高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌fy2013及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一株高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌（Aspergillus?niger）FY2013，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.8832。本發(fā)明還提供高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因組序列（SEQ?ID?No.59），可用于檸檬酸高效合成功能基因組學(xué)、酶學(xué)、工程菌株構(gòu)建、合成其它有機(jī)酸（如蘋果酸、丁二酸、富馬酸等）等研究。本發(fā)明為進(jìn)一步明晰產(chǎn)檸檬酸黑曲霉遺傳特征、基因組背景，掌握檸檬酸合成代謝途徑提供了客觀依據(jù)，為進(jìn)一步構(gòu)建更為優(yōu)越的產(chǎn)檸檬酸菌種提供了可靠數(shù)據(jù)資料。
【專利說(shuō)明】高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌FY2013及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌FY2013及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]檸檬酸是一種非常重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和日化行業(yè)等。目前工業(yè)上使用發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。高產(chǎn)檸檬酸菌種選育在發(fā)酵工業(yè)中占有重要的地位，幾十年來(lái)檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉的選育研究一直是研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0003]1940年美國(guó)科學(xué)家克雷伯斯提出三羧循環(huán)(TCA循環(huán))學(xué)說(shuō)，檸檬酸的發(fā)酵機(jī)理逐漸得到認(rèn)識(shí)。含糖類原料生成檸檬酸的生化轉(zhuǎn)化過(guò)程中，葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑(EMP途徑)生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步氧化脫羧生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A和草酰乙酸(由丙酮酸羧化所生成)縮合成為檸檬酸。
[0004]檸檬酸是代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)微生物體內(nèi)的烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，檸檬酸合成酶活性很高時(shí)，有利于檸檬酸的大量合成和積累。
[0005]黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的代謝途徑:黑曲霉生長(zhǎng)繁殖時(shí)產(chǎn)生的淀粉酶首先將含有淀粉的原料轉(zhuǎn)變?yōu)槠?萄糖，葡萄糖經(jīng)過(guò)EMP途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，丙酮酸由丙酮酸氧化酶生成乙酰輔酶A和CO2,繼而乙酰輔酶A與草酰乙酸在檸檬酸合成酶(檸檬酸縮合酶)的作用合成檸檬酸。黑曲霉在限制氮源和錳等金屬離子、同時(shí)在高濃度葡萄糖和充分供氧的條件下，TCA循環(huán)中的α-酮戊二酸脫氫酶受阻遏，三羧酸循環(huán)變成“馬蹄形”，代謝流匯集于檸檬酸大量合成和積累并排出菌體外，其理論反應(yīng)式為:
[0006]C6H12O6+1.5O2 — C6H807+2H20
[0007]檸檬酸理論得率為106.7%，若以含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸計(jì)為116.7%。
[0008]檸檬酸菌種的優(yōu)劣對(duì)于檸檬酸產(chǎn)量和生產(chǎn)成本起到重要作用，要實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵，降低生產(chǎn)成本，檸檬酸菌種的馴化和選育是關(guān)鍵。一株優(yōu)良的檸檬酸菌種應(yīng)具備耐高酸和產(chǎn)高酸的性能。本發(fā)明以黑曲霉菌株FY2010為出發(fā)菌種(ACCC30161 )，從發(fā)酵良好產(chǎn)酸高的薯干醪檸檬酸發(fā)酵液中分離菌株，通過(guò)一系列物理和化學(xué)誘變、酸度馴化得到58株耐酸菌株，再?gòu)?fù)篩得到9株既耐酸又產(chǎn)酸高的菌株，進(jìn)一步優(yōu)篩得到I株耐酸、產(chǎn)酸高、高糖酸轉(zhuǎn)化率的優(yōu)良菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌FY2013及其應(yīng)用。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一株高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉(Aspergillusniger) FY2013，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)CGMCCN0.8832，保藏日期2014年2月20日。
[0011]本發(fā)明還提供所述黑曲霉FY2013的部分基因組序列，見(jiàn)SEQ ID N0.59。[0012]其全基因組序列共含34853277個(gè)核苷酸。GC含量28.18%，包括313個(gè)預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框(ORF)。
[0013]本發(fā)明還提供所述黑曲霉FY2013在發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0014]1)種曲制備:
[0015]取5mL無(wú)菌水至黑曲霉菌株FY2013的培養(yǎng)平板上，用接種環(huán)刮下孢子至200mL無(wú)菌水中，制成孢子懸液，用于檸檬酸種子罐培養(yǎng)；
[0016]2)種子罐培養(yǎng):
[0017]種子罐中加入20L水，然后稱取8kg玉米粉加入種子罐中混勻，加入5mL淀粉酶(90000u/ml)，加熱至65-70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92_95°C液化5min，然后將液化液進(jìn)行固液分離，再將液化后分離的糖液重新裝入種子罐中，總糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2mL消泡劑，121°C加熱滅菌20min，然后冷卻至37°C，保溫，接入制備好的菌株FY2013孢子懸液，37°C進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，22h后，取少量種子液鏡檢并測(cè)定其pH值，鏡檢無(wú)污染且菌球生長(zhǎng)良好，當(dāng)種子液PH降至3.0時(shí)，將種子液接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸；
[0018]3)利用黑曲霉菌株FY2013發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸:
[0019]稱取9kg玉米粉、22kg水、6mL淀粉酶，混勻后加熱至65_70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92-95°C液化5min，液化后對(duì)液化液進(jìn)行固液分離，將糖液裝入發(fā)酵罐中，加入20g/L大豆粉，用檸檬酸調(diào)pH為4.8，并加入消泡劑2mL，110°C加熱滅菌15min，冷卻至37°C，保溫，接入上述培養(yǎng)好的種子液，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，接種量為10%，接種后總糖控制在19.8%，發(fā)酵溫度為37±1°C，罐壓控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，發(fā)酵時(shí)間60h ；
[0020]其中，步驟I)中使用的培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂15_20g、蒸餾水lL，pH自然。
[0021]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的α _淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0022]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的葡萄糖氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0023]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的葡萄糖脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0024]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的6_磷酸葡萄糖脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.13所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0025]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的蘋果酸脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.17所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0026]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的烏頭酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.21所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0027]本發(fā)明還提供與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的α _酮戊二酸脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.25所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0028]本發(fā)明提供高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因組序列(SEQ ID N0.59)，可用于檸檬酸高效合成功能基因組學(xué)、酶學(xué)、工程菌株構(gòu)建、合成其它有機(jī)酸(如蘋果酸、丁二酸、富馬酸等)等研究。本發(fā)明為進(jìn)一步明晰產(chǎn)檸檬酸黑曲霉遺傳特征、全基因組背景，掌握檸檬酸合成代謝途徑提供了客觀依據(jù)，為進(jìn)一步構(gòu)建更為優(yōu)越的產(chǎn)檸檬酸菌種提供了可靠數(shù)據(jù)資料，并為我國(guó)高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌種可利用蔗糖作為碳源生產(chǎn)檸檬酸奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中PCR擴(kuò)增α -淀粉酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0030]圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中α -淀粉酶SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0031]圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中PCR擴(kuò)增葡萄糖氧化酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0032]圖4為本發(fā)明實(shí)施例6中PCR擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0033]圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中葡萄糖脫氫酶SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0034]圖6為本發(fā)明實(shí) 施例7中PCR擴(kuò)增6_磷酸葡萄糖脫氫酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果O
[0035]圖7為本發(fā)明實(shí)施例7中6-磷酸葡萄糖脫氫酶SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0036]圖8為本發(fā)明實(shí)施例8中PCR擴(kuò)增蘋果酸脫氫酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0037]圖9為本發(fā)明實(shí)施例9中PCR擴(kuò)增烏頭酸酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0038]圖10為本發(fā)明實(shí)施例9中烏頭酸酶SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0039]圖11為本發(fā)明實(shí)施例10中PCR擴(kuò)增α _酮戊二酸脫氫酶基因的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果O
[0040]圖12為本發(fā)明實(shí)施例10中α -酮戊二酸脫氫酶SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0041 ] 圖13為黑曲霉菌株FY2013檸檬酸合成代謝途徑示意圖；其中，虛線表示相關(guān)酶失活或活力減弱，②⑤酶失活，③④⑥⑦酶活性減弱。
[0042]其中，圖1-12中I表示黑曲霉菌株FY2010 ;2表示黑曲霉菌株FY2013。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。
[0044]實(shí)施例1高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的構(gòu)建
[0045]誘變育種是以強(qiáng)烈因子處理微生物細(xì)胞群體(或孢子)，促使微生物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)(主要是DNA)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起誘變突變，進(jìn)而設(shè)法從大量的變異群體中篩選出優(yōu)良的突變株的過(guò)程。誘變育種具有速度快、收效大、方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是檸檬酸生產(chǎn)育種常用的一種方法。[0046]1、檸檬酸產(chǎn)生菌的誘變都采用活化狀態(tài)的分散孢子進(jìn)行處理。具體操作為:將出發(fā)菌株FY2010 (購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)ACCC30161)的孢子轉(zhuǎn)接于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)8天，長(zhǎng)好孢子后，用生理鹽水將孢子洗下，再用0.05MTris緩沖液(pH6.0)洗滌一次，轉(zhuǎn)到小三角瓶中，用玻璃珠振蕩打散，然后通過(guò)一層宣紙過(guò)濾，濾去菌絲斷片和沒(méi)有打散的孢子團(tuán)，制成單孢子懸浮液。
[0047]所述麥芽汁斜面培養(yǎng)基為:①取大麥或小麥若干，用水洗凈，浸水6-12小時(shí),至15°C陰暗處發(fā)芽，上面蓋紗布一塊，每日早、中、晚淋水一次，麥根伸長(zhǎng)至麥粒的兩倍時(shí)，即停止發(fā)芽，攤開(kāi)曬干或烘干，貯存?zhèn)溆谩＂趯⒏甥溠磕ニ?，一份麥芽加四份水，?5°C水浴中糖化3-4小時(shí)，糖化程度可用碘滴定之。加水約20mL，調(diào)勻至生泡沫時(shí)為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過(guò)濾。③將糖化液用4-6層紗布過(guò)濾，濾液如混濁不清，可用雞蛋白澄清，方法是將一個(gè)雞蛋白加水約20mL，調(diào)勻至生泡沫時(shí)為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過(guò)濾。④將濾液稀釋到5-6波美度，pH6.4，加入2%瓊脂即成。121°C滅菌30min。其中麥芽汁主要成分是麥芽糖。 [0048]2、誘變育種
[0049]本發(fā)明采用:Co6° Y -射線處理一高溫處理一亞硝基胍處理等低劑量復(fù)合處理2次，具體為:
[0050]①將上述制得的黑曲霉孢子懸浮液20ml (含量為100個(gè)/ml)置于25ml比色管中于Co6° Y射線下照射，劑量為800-1200Gy，照射后的孢子懸浮液稀釋10000倍，取0.1ml涂布添加10g/L蛋白胨和酵母膏的察氏培養(yǎng)基中，置于37°C中培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)出的小菌落且孢子穗大而稀少者，轉(zhuǎn)接于6° Β?(所述。Β?即波美度的簡(jiǎn)稱，是指采用玻璃管式浮計(jì)中的一種特殊分度方式的波美計(jì)所給出的值稱為波美度，符號(hào)為。Β?，用于間接地給出液體的密度)麥芽汁斜面上，37°C培養(yǎng)8d，長(zhǎng)滿孢子后，制成孢子懸浮液，待用。其中所述察氏培養(yǎng)基為:硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、七水合硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL,加熱溶解，分裝后121°C滅菌20min。
[0051]②上述孢子懸浮液置于高溫下處理，處理強(qiáng)度為90°C、5min，處理后進(jìn)行稀釋平板分離，挑取小菌落且孢子穗大，轉(zhuǎn)接于6° Be麥芽汁斜面上，37°C培養(yǎng)8d，長(zhǎng)滿孢子后，制成孢子懸浮液，待用。
[0052]③稱取Img的亞硝基胍(NTG)加入到IOml丙酮溶液中，配成0.lmg/ml的溶液，再加4倍檸檬酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ5.5)制得0.02mg/ml溶液。取上述制得的孢子懸浮液0.9ml,于37°C恒溫水浴中預(yù)熱5min，加入0.1ml濃度為0.02mg/ml的亞硝基胍溶液，37°C水浴中保溫處理30min,取出后以3000r/min離心分離，棄去上清液,用預(yù)先冷卻的無(wú)菌生理鹽水或緩沖液進(jìn)行洗滌離心10次以上，最后用生理鹽水恢復(fù)到原有體積，進(jìn)行平板分離。具體方法同上，將制成的孢子懸浮液再經(jīng)過(guò)Y射線、高溫和亞硝基胍處理I次。
[0053]3、突變菌株的篩選
[0054](I)濃縮過(guò)濾篩選，采用以檸檬酸鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基
[0055]稱取檸檬酸鈉2g、硫酸鎂0.05g、硫酸亞鐵0.05g、磷酸氫二鉀0.01g、氯化鉀0.05g、硝酸鈉0.3g，加水溶解，ρΗ5.0，定容至100ml, 121°C滅菌20min。
[0056]將完成2次復(fù)合誘變處理后的孢子懸浮液直接涂布在察氏培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)出的小菌落且孢子穗大，轉(zhuǎn)接于8° Be麥芽汁斜面上，37°C培養(yǎng)7天，長(zhǎng)滿孢子后，制成孢子懸浮液，將此孢子懸浮移植于30ml的以檸檬酸鈉為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)36h，經(jīng)兩層薄宣紙過(guò)濾，濾去菌絲獲得的過(guò)濾液，稀釋10000倍。
[0057]( 2 )標(biāo)記培養(yǎng)基篩選
[0058]酸性薯干粉水解液平板，配制方法:A液:稱取薯干粉20g，加入α -淀粉酶，75°C酶解20min，過(guò)濾獲得濾液，加入4g瓊脂定容至100ml，于121°C下滅菌30min，冷卻至室溫；B液:稱取20g檸檬酸定容至100ml，121°C滅菌20min。使用前，將A瓊脂溶化，冷卻至50°C，迅速加入B溶液，立即倒平板。
[0059]高檸檬酸高滲察氏平板，配制方法:A液:稱取20g檸檬酸，加少量水溶解后，定容至35ml ；B液:稱取硝酸鈉0.3g、磷酸氫二鉀0.lg、硫酸鎂0.05g、氯化鉀0.05g、硫酸亞鐵0.0Olg、蔗糖 3g、瓊脂 1.5g、ρΗ7.3，定容至 65ml ;將 A 液在 121°C下滅菌 15min, B 液 121。。滅菌30min，都冷卻至45°C，將A、B液迅速混合均勻，立即倒平板。
[0060]葡萄糖為唯一碳源合成培養(yǎng)基平板，稱取葡萄糖2g、磷酸二氫鉀0.05g、硝酸銨0.2g、硫酸鎂0.lg、瓊脂2g，定容至100ml, 121°C滅菌20min，冷卻至45°C，倒平板。
[0061]高金屬離子濃度平板，稱取蔗糖3g、硝酸鈉0.2g、硫酸鎂0.05g、磷酸二氫鉀
0.lg、氯化鉀0.05g、硫酸亞鐵0.5g、硫酸錳0.01g、硫酸銅0.01g、硫酸鋅0.05g、瓊脂2g、ρΗ5.0-6.0，定容至100ml, 121°C滅菌20min，冷卻至45°C，倒平板。 [0062]將經(jīng)過(guò)濃縮篩選的過(guò)濾稀釋液分別涂布在上述培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)4天，再結(jié)合菌落形態(tài)，挑選出邊緣整齊、光滑、隆起、菌絲色澤變淺、孢子穗大而稀少者，并具有耐高檸檬酸濃度(200g/L)、耐高糖濃度(200g/L)、耐高濃度金屬離子(Mn2+≥0.05%,Zn2+≥0.03%、Cu2+≥0.04%、Fe2+≥0.2%等)，不分解利用檸檬酸的突變株，共得到58株。
[0063](3)搖瓶復(fù)篩，將前述所得到的突變株接入糖濃度為190g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，挑選96h搖瓶產(chǎn)酸高于151g/L的菌株，使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行分純，挑選單菌落再次接入上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基，如此重復(fù)10批次。上述發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉培養(yǎng)基，具體配制方法為:稱取Ikg玉米粉、2kg水，Iml耐高溫α -淀粉酶，混勻后，加熱至65_70°C進(jìn)行糊化30min,再升溫至92-95°C液化5min，液化后對(duì)液化液進(jìn)行固液分離，將糖液裝入錐形瓶中，糖濃度為190g/L，加入20g/L大豆粉，用檸檬酸調(diào)pH為4.8，并加入2ml消泡劑，110°C加熱滅菌15min。挑選出細(xì)小菌球體，菌球體外的菌絲粗而短的高產(chǎn)檸檬酸突變株9株，對(duì)這9株突變株再經(jīng)反復(fù)傳代試驗(yàn)，除去回復(fù)突變株。
[0064]④進(jìn)一步優(yōu)篩得到I株耐酸產(chǎn)酸高轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)良菌株。將前述所得到的菌株接入糖濃度為190g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，挑選96h搖瓶產(chǎn)酸高于158g/L的菌株，使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行分純，挑選單菌落再次接入上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基，如此重復(fù)10批次，得到一株高產(chǎn)菌株命名為FY2013 (CGMCC N0.8832)。
[0065]實(shí)施例2高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株FY2013的全基因組序列測(cè)定
[0066]將待測(cè)序的黑曲霉菌株FY2013制成孢子懸浮液(具體方法見(jiàn)實(shí)施例1)，送至華大基因公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。SEQ ID N0.59是高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因組序列。菌株FY2013的基因組全長(zhǎng)共34853277個(gè)核苷酸。GC含量28.18%。
[0067]實(shí)施例3黑曲霉菌株FY2010和FY2013基因組DNA提取及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
[0068]1、黑曲霉菌株FY2010基因組DNA的提取
[0069]采用十二烷基磺酸鈉(SDS)法提取黑曲霉菌株FY2010基因組DNA，具體方法如下:
[0070]a.取IOml黑曲霉菌株FY2010孢子懸浮液，裝入離心管中，8000g，4°C離心2min，收集菌體；
[0071]b.加入液氮迅速研磨成粉末，將細(xì)粉及時(shí)轉(zhuǎn)入50ml的離心管中，加入IOmlSDS提取緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn)混勻；
[0072]c.加入lml20%SDS (pH7.2)，混勻，65°C水浴保溫45min，間或輕搖混勻；
[0073]d.加入 5ml5mol/L 醋酸鉀，混勻后冰浴 30min, 1000Orpm, 4°C離心 IOmin ；
[0074]e.取上清，加入等體積的苯酚:氯仿:異丙醇(25:24:1)，混勻，10000rpm，4°C離心IOmin ；
[0075]f.取水相，準(zhǔn)確加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，冰上放置lOmin，7000rpm，4°C離心10min，沉淀用70%乙醇洗滌，離心后溶于無(wú)菌ddH20 ；
[0076]g.加入 30μ1 Dnase-free RNase (10mg/ml), 37°C 溫育 30min,異丙醇沉淀 DNA,70%乙醇洗滌，略風(fēng)干，溶于TE溶液中，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0077]黑曲霉菌株FY2013基因組DNA提取方法同黑曲霉菌株FY2010。
[0078]2、黑曲霉菌株FY2010總RNA的提取
[0079]用RNAiso Plu s提取試劑(購(gòu)自TaKaRa公司)提取黑曲霉菌株FY2010的總RNA。具體方法為:
[0080]h.吸取IOml黑曲霉FY2010孢子懸液，裝入離心管中，8000g、4°C離心2min，棄上清；
[0081]1.向沉淀中加入RNAiso Plus5ml，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無(wú)明顯沉淀，室溫靜置5min ；
[0082]j.向上述裂解液中加入1ml氯仿，蓋緊管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色，室溫靜置5min ；
[0083]k.12000g、4°C離心15min，從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)離心管中的裂解液分為三層:無(wú)色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機(jī)相；
[0084]1.吸取上清轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，切勿吸出白色中間層；
[0085]m.向上清中加入4ml異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置IOmin ；
[0086]n.12000g、4°C離心10min，離心后，管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA ；
[0087]ο.棄去上清，切勿觸及沉淀，還殘留少量異丙醇，加入5ml75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌，7500g、4°C離心5min后，棄上清，再用75%乙醇清洗一次；
[0088]p.打開(kāi)管蓋，室溫干燥沉淀至管中無(wú)乙醇的味道，加入1ml RNase-free水溶解沉淀，即為提取的總RNA。
[0089]黑曲霉菌株FY2013總RNA提取方法同黑曲霉菌株FY2010。
[0090]3、黑曲霉菌株FY2010cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
[0091]用TaKaRa 公司的 PrimeScriot?lst Strand cDNA Synthesis Kit,按試劑盒說(shuō)明對(duì)提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而獲得黑曲霉FY2010菌株的cDNA文庫(kù)。具體步驟為:
[0092]q.在 PCR 管中加入 1μ I Oliga dT Primer (50μΜ)，1μ1 dNTP (IOmM each),2 μ I提取的RNA，用RNase free水補(bǔ)齊至10 μ I ;[0093]r.65°C保溫5min，冰上迅速冷卻；
[0094]s.再向上述變性后的反應(yīng)液中加入4 μ 15XPrimeScript Buffer, 0.5 μ I RNase抑制劑(40U/μ I), I μ I PrimeScript Rtase (200U/μ I),用 RNase free 水補(bǔ)至 20 μ 1，緩慢混勻；
[0095]t. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為:30°C, 10min,42°C,45min,95°C保溫5min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液即為構(gòu)建的黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)，可用于PCR擴(kuò)增的模板。
[0096]黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法同黑曲霉菌株FY2010。
[0097]實(shí)施例4菌株FY2010與菌株FY2013的α -淀粉酶活性的比較研究
[0098]1、黑曲霉菌株FY2010 α -淀粉酶(alpha-amylase, Amy)基因的克隆
[0099]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉α -淀粉酶基因序列(GenBank:EU200666.1 )，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -TGAAGTTCATCCTCCTTCAC-3 ’，下游引物為:5’-ATAAACTTATACTCGAAAGT-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的α -淀粉酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010 α -淀粉酶的編碼序列見(jiàn)SEQID N0.4，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.3 ;黑曲霉菌株FY2013 α -淀粉酶的編碼序列見(jiàn)SEQID N0.2，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.1。
[0100]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010 α -淀粉酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建 PET 表達(dá)載體，其正向引物 Fl:5' -GATGGATCCATGAGACTATCGACTTCAAGTCTC-3'，反向引物Rl:5/ -GATGTCGACTTACTCGACGTATAATCTTCCGC-3'，其中斜體字母部分分別為酶切位點(diǎn)BamH I和Sal I，以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在50 μ I總體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為:94°C變性5min ;94°C變性60s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。取3μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。取100μΙ PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的說(shuō)明回收目的片段。
[0101]2、黑曲霉菌株FY2013 α -淀粉酶基因的克隆
[0102]根據(jù)實(shí)施例4.1獲得的黑曲霉菌株FY2013的α -淀粉酶基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物FlM:5' -GATGGATCCATGAGACTATTGACTTCAAGTCTC-3'，反向引物 Rl:5' -GATGTCGACTTACTCGACGTATAATCTTCCGC-3'，以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。
[0103]3、兩種α -淀粉酶氨基酸序列的同源性比較研究
[0104]黑曲霉FY2013a -淀粉酶氨基酸序列與黑曲霉菌株FY2010a -淀粉酶氨基酸序列相比，發(fā)生下列突變:S4L (S源于FY2010 a -淀粉酶氨基酸序列，L源于FY2013 a -淀粉酶氨基酸序列，以下相關(guān)內(nèi)容與此一致)、I108M、K265E、V266Y、N292D、S398T。
[0105]4、黑曲霉菌株FY2010和FY2013 a -淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0106]將上述的兩種a -淀粉酶PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I (購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切消化后，分別與用相同內(nèi)切酶消化的pET-28b質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購(gòu)自promega公司)，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，構(gòu)建好的含有黑曲霉菌株FY2010 α -淀粉酶編碼基因的載體命名為pET-Amy，含有黑曲霉菌株FY2013 α -淀粉酶編碼基因的載體命名為pET-AmyM。相關(guān)表達(dá)載體插入的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定分析并驗(yàn)證正確。
[0107]5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013 α -淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化
[0108]將pET-Amy質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自promega公司)感受態(tài)細(xì)胞；挑取I個(gè)陽(yáng)性克隆，接種于含卡那霉素抗性(50mg/ml)的IOml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6-0.8時(shí)，取2ml轉(zhuǎn)接于1000mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)，待0D_值約達(dá)2.0時(shí)，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，37°C誘導(dǎo)12h。。離心收集菌體，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl (含lmmol/L咪唑)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為Ig濕菌體:5mL緩沖液)，在冰浴中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清，取100 μ I上清加入5XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，100°C沸水浴15min后，待用。
[0109]將鎳離子親和層析柱介質(zhì)(N1-NTA)填20ml層析柱中，用2倍柱體積的去離子水洗漆，然后加NiSO4溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-O緩沖液(20mMTris-HCl pH7.9,0.5M NaCl)洗柱。將上述收集破碎菌體離心后得到的上清加入到Ni2+-NTA樹(shù)脂柱中，反復(fù)加入2-3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(即NAT-O緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的上述緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的Amy蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2)。
[0110]黑曲霉菌株FY2013的α-淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化方法同黑曲霉菌株 FY2010。
[0111]6、使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量
[0112](I)試劑:用牛血清蛋白加去離子水配制成1.0mg/ml和0.lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液；稱取IOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml95%的乙醇，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1L。
[0113](2)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:取7支試管，編號(hào)為0、1、2、3、4、5、6，按順序加入1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，分別加入:0、0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1ml，然后用去離子水補(bǔ)充到
0.1ml0然后再向各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，在旋渦混合器上混合。IOmin后，以O(shè)號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色，測(cè)吸光值，以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0114](3)樣品中蛋白含量的檢測(cè):將待測(cè)樣品按上述步驟加入試管中，用去離子水補(bǔ)充至0.1ml，再加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，在595nm處比色，測(cè)得的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知樣品的蛋白含量。
[0115]7、α-淀粉酶的酶活測(cè)定
[0116]對(duì)純化的α-淀粉酶進(jìn)行酶活性分析，具體方法如下:在500ml檸檬酸緩沖液(pH6.0)加入可溶性淀粉0.05g，取配好的淀粉溶液0.5ml，65°C水浴保溫5min，加入純化的酶液10μ 1，37°C反應(yīng)5min，DNS法測(cè)定生成還原糖的量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每 分鐘轉(zhuǎn)化生成等價(jià)于I μ mol葡萄糖的還原糖所需的酶量。酶比活力(U/mg)定義為在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
[0117]8、黑曲霉菌株FY2010與黑曲霉菌株FY2013 α -淀粉酶酶比活比較研究[0118]試驗(yàn)測(cè)得黑曲霉菌株FY2010a-淀粉酶酶比活為:267U/mg，黑曲霉FY2013菌株的α-淀粉酶的酶比活為:372U/mg。菌株FY2013的a -淀粉酶活力相較于黑曲霉菌株FY2010的提高約1.4倍，這可使檸檬酸合成代謝流增加。
[0119]實(shí)施例5菌株FY2010與菌株FY2013葡萄糖氧化酶活性的比較研究
[0120]1、黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，God)基因的克隆
[0121]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列(GenBank J05242.1)，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -CTTCTGATCAGCAACCAGCC-3 ’，下游引物為:5’-CATCTAAGTACCATCCCCTA-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的葡萄糖氧化酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.8，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.7 ;黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.6，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.5。
[0122]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶編碼基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F2:5’ -GATGGATCCATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCG-3 ’，反向引物 R2:5 ’ -GATAAGCTTTCACTGCATGGAAGCATAATCT-3 ’。引物分別帶有酶切位點(diǎn)BamH I和HindIII。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段如圖3所示。
[0123]2、黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶基因的克隆 [0124]根據(jù)實(shí)施例5.1獲得的黑曲霉菌株FY2013的葡萄糖氧化酶基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F2:5’-GATGGATCCATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCG-3’，反向引物R2:5’-GATAAGCTTTCACTGCATGGMGCATAATCT-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。
[0125]3、兩種葡萄糖氧化酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0126]與黑曲霉菌株FY2010葡萄糖氧化酶氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶氨基酸序列在第254位氨基酸殘基的編碼序列發(fā)生突變，變成了 TAG終止密碼子，導(dǎo)致該酶基因表達(dá)過(guò)程中，多肽鏈合成提前終止。
[0127]4、葡萄糖氧化酶的酶活測(cè)定
[0128]分別取黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的發(fā)酵液各30ml，4°C，8000rpm，離心30min，收集菌體，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl (含lmmol/L咪唑)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為Ig濕菌體:5mL緩沖液)，在冰浴中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清，即為粗酶液。
[0129]檢測(cè)方法是:將配置好的底物溶液(0.066mg/mL的鄰聯(lián)茴香氨溶液、10%葡萄糖溶液、過(guò)氧化氫溶液)放在25°C水浴鍋中平衡5min，然后加入粗酶液，放入分光光度計(jì)中436nm下記錄5min內(nèi)吸光度值的增加。一個(gè)酶活力單位(U)定義為:在上述條件下,每分鐘催化葡萄糖氧化生成I μ mol D-吡喃葡萄糖酸_1，5_內(nèi)酯所需的酶量。
[0130]5、黑曲霉菌株FY2010與黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶酶活比較研究
[0131]在黑曲霉菌株FY2010菌體破碎上清液中檢測(cè)葡萄糖氧化酶活為:1.23U/ml，而黑曲霉菌株FY2013菌體破碎后離心得到的上清液未能檢測(cè)到此酶的活力，表明黑曲霉菌株FY2013葡萄糖氧化酶表達(dá)被中斷，導(dǎo)致該酶失去相應(yīng)功能，使檸檬酸合成代謝流增加。
[0132]實(shí)施例6菌株FY2010與菌株FY2013葡萄糖脫氫酶活性的比較研究
[0133]1、黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase, Gdh)基因的克隆
[0134]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉葡萄糖脫氫酶基因序列(GenBank:AC253951.1)，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -GAGTATGTATCAAGCGTAGC-3 ’，下游引物為:5’-TAGAGTCCTATATAGCTCGC-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的葡萄糖脫氫酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.12，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.11 ;黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脫氫酶編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.10，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.9。
[0135]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建 PET 表達(dá)載體，其正向引物 F3:5’ -GACGGATCCATGTCTTCCTCGTTACACGCTCC-3’ ;反向引物 R3:5’ -GACCTCGAGCTACTGCTCAGCCTTGATAATATC-3’。引物分別帶有 BamH I 和Xho I酶切位點(diǎn)。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA為模板進(jìn)場(chǎng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段如圖4所
/Jn ο
[0136]2、黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脫氫酶基因的克隆
[0137]根據(jù)實(shí)施例6.1獲得的黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物,用于構(gòu)建PET表達(dá)載體,其正向引物F3:5 ’ -GACGGATCCATGTCTTCCTCGTTACACGCTCC-3’ ；反向引物 R3:5’-GACCTCGAGCTACTGCTCAGCCTTGATAATATC-3’。以黑曲霉菌株 FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。
[0138]3、兩種葡萄糖脫氫酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0139]黑曲霉FY2013葡萄糖脫氫酶氨基酸序列與黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶氨基酸序列相比，發(fā)生下列突變:A77D、N801、N81D、K85N、E86N、P87R。
[0140]4、葡萄糖脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0141]將上述的兩種葡萄糖脫氫酶PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I (購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切消化后，分別與用相同內(nèi)切酶消化的pET_28b質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (購(gòu)自promega公司)，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，構(gòu)建好的含有黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-Gdh，含有黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-GdhM。相關(guān)表達(dá)載體插入的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定分析并驗(yàn)證正確。
[0142]5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013葡萄糖脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0143]黑曲霉菌株FY2010和菌株FY2013葡萄糖脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白純化方法同實(shí)施例4。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0144]6、使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量
[0145]純化蛋白的蛋白含量測(cè)定具體方法同實(shí)施例4。
[0146]7、葡萄糖脫氫酶酶活測(cè)定
[0147]對(duì)純化得到的葡萄糖脫氫酶蛋白進(jìn)行酶活力分析。具體方法如下:純化的酶液80 μ 1、100 μ mol/L 葡萄糖 lml、4 μ mol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) ImU0.6mmol/L Tris-HCl (ρΗ6.8) lml、10 μ mol MnSO4Iml,充分混勻，37°C保溫 lOmin，在 340nm 波長(zhǎng)下測(cè)還原型輔酶II (NADPH)的吸光度。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol NADP產(chǎn)生NADPH所需的酶量。酶比活力(U/mg)定義為在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
[0148]8、黑曲霉菌株FY2010與菌株FY2013葡萄糖脫氫酶酶比活比較研究
[0149]試驗(yàn)測(cè)得黑曲霉黑曲霉菌株FY2010葡萄糖脫氫酶酶比活為:64.2U/mg，F(xiàn)Y2013葡萄糖脫氫酶的酶比活力為:33.6U/mg。菌株FY2013的葡萄糖脫氫酶活力下降，可使檸檬酸合成代謝流增加。
[0150]實(shí)施例7菌株FY2010與菌株FY2013的6_磷酸葡萄糖脫氫酶活力比較研究
[0151]1、黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶(Glucose6_phosphatedehydrogenase, G6dh)基因的克隆[0152]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因序列(GenBank:ΧΜ_001400305.2)，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5’ -CCGAATCTCTCACCTTTCCT-3’，下游引物為:5’-AATCAATCGCATTAACATCT-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.16，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.15 ;黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.14，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.13。
[0153]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F4:5’-GACGGATCCATGGCCAGCACAATAGCACGCAC-3’ ；反向引物 R4:5’-GACGTCGACTTACAGACGGTTGGGGGTGGAAGT-3’。引物分別帶有 BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段如圖6所示。
[0154]2、黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的克隆
[0155]根據(jù)實(shí)施例7.1獲得的黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F4:5 ’ -GACGGATCCATGGCCAGCACAATAGCACGCAC-3’ ；反向引物 R4:5’-GACGTCGACTTACAGACGGTTGGGGGTGGAAGT_3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。
[0156]3、兩種6-磷酸葡萄糖脫氫酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0157]黑曲霉FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶氨基酸序列與黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶氨基酸序列相比，發(fā)生下列突變:F40V、F135L、S476F、G478A。
[0158]4、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0159]將上述的兩種6-磷酸葡萄糖脫氫酶PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I (購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切消化后，分別與用相同內(nèi)切酶消化的pET_28b質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (購(gòu)自promega公司)，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，構(gòu)建好的含有黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-G6dh，含有黑曲霉菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-G6dhM。相關(guān)表達(dá)載體插入的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定分析并驗(yàn)證正確。
[0160]5,6-磷酸葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中的表達(dá)
[0161 ] 黑曲霉菌株FY2010和菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白純化方法同實(shí)施例4。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖7。
[0162]6、使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量
[0163]純化蛋白的蛋白含量測(cè)定具體方法同實(shí)施例4。
[0164]7、6_磷酸葡萄糖脫氫酶酶活測(cè)定
[0165]對(duì)純化得到的6-磷酸葡萄糖脫氫酶蛋白進(jìn)行酶活力分析。具體方法如下:純化的酶液 80 μ 1,100 μ mol/L 葡萄糖 lml、4 μ mol/L NADPlml>0.Bmmol /T, Tris_HCl(pH6.8)lml、10 μ mol MnSO4Iml,充分混勻，37°C保溫lOmin，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)NADPH的吸光度。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol NADP產(chǎn)生NADPH所需的酶量。酶比活力(U/mg)定義為在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
[0166]8、菌株FY2010與菌株FY20136-磷酸葡萄糖脫氫酶酶比活比較
[0167]試驗(yàn)測(cè)得黑曲霉黑曲霉菌株FY20106-磷酸葡萄糖脫氫酶比活為:43.7U/mg，菌株FY2013的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的酶比活力為:21.3U/mg。菌株FY2013的6-磷酸葡萄糖脫氫酶活力下降，可使檸檬酸合成代謝流增加。 [0168]實(shí)施例8菌株FY2010與菌株FY2013蘋果酸脫氫酶酶活力比較研究
[0169]1、黑曲霉菌株FY2010蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, Mdh)基因的克隆
[0170]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉蘋果酸脫氫酶基因序列(GenBank:XM_001396509.2)，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -TCTTGACCACTGTCTCCTTT-3 ’，下游引物為:5’ -TATTGGCATATCACCTATTG-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的蘋果酸脫氫酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010蘋果酸脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.20，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ IDN0.19 ;黑曲霉菌株FY2013蘋果酸脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.18，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.17。
[0171]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010蘋果酸脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建 PET 表達(dá)載體，其正向引物 F5:5’ -GACGGATCCATGGTTAAAGCGGGTGTTCTTGGA-3’ ；反向引物 R5:5’-GACAAGCTTCTTACTTTGGTGGGGGGTTCTT-3’。引物分別帶有酶切位點(diǎn) BamH I和Hind III。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段如圖8所
/Jn ο
[0172]2、黑曲霉菌株FY2013蘋果酸脫氫酶基因的克隆
[0173]根據(jù)實(shí)施例8.1獲得的黑曲霉菌株FY2013的蘋果酸脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F5M:5’ -GACGGATCCATGGTTAAAGCGGCTGTTCTTGGA-3’ ；反向引物 R5:5’ -GACAAGCTTCTTACTTTGGTGGGGGGTTCTT-3’。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。
[0174]3、兩種蘋果酸脫氫酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0175]與黑曲霉菌株FY2010蘋果酸脫氫酶氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌株FY2013蘋果酸脫氫酶氨基酸序列的第15位氨基酸殘基發(fā)生終止，其編碼序列改變形成終止密碼子TAG,導(dǎo)致該酶基因表達(dá)過(guò)程中，多肽鏈合成提前終止。
[0176]4、蘋果酸脫氫酶酶活檢測(cè)
[0177]分別取黑曲霉菌株FY2010黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的發(fā)酵液各30ml, 4°C, 8000rpm,離心 30min,收集菌體，以 50mmol/L、pH8.0Tris-HCl (含 lmmol/L 咪唑)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為Ig濕菌體:5mL緩沖液)，在冰浴中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清，即為粗酶液。
[0178]測(cè)定方法為:30mmol/L丙麗酸納溶液 100 μ 1,6mmol/L NADHlPO μ 1,15mmol/L 草酰乙酸100 μ 1，0.lmol/L pH7.5磷酸鉀緩沖液2.8ml，再加入提取的粗酶液100 μ 1，混勻，于25°C檢測(cè)反應(yīng)體系在340nm處吸光度的變化，根據(jù)每分鐘吸光度的降低即可計(jì)算出酶活。酶活力單位定義為:25°C，pH7.5條件下，每分鐘氧化I μ mol的NADH所需的酶量。
[0179]5、黑曲霉菌株FY2010與突變體蘋果酸脫氫酶酶活比較
[0180]在黑曲霉菌株FY2010菌體破碎上清液中檢測(cè)蘋果酸脫氫酶酶活為36.0U/ml，黑曲霉菌株FY2013菌體破碎上清液未檢測(cè)到該酶的活力，表明FY2013的蘋果酸脫氫酶表達(dá)被中斷，使得蘋果酸脫氫酶表達(dá)提前中斷，導(dǎo)致該酶失去相應(yīng)的功能。阻斷了合成檸檬酸前體草酰乙酸的分解代謝，增加檸檬酸合成代謝流量。
[0181]實(shí)施例9菌株FY2010與菌株FY2013烏頭酸酶酶活力比較研究
[0182]1、黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶(aconitase，Aca)基因的克隆
[0183]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉烏頭酸酶基因序列(GenBank:AM270352.1)，根據(jù)該酶編碼基因的起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -TCGTAAGCTTGCTTGAGAAA-3 ’，下游引物為:5’ -AGTTCGATCATGCATAACGA-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的烏頭酸酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶編碼序列見(jiàn)SEQ IDN0.24，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.23 ;黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶的編碼序列見(jiàn)SEQ IDN0.22，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.21。
[0184]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建 PET 表達(dá)載體，其正向引物 F6:5’-GACGAATTCATGGGTGACGCCAGCGAACCATATG-3’，反向引物 R6:5’ -GACGTCGACCTACCACTGCAAACCTGCATGCG-3’。引物分別帶有 EcoR I 和 Sal I酶切位點(diǎn)。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段如圖9所
/Jn ο
[0185]2、黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶基因的克隆
[0186]根據(jù)實(shí)施例9.1獲得的黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F6:5 ’ -GACGAATTCATGGGTGACGCCAGCGAACCATATG-3’，反向引物 R6:5’-GACGTCGACCTACCACTGCAAACCTGCATGCG-3’。以黑曲霉菌株 FY2013 的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。
[0187]3 、兩種烏頭酸酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0188]黑曲霉FY2013葡萄糖脫氫酶氨基酸序列與黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶氨基酸序列相比，發(fā)生下列突變，具體表現(xiàn)為 M226V、N227Y、T376N、A377T、S529P、I530M、H580R。[0189]4、烏頭酸酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0190]將上述的兩種烏頭酸酶PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I (購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切消化后，分別與用相同內(nèi)切酶消化的pET-28b質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (購(gòu)自promega公司)，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，構(gòu)建好的含有黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶編碼基因的載體命名為pET-Aca，含有黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶編碼基因的載體命名為pET-AcaM。相關(guān)表達(dá)載體插入的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定分析并驗(yàn)證正確。
[0191]5、黑曲霉FY2010 和黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶在大腸桿菌中的表達(dá)
[0192]黑曲霉菌株FY2010和菌株FY2013烏頭酸酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白純化方法同實(shí)施例4。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖10。
[0193]6、使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量
[0194]純化蛋白的蛋白含量測(cè)定具體方法同實(shí)施例4。
[0195]7、烏頭酸酶活力的測(cè)定
[0196]對(duì)純化的烏頭酸酶進(jìn)行酶活性分析。具體方法如下:緩沖液46 μ 1、純化的酶液2μ 1,0.1M的檸檬酸溶液2μ 1，混勻，25°C反應(yīng)30min，再加入顯色液10μ 1，混勻，25°C保溫lOmin, 450nm處進(jìn)行比色。一個(gè)酶活力單位定義為:在25°C條件下,每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol朽1檬酸形成異檸檬酸所需的酶量。酶比活力(U/mg)定義為在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
[0197]8、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶酶比活比較
[0198]試驗(yàn)測(cè)得黑曲霉菌株FY2010烏頭酸酶酶比活為14.7U/mg，黑曲霉菌株FY2013烏頭酸酶酶比活為8.lU/mg，黑曲霉菌株FY2013的烏頭酸酶的酶活力下降，這表明黑曲霉菌株FY2013檸檬酸分解代謝減弱,有利于增加檸檬酸的產(chǎn)量。
[0199]實(shí)施例10菌株FY2010與菌株FY2013的α -酮戊二酸脫氫酶酶活力比較研究
[0200]1、黑曲霉菌株 FY2010 α -酮戍二酸脫氫酶(ketoglutarate dehydrogenase, Kdh)基因的克隆
[0201]根據(jù)NCBI公布的黑曲霉α -酮戊二酸脫氫酶基因序列(GenBank:ΧΜ_001401804.2)，由起始密碼子上游50-100個(gè)基因序列和終止密碼子下游50-100個(gè)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物為:5 ’ -GTTGAGCTCATAGCATATTA-3 ’，下游引物為:5’-AGAACGAGCCAACGCTGACT-3’，分別以黑曲霉菌株FY2010和黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增黑曲霉菌株FY2010和FY2013的α -酮戊二酸脫氫酶基因序列，將擴(kuò)增出的序列送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為黑曲霉菌株FY2010C1-酮戊二酸脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.28，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.27 ;黑曲霉菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶的編碼序列見(jiàn)SEQ ID N0.26，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0.25。
[0202]再根據(jù)測(cè)得的黑曲霉菌株FY2010 α -酮戊二酸脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F7:5 ’ -GACGCTAGCATGTTTCGTTCTACTGCCGTTAAGG-3’ ；反向引物 R7:5’-GACGTCGACTTACTCGCCCTTGAGGCGCTCCT-3’。引物分別帶有 Nhe I和Sal I酶切位點(diǎn)。以黑曲霉菌株FY2010的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段如圖11所示。
[0203]2、黑曲霉菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶基因的克隆[0204]根據(jù)實(shí)施例10.1獲得的黑曲霉菌株FY2013C1-酮戊二酸脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，用于構(gòu)建PET表達(dá)載體，其正向引物F7:5’ -GACGCTAGCATGTTTCGTTCTACTGCCGTTAAGG-3 ’ ；反向引物 R7:5 ’ -GACGTCGACTTACTCGCCCTTGAGGCGCTCCT-3 ’。引物分另Ij帶有Nhe I和Sal I酶切位點(diǎn)。以黑曲霉菌株FY2013的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示。
[0205]3、兩種α-酮戊二酸脫氫酶氨基酸序列的同源性分析研究
[0206]黑曲霉FY2013a -酮戊二酸脫氫酶氨基酸序列與黑曲霉菌株FY2010a -酮戊二酸脫氫酶氨基酸序列相比，發(fā)生突變L878F。
[0207]4、a -酮戊二酸脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0208]將上述的兩種a -酮戊二酸脫氫酶PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nhe I和Sal I (購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切消化后，分別與用相同內(nèi)切酶消化的pET_28b質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (購(gòu)自promega公司)，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，構(gòu)建好的含有黑曲霉菌株FY2010 α -酮戊二酸脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-Kdh，含有黑曲霉菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶編碼基因的載體命名為pET-KdhM。相關(guān)表達(dá)載體插入的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定分析并驗(yàn)證正確。
[0209]5、黑曲霉FY2010和黑曲霉菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶在大腸桿菌中的表達(dá)
[0210]黑曲霉菌株FY2010 和菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白純化方法同實(shí)施例4。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖12。
[0211]6、使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量
[0212]純化蛋白的蛋白含量測(cè)定具體方法同實(shí)施例4。
[0213]7、α -酮戊二酸脫氫酶酶活力檢測(cè):
[0214]對(duì)純化的α -酮戊二酸脫氫酶進(jìn)行酶活性分析。具體方法如下:100 μ mol磷酸緩沖液(PH8.0) 1ml，20 μ mol 焦磷酸硫胺素 20 μ 1，20 μ mol MgCl220 μ 1，125 μ mol2, 4-二硝基苯酚(DPN) ,13 μ mol輔酶A20 μ I，260 μ mol鹽酸半胱氨酸20 μ I，260 μ mol α -酮戊二酸鉀20 μ 1，純化的酶液860 μ 1，混勻，室溫放置lOmin，340nm比色。酶活力單位定義:每分鐘催化生成Iymol琥珀酰輔酶A為一個(gè)酶活單位。酶比活力(U/mg)定義為在酶液中每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
[0215]8、黑曲霉菌株FY2010與黑曲霉菌株FY2013 α -酮戊二酸脫氫酶酶比活比較
[0216]試驗(yàn)測(cè)得黑曲霉菌株FY2010的α -酮戊二酸脫氫酶酶比活為:29.lU/mg，黑曲霉菌株FY2013的α-酮戊二酸脫氫酶酶比活為:15.3U/mg，黑曲霉菌株FY2013的酮戊二酸脫氫酶活力下降，這表明黑曲霉菌株FY2013檸檬酸分解代謝減弱，有利于增加檸檬酸的產(chǎn)量。
[0217]實(shí)施例11利用黑曲霉菌株FY2010與高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株FY2013發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸試驗(yàn)
[0218]1、種曲制備
[0219]取5ml無(wú)菌水至黑曲霉菌株FY2010培養(yǎng)的平板(培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、蒸餾水lL，pH自然)上，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，至200ml無(wú)菌水中，輕輕搖晃制成孢子懸液，用于檸檬酸種子罐培養(yǎng)。
[0220]2、種子罐培養(yǎng)[0221]種子罐中加入20L水，然后稱取8kg玉米粉，加入種子罐中，混勻，加入5ml淀粉酶(90000u/ml)，加熱至65-70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92_95°C液化5min，然后將液化液進(jìn)行固液分離，再將液化后分離的糖液重新裝入種子罐中，總糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2ml消泡劑，121°C加熱滅菌20min，然后冷卻至37°C，保溫，接入制備好的菌株FY2010孢子懸液，37°C進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，22h后，取少量種子液鏡檢并測(cè)定其pH值，鏡檢無(wú)污染且菌球生長(zhǎng)良好，當(dāng)種子液PH降至3.0時(shí)，將種子液接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)。
[0222]3、 利用黑曲霉菌株FY2010發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸
[0223]稱取9kg玉米粉、22kg水，6ml淀粉酶，混勻后，加熱至65_70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92-95°C液化5min，液化后對(duì)液化液進(jìn)行固液分離，將糖液裝入發(fā)酵罐中，加入20g/L大豆粉，用檸檬酸調(diào)pH為4.8，并加入消泡劑2ml，110°C加熱滅菌15min，冷卻至37°C，保溫，接入上述培養(yǎng)好的種子液，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵。接種量為10%，接種后總糖控制在19.8%，發(fā)酵溫度為37±1°C，罐壓控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，發(fā)酵時(shí)間為60h。黑曲霉菌株FY2010最終產(chǎn)酸為16.7% (每100ml)，轉(zhuǎn)化率為84.1%。
[0224]4、利用黑曲霉菌株FY2013發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸
[0225]利用黑曲霉菌株FY2013發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸試驗(yàn)具體方法同黑曲霉菌株FY2010生產(chǎn)檸檬酸。發(fā)酵法技術(shù)參數(shù):發(fā)酵時(shí)間為60h。產(chǎn)檸檬酸達(dá)到19.5% (195g/L),轉(zhuǎn)化率為98.5%。
[0226]黑曲霉菌株FY2013檸檬酸合成代謝途徑如圖13所示。
[0227]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.黑曲霉(Aspergillusniger) FY2013，其特征在于，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8832。
2.權(quán)利要求1所述黑曲霉FY2013的部分基因組序列如SEQID N0.59所示。
3.權(quán)利要求1所述黑曲霉FY2013在發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 1)種曲制備: 取5mL無(wú)菌水至黑曲霉菌株FY2013的培養(yǎng)平板上，用接種環(huán)刮下孢子至200mL無(wú)菌水中，制成孢子懸液，用于檸檬酸種子罐培養(yǎng)； 2)種子罐培養(yǎng): 種子罐中加入20L水，然后稱取8kg玉米粉加入種子罐中混勻，加入5mL淀粉酶(90000u/ml),加熱至65-70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92_95°C液化5min，然后將液化液進(jìn)行固液分離，再將液化后分離的糖液重新裝入種子罐中，總糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2mL消泡劑，121 °C加熱滅菌20min，然后冷卻至37°C，保溫，接入制備好的菌株FY2013孢子懸液，37°C進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，22h后，取少量種子液鏡檢并測(cè)定其pH值，鏡檢無(wú)污染且菌球生長(zhǎng)良好，當(dāng)種子液PH降至3.0時(shí)，將種子液接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸； 3)利用黑曲霉菌株FY2013發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸: 稱取9kg玉米粉、22 kg水、6mL淀粉酶，混勻后加熱至65_70°C進(jìn)行糊化30min，再升溫至92-95°C液化5min，液化后對(duì)液化液進(jìn)行固液分離，將糖液裝入發(fā)酵罐中，加入20g/L大豆粉，用檸檬酸調(diào)PH為4.8，并加入消泡劑2mL，110°C加熱滅菌15min，冷卻至37°C，保溫，接入上述培養(yǎng)好的種子液，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，接種量為10%，接種后總糖控制在19.8%，發(fā)酵溫度為37±1°C，罐壓控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，發(fā)酵時(shí)間60h ； 其中，步驟I)中使用的培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、蒸餾水lL，pH自然。
4.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的α-淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
5.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的葡萄糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
6.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
7.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的6-磷酸葡萄糖脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.13所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
8.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的蘋果酸脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.17所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
9.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的烏頭酸酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.21所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
10.與黑曲霉FY2013發(fā)酵檸檬酸合成途徑相關(guān)的α-酮戊二酸脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.25所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N9/04GK103952318SQ201410126298
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】李榮杰, 尚海濤, 徐斌 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司