連接反應(yīng)在擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加上帶U堿基的接頭，使用 USER酶打斷U堿基，用單鏈消化酶消化剩余的引物；
[0029] 4)第二輪擴(kuò)增（產(chǎn)物富集）：根據(jù)不同樣本和接頭設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物，使用對(duì)應(yīng)樣本 連接接頭處理后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行富集擴(kuò)增，以分別給每個(gè)樣本的擴(kuò)增引物都加上可以 區(qū)分的標(biāo)簽引物序列；用單鏈消化酶消化剩余的引物，并進(jìn)行純化；
[0030] 5)混合與回收：將各樣本的富集產(chǎn)物均一地混合在一起；回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域 范圍之內(nèi)的所有DNA條帶；
[0031] 6)測(cè)序：將DNA混合物進(jìn)行測(cè)序；
[0032] 7)分析：基于每個(gè)樣本獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先與樣本-- 對(duì)應(yīng)；根據(jù)每個(gè)靶序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的每個(gè)靶序列上。
[0033] 優(yōu)選地，步驟1中，所述標(biāo)簽序列的長(zhǎng)度可以為5_20bp，更優(yōu)選地，所述標(biāo)簽序列 的長(zhǎng)度可以為6-8bp ;所述接頭序列中包含兩個(gè)區(qū)域的回文序列，優(yōu)選地，每個(gè)回文序列可 以為8-15bp (最優(yōu)選為15bp)。
[0034] 優(yōu)選地，步驟2中，擴(kuò)增所采用的體系為高保真多重PCR反應(yīng)體系，以減少擴(kuò)增所 帶來(lái)的DNA突變，并保證各目的片段能得到有效擴(kuò)增；
[0035] 優(yōu)選地，步驟2中，PCR擴(kuò)增進(jìn)行18-20個(gè)循環(huán)。
[0036] 優(yōu)選地，步驟4中，擴(kuò)增所采用的酶為高保真DNA聚合酶，由此減少擴(kuò)增帶來(lái)的DNA 突變率。
[0037] 優(yōu)選地，步驟2中的末端修復(fù)、加 A尾反應(yīng)以及步驟3中的連接反應(yīng)所用試劑分 別為 Neb 推薦二代建庫(kù)試劑盒TSfEBNexl? End Repair Module、NEKNext? dA-Tailing Module和HEKlSfext? Quick Ligation Module。優(yōu)選地，步驟3和4中所用的單鏈消化酶 為核酸外切酶I (Exonuclease I)，該酶是單鏈特異性3' 一 5'核酸外切酶，不分解雙鏈DNA 及 RNA。
[0038] 優(yōu)選地，步驟4中第二輪擴(kuò)增進(jìn)行15-18個(gè)循環(huán)。
[0039] 優(yōu)選地，步驟6中測(cè)序利用二代測(cè)序技術(shù)，優(yōu)選的是pair-End技術(shù)（例如 Illumina Hiseq2000，Illumina Hiseq2500 和 Illumina Miseq)進(jìn)行測(cè)序，獲得 DNA 混合 物的序列。
[0040] 另一方面，本發(fā)明還提供一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多 個(gè)靶序列的試劑盒，其中，所述試劑盒包括以下引物 ：
[0041] 第一輪擴(kuò)增引物：根據(jù)待測(cè)的靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲引物，組成第一輪擴(kuò)增引物 組合；
[0042] 接頭序列：一個(gè)或多個(gè)接頭序列，所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3'T末端， 其中，一個(gè)回文序列位于所述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn)定形成 發(fā)卡結(jié)構(gòu)；和/或
[0043] 第二輪擴(kuò)增引物：根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)計(jì)不同的標(biāo)簽序列，并在其3'端加上與所述接 頭的5'端回文序列互補(bǔ)的序列組成富集擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物，組成第二輪擴(kuò)增引物組合， 其中，由于第二輪擴(kuò)增的靶序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引物和反 向標(biāo)簽引物相同，設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物的數(shù)量遵循以下規(guī)則：標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù)量> 樣本數(shù)量，以及其中，在第二輪擴(kuò)增引物中，標(biāo)簽序列上添加的序列與第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中連 接的接頭的5'端回文序列互補(bǔ)。
[0044] 優(yōu)選地，在本發(fā)明中，所述樣本的數(shù)量可為：樣本數(shù)量 <可設(shè)計(jì)的標(biāo)簽序列的數(shù) 量X可設(shè)計(jì)的接頭的數(shù)量。
[0045] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種基于高通量測(cè)序的標(biāo)記和捕獲多個(gè)（10個(gè)）樣本的 Wilson綜合征相關(guān)的ATP7B基因的一個(gè)或多個(gè)（21個(gè)）外顯子的試劑盒，其中所述外顯子 為選自 EX0N1、EX0N2、EX0N3、EX0N4、EX0N5、EX0N6、EX0N7、EX0N8、EX0N9、EX0N10、EX0N11、 EX0N12、EX0N13、EX0N14、EX0N15、EX0N16、EX0N17、EX0N18、EX0N19、EX0N20、EX0N21 中的一 種或多種；所述試劑盒包括如下引物和接頭：
[0046] 第一輪擴(kuò)增引物包括選自下列中的一對(duì)或多對(duì)：
[0047]
[0048]
[0049] 用于連接在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物兩端的具有如下序列的接頭：
[0050] ADP1:5'P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-s-T-3'
[0051] ADP2 :5'P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-s-T-3' ；
[0052] 第二輪擴(kuò)增引物包括選自下列標(biāo)簽引物中的一種或多種標(biāo)簽引物組成的引物對(duì)， 其中劃?rùn)M線部分為與第一輪產(chǎn)物中連接的接頭的5'端回文區(qū)域互補(bǔ)的序列：
[0063] 其中，由于第二輪擴(kuò)增時(shí)，靶序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽 引物和反向標(biāo)簽引物相同。
[0064] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0065] 本發(fā)明使用特異性的捕獲引物（第一輪擴(kuò)增引物）擴(kuò)增靶序列，通過(guò)連接反應(yīng)將 帶有U堿基的接頭（Adaptor)連接到靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端，用USER酶切開(kāi)U堿基后，通 過(guò)采用標(biāo)簽序列+接頭序列組成的第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，最終在PCR產(chǎn)物的5'末端添 加了標(biāo)簽引物序列。通過(guò)對(duì)每個(gè)樣本都引入獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列，在第二代高通量測(cè)序技 術(shù)檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果都可以通過(guò)其獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列找回，再根據(jù)每個(gè)靶序 列的捕獲引物序列將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的每個(gè)靶序列上，因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于同時(shí) 檢測(cè)大量樣本的多個(gè)不同基因位點(diǎn)，大大降低了測(cè)序成本。
【附圖說(shuō)明】
[0066] 圖1是本發(fā)明的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的靶序列的方法的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 現(xiàn)將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì) 本發(fā)明的限定。
[0068] 以下實(shí)施例中所使用的設(shè)備和試劑如下：NEBNext? End Repair Module、 NEBNext? dA-Tailing Module 和 NEBNext? Quick Ligation Module，核酸外切酶 Takara (Exonuclease I(E.coli))。
[0069] 實(shí)施例1
[0070] Wilson 綜合征相關(guān) ATP7B 基因 （NCBI Gene ID:540)的 21 個(gè)外顯子（EX0N1、 EX0N2、EX0N3、EX0N4、EX0N5、EX0N6、EX0N7、EX0N8、EX0N9、EX0N10、EX0N11、EX0N12、EX0N13、 EX0N14、EX0N15、EX0N16、EX0N17、EX0N18、EX0N19、EX0N20 和 EX0N21)測(cè)序，共 10 例臨床樣 本：
[0071] 1)引物和接頭設(shè)計(jì)：
[0072] 針對(duì)ATP7B基因的21個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲引物，相關(guān)參數(shù)：Tm值 58. 0°C - 65. 0°C，GC 值 40. 0% - 60. 0%，引物大小 23±3bp，目的片段大小為 150-300bp， 所設(shè)計(jì)的引物如下：
[0073]
[0074]

[0075] 根據(jù)10個(gè)樣本設(shè)計(jì)2個(gè)接頭，接頭為單鏈DNA，序列中包含兩個(gè)區(qū)域（每個(gè)區(qū)域長(zhǎng) 度為15bp)的回文序列、一個(gè)U堿基和3' T末端，可形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所設(shè)計(jì)的接頭序 列如下：
[0076] ADP1:5'P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-s-T-3'
[0077] ADP2 :5'P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-s-T-3'
[0078] 按照以下規(guī)則設(shè)計(jì)標(biāo)簽引物：標(biāo)簽引物包含標(biāo)簽序列和與接頭的5'端回文序列 互補(bǔ)的序列，其中，標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭序列的數(shù)量>樣本數(shù)量，在本實(shí)施例中，根據(jù)10 個(gè)樣本和2個(gè)接頭設(shè)計(jì)10條標(biāo)簽引物，即，在與接頭的5'端回文序列互補(bǔ)的序列的5'端 加上可以區(qū)分的標(biāo)簽序列（6bp)構(gòu)成標(biāo)簽引物，其中，由于第二輪擴(kuò)增的靶序列（第一輪擴(kuò) 增產(chǎn)物連接接頭后的產(chǎn)物）兩端連接的接頭的回文序列相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引 物和反向標(biāo)簽引物相同。所設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物如下，其中劃?rùn)M線部分為與第一輪產(chǎn)物中連接 的接頭的5'端回文區(qū)域互補(bǔ)的序列：
[0079] ADP1A ：GCTCATTCGAGCTTCTGTCCT
[0089] 2)第一輪擴(kuò)增（PCR捕獲）：
[0090] 每對(duì)捕獲引物單獨(dú)調(diào)試合格后，分別針對(duì)各臨床樣本，將21對(duì)引物分別稀釋到 100 μ M，然后等量混合，按以下體系和條件擴(kuò)增：
[0091]
[0092] 反應(yīng)條件：
[0093] 95 °C 10 分鐘；
[0094] 95°C 30 秒；58°C 5 分鐘（20 個(gè)循環(huán)）；
[0095] 72 °C 7 分鐘。
[0096] 產(chǎn)物回收：切膠回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶（150-300bp)。
[0097] 末端修復(fù)：按照以下反應(yīng)體系和條件對(duì)上述回收產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)：
[0098]
[0099] 反應(yīng)條件：
[0100] 20 °C 30min
[0101] 65 °C 20min
[0102] 將所得產(chǎn)物進(jìn)行柱純化，最終50 μ L洗脫。
[0103] 加 A尾：按照以下反應(yīng)體系和條件對(duì)上述產(chǎn)物片段3'端加 A尾： 「01041
[0105] 反應(yīng)條件：37°C 30min, 65°C 20min。
[0106] 將所得產(chǎn)物進(jìn)行柱純化，最終30 μ L洗脫。
[0107] 3)連接接頭
[0108] 連接反應(yīng)：按照以下反應(yīng)體系和條件在上述產(chǎn)物片段兩端加上接頭：
[0109]
[0110] 反應(yīng)條件：2(TC 15min，12°C 30min，65°C lOmin。
[0111] 其中，在第二輪擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物中，與標(biāo)簽序列3'端連接的序列是與第一輪 擴(kuò)增產(chǎn)物中連接的接頭的5'端回文序列互補(bǔ)的序列，每個(gè)樣本在第一輪產(chǎn)物中連接的接頭 和在第二輪擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物如下表一所示。
[0112] USER酶和Exonuclease I酶消化：在上述體系中添加 lyL USER酶，37 °C反應(yīng) 30min，以切開(kāi)接頭中的U堿基，然后加入1 μ L Exonuclease I酶，37°C反應(yīng)30min以消化 體系中殘留的引物單鏈。對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行柱純化，最終50 μ L洗脫。
[0113] 4)第二輪擴(kuò)增（產(chǎn)物富集）使用上述根據(jù)樣本和接頭設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物，以對(duì)應(yīng)樣 本連接接頭處理后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行富集擴(kuò)增，以分別給每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物再加上可 以區(qū)分的標(biāo)簽引物序列，反應(yīng)體系和條件如下：
[0114]
[0115]
[0116] 反應(yīng)條件：95°C lOmin ;95°C lmin，50°C 5min，72°C lmin(15-18 個(gè)循環(huán)）；
[0117] 其中，第一輪產(chǎn)物中連接的接頭和第二輪產(chǎn)物中所使用的標(biāo)簽引物如下表一所 示：
[0118] 表一
[0119]
[0120] 引物消化和產(chǎn)物回收：擴(kuò)增產(chǎn)物用單鏈消化酶消化剩余的引物，并進(jìn)行純化，回收 所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶；
[0121] 5)混合與回收：將針對(duì)各臨床樣本的帶有標(biāo)記序列的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)濃 度均一的混合在一起，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶；
[0122] 6)測(cè)序：將回收的DNA混合物，采用Illumina Miseq，PE300進(jìn)行測(cè)序，獲得DNA 混合物的序列。
[0123] 7)分析：Illumina Miseq產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果是一系列DNA序列，通過(guò)查找測(cè)序結(jié)果 中10個(gè)樣本各自獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列（接頭序列和標(biāo)簽序列的組合），將獲得的測(cè)序結(jié)果 首先與樣本一一對(duì)應(yīng)，然后根據(jù)21個(gè)外顯子的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的 每個(gè)靶序列上。所有的10個(gè)樣本的21個(gè)外顯子都能夠在測(cè)序結(jié)果中找到對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，每 個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的reads數(shù)如下表二所示，10個(gè)樣本之間reads數(shù)差異最大在3倍左右，21個(gè) 外顯子序列對(duì)應(yīng)的reads差異最大在10倍左右（數(shù)據(jù)參見(jiàn)表三，以1-2#樣本為例），表明 我們的多樣本標(biāo)記方法能夠有效的區(qū)分每個(gè)標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的DNA序列。
[0124] 表二每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的reads數(shù)和GC數(shù)
[0125]
[0127] 表三21個(gè)外顯子序列對(duì)應(yīng)的reads數(shù)（以1-2#樣本為例）
[0128]

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè)祀序列的方法，包括W下 步驟： 第一輪擴(kuò)增：使用根據(jù)祀序列設(shè)計(jì)的捕獲引物，在適于多重?cái)U(kuò)增目的核酸的條件下分 別對(duì)各樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶； 第二輪擴(kuò)增：使用第一輪擴(kuò)增得到的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增W使第二輪擴(kuò)增產(chǎn) 物上帶有可對(duì)各樣本進(jìn)行區(qū)分的標(biāo)簽； 混合與回收：將各樣本的富集擴(kuò)增產(chǎn)物均一地混合在一起，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范 圍之內(nèi)的所有DNA條帶； 測(cè)序；將回收的DNA混合物進(jìn)行測(cè)序； 分析：基于每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先與樣本一一對(duì) 應(yīng)；根據(jù)每個(gè)祀序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的每個(gè)祀序列上。2. -種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè)祀序列的方法，包括W下 步驟： 第一輪擴(kuò)增：使用根據(jù)祀序列設(shè)計(jì)的捕獲引物，在適于多重?cái)U(kuò)增目的核酸的條件下分 別對(duì)各樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶，對(duì)擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)并加 A尾； 接頭設(shè)計(jì)：所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3'T末端，其中，一個(gè)回文序列位于所 述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn)定形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 連接接頭：通過(guò)連接反應(yīng)在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端加上帶U堿基的接頭；進(jìn)行U堿基 剪切，并用單鏈消化酶消化剩余的引物； 標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)：所述標(biāo)簽引物包含標(biāo)簽序列和與所述接頭的5'端回文序列互補(bǔ)的序 列，其中，所述標(biāo)簽序列位于所述標(biāo)簽引物的5'端，其中，標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù)量> 樣本數(shù)量； 第二輪擴(kuò)增：使用針對(duì)接頭和各樣本設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物，W對(duì)應(yīng)樣本連接接頭后的產(chǎn)物 作為模板進(jìn)行富集擴(kuò)增，并用單鏈消化酶消化剩余的引物，W分別給每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物 都加上可W區(qū)分的標(biāo)簽引物序列； 混合與回收：將各樣本的富集擴(kuò)增產(chǎn)物均一地混合在一起，回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范 圍之內(nèi)的所有DNA條帶； 測(cè)序；將回收的DNA混合物進(jìn)行測(cè)序； 分析：基于每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先與樣 本--對(duì)應(yīng)；根據(jù)每個(gè)祀序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的祀序列上。3. -種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè)祀序列的方法，包括W下 步驟： 1)引物和接頭設(shè)計(jì)： 第一輪擴(kuò)增引物：根據(jù)待測(cè)的祀序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲引物，組成第一輪擴(kuò)增引物組 合； 接頭序列：設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)接頭序列，所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3'T末端， 其中，一個(gè)回文序列位于所述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn)定形成 發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 第二輪擴(kuò)增引物：根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)計(jì)不同的標(biāo)簽序列，并在其3'端加上與所述接頭的 5'端回文序列互補(bǔ)的序列組成富集擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物，組成第二輪擴(kuò)增引物組合，其中， 由于第二輪擴(kuò)增的祀序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽 引物相同，設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物的數(shù)量遵循W下規(guī)則：標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù)量>樣本數(shù) 量，W及其中，在第二輪擴(kuò)增引物中，標(biāo)簽序列上添加的序列與第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中連接的接 頭的5'端回文序列互補(bǔ)； 2) 第一輪擴(kuò)增；將擴(kuò)增祀序列的捕獲引物混合，在適于多重?cái)U(kuò)增目的核酸的條件下分 別對(duì)各樣本進(jìn)行擴(kuò)增；回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍之內(nèi)的所有DNA條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 末端修復(fù)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)末端都加上A尾； 3) 連接接頭（Adaptor):通過(guò)連接反應(yīng)在擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加上帶U堿基的接頭，使用 US邸酶打斷U堿基，用單鏈消化酶消化剩余的引物； 4) 第二輪擴(kuò)增；根據(jù)不同樣本和接頭設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物，使用對(duì)應(yīng)樣本連接接頭處理后 的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行富集擴(kuò)增，W分別給每個(gè)樣本的擴(kuò)增引物都加上可W區(qū)分的標(biāo)簽引物 序列；用單鏈消化酶消化剩余的引物，并進(jìn)行純化； 5) 混合與回收；將各樣本的富集產(chǎn)物均一地混合在一起；回收所設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域范圍 之內(nèi)的所有DNA條帶； 6) 測(cè)序；將DNA混合物進(jìn)行測(cè)序； 7) 分析；基于每個(gè)樣本獨(dú)特的標(biāo)簽引物序列，將獲得的測(cè)序結(jié)果首先與樣本一一對(duì) 應(yīng)；根據(jù)每個(gè)祀序列的捕獲引物序列，再將測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)到樣本的祀序列上。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述標(biāo)簽序列的長(zhǎng)度為5-20bp，優(yōu)選地， 所述標(biāo)簽序列的長(zhǎng)度為6-8bp ;所述接頭中包含兩個(gè)區(qū)域的回文序列，每個(gè)回文序列為 8-lf5bp,最優(yōu)選為 15bp。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，第一輪擴(kuò)增所采用的體系為高保真多重PCR 反應(yīng)體系；第二輪擴(kuò)增所采用的酶為高保真DNA聚合酶，所述的單鏈消化酶為核酸外切酶 Io6. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，第一輪擴(kuò)增進(jìn)行18-20個(gè)循環(huán)，第二輪擴(kuò)增 進(jìn)行15-18個(gè)循環(huán)。7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，末端修復(fù)、加 A尾反應(yīng)W及連接反應(yīng)所 用試劑分別為Neb推薦二代建庫(kù)試劑盒NEBNext? Elnd Repair Module、NEBNext? dA-Tailing Module 和NEBNex俾如ick Ligation Module。8. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，測(cè)序利用二代測(cè)序技術(shù)，優(yōu)選的是pair-End 技術(shù)（例如 Illumina Hiseq2000, Illumina Hiseq2500 和 Illumina Miseq)進(jìn)行測(cè)序，獲 得DNA混合物的序列。9. 一種基于高通量測(cè)序的捕獲和標(biāo)記多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè)祀序列的試劑盒，其中， 所述試劑盒包括W下引物和接頭： 第一輪擴(kuò)增引物：根據(jù)待測(cè)的祀序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲引物，組成第一輪擴(kuò)增引物組 合； 接頭序列：一個(gè)或多個(gè)接頭序列，所述接頭包含兩個(gè)回文序列、U堿基和3' T末端，其 中，一個(gè)回文序列位于所述接頭5'端，通過(guò)U堿基與另一個(gè)回文序列連接，其可穩(wěn)定形成發(fā) 卡結(jié)構(gòu)；和/或 第二輪擴(kuò)增引物：根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)計(jì)不同的標(biāo)簽序列，并在其3'端加上與所述接頭的 5'端回文序列互補(bǔ)的序列組成富集擴(kuò)增所用的標(biāo)簽引物，組成第二輪擴(kuò)增引物組合，其中， 由于第二輪擴(kuò)增的祀序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽 引物相同，設(shè)計(jì)的標(biāo)簽引物的數(shù)量遵循W下規(guī)則：標(biāo)簽序列的數(shù)量X接頭的數(shù)量>樣本數(shù) 量，W及其中，在第二輪擴(kuò)增引物中，標(biāo)簽序列上添加的序列與第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中連接的接 頭的5'端回文序列互補(bǔ)。10. -種基于局通量測(cè)序的標(biāo)記和捕獲多個(gè)樣本的Wilson綜合征相關(guān)的ATP7B基因 的一個(gè)或多個(gè)外顯子的試劑盒，其中所述外顯子為選自EX0N1、EX0N2、EX0N3、EX0N4、EX0N5、 EX0N6、EX0N7、EX0N8、EX0N9、EX0N10、EXONl 1、EX0N12、EX0N13、EX0N14、EX0N15、EX0N16、 EX0N17、EX0N18、EX0N19、EX0N20、EX0N21中的一種或多種；所述試劑盒包括如下引物和接 頭： 第一輪擴(kuò)增引物包括選自下列中的一對(duì)或多對(duì)： El-F CTTCCCCGGTCCCAAATGAAG El-R CCTCCTGGTGGGAGTGAGCAC E2-F TGCCAGAGAAGCTGGGATGTTG E2-R GCAAACCTGTTGCAGGCACAC E3-F GAGCCCTGAAACCTCTTGTTCTG E3-R CGAGGTCTATACGCAGCATTCCT E4-F GCCCTGCCCACCCAGAGTG E4-R CAAAGATGGATGTGTCCAAAATGC E5-F CTGGCTTTCACAGGCTTTCCT E5-R TTACTTACCTCAATAATTTTGATAATATCC E6-F CTGCCAATGCATATTTTAACCAAGT E6-R GAAGGGACTTAGATGAGAGCTGGAG E7-F AATCCAGGTGACAAGCAGCATC E7-R GCATGGAAGGGAGAGGTCTGC E8-F ACTTGCTGGCAGCCTTCACTG E8-R GATTTGTTTACTGAAGGAGCAGCTC E9-F CGATAGCTCTCATTTCACATTCTGG E9-R CACACAGATTGATAGATACCAACCAC ElO-F TGACCCGGTGACCGAATGAGT ElO-R ATGATATCCTCCTGAGGGAACATG Ell-F CAAGTGACAGTTGTCTCTTTCCTACG Ell-R TTCCCAGAACTCTTCACATAATTTCT E12-F CCATGGTCTTGGTGTTTTATTTTC E12-R TGAAAGAACAGGATCAATGTCAGTAG E13-F TGGGAGCTTCCTTATTGAACTCTC E13-R CATCTCTCAGGATGGGGAAAGC E14-F CCTCCATCTGTATTGTGGTCAGTG E14-R GGTGAGGAATAAAAGAGCATTGGC E15-F TCTTGGCTTACAGTTTCCTCTTCC E15-R CGTGGTGCTCTCTGTGGTTTGA E16-F GGACCATTTAGAAATAACCACAGCC E16-R TTTGCCTGATATCTGCAGAAAACTG E17-F CCAACTTGTGTAGCTGCTGATGC E17-R TGGTGCTTACTTTTGTCTCTAACTGC E1819-F TGATACCTTTTGCCAACACTAGGC E1819-R TGGGAGACAGAAGCCTTTCTGG E20F TGGCTCCTCTCCCCAGACCTA E20-R ACTGTGCTAAGCATGCAGAATGAC E21-F GAGAGGCCTTCACCAGGCTTAG E21-R GCCTGCCTGAAGTCATCAGATG 用于連接在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物兩端的具有如下序列的接頭： ADPl 點(diǎn) P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-S-T-3' ADP2 ：5' P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-S-T-3'； 第二輪擴(kuò)增引物包括選自下列標(biāo)簽引物中的一種或多種標(biāo)簽引物組成的引物對(duì)，其中 劃?rùn)M線部分為與第一輪產(chǎn)物中連接的接頭的5'端回文區(qū)域互補(bǔ)的序列： ADPlA ：GCTCATTCGAGCTTCTGTCCT ADPlB ：TAGCCTTCGAGCTTCTGTCCT ADPlC ：AGAGGCTCGAGCTTCTGTCCT ADPlD ：TATCCTTCGAGCTTCTGTCCT ADPlE ：CTCTGATCGAGCTTCTGTCCT ADP2A ：GCTCATTCGATCGCTCAAGGT ADP2B ：TAGCCTTCGATCGCTCAAGGT ADP2C ：AGAGGCTCGATCGCTCAAGGT ADP2D ：TATCCTTCGATCGCTCAAGGT ADP沈：CTCTGATCGATCGCTCAAGGT 其中，由于第二輪擴(kuò)增時(shí)，祀序列兩端連接的接頭相同，用于同一樣本的正向標(biāo)簽引物 和反向標(biāo)簽引物相同。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105986015SQ201510061690
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月5日
【發(fā)明人】劉琦, 許立志, 胡小許, 鄭新, 楊文輝, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開(kāi)姓名
【申請(qǐng)人】大連晶泰生物技術(shù)有限公司