專利名稱：鑒別毛蜂窩菌(龍眼梳)的特征性核苷酸序列及其探針和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測中藥材真?zhèn)蔚募夹g(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒別毛蜂窩菌(即龍眼梳，Hexagonia apiaria)的特征性核苷酸序列以及核苷酸分子探針和鑒別毛蜂窩菌的方法。
背景技術(shù)：
毛蜂窩菌[Hexagonia apiaria (Pers. ) Fr.],又名龍眼梳，隸屬于非裙菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、蜂窩菌屬(Hexagonia),子實體在腐木上側(cè)生，無柄，扁平，平展至平展反卷，腎形至近半圓形，韌木栓質(zhì)，菌蓋長5 11. 5cm,寬4 6cm，厚O. 7 I. 5cm，黃褐色至灰黑色，被分枝或不分枝的黑色硬粗毛，老熟后部分易脫落，具環(huán)紋和輻射狀皺紋，邊緣薄而銳。菌管表面灰白色、淡黃褐色至赤褐色；菌孔幼時六角 形，管口呈蜂窩狀，直徑I 4mm，孔內(nèi)灰白色，成熟后不規(guī)則形；菌肉棕褐色至銹褐色，厚
O.2 O. 4_。在我國主要分布于廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南、福建、臺灣、香港等地區(qū)。毛蜂窩菌是一種珍稀的藥用真菌，據(jù)《中華本草》記載，毛蜂窩菌微苦、澀、微溫，具理氣止痛、健胃之功效。中醫(yī)上常利用毛蜂窩菌子實體干品10 12克煎湯溫服治療胃病、也有與裂蹄菌、樺褐孔菌、靈芝等混合，加工成超微粉，用溫水沖服輔助治療胃癌；中醫(yī)上還有用毛蜂窩菌子實體水煎服用治療慢性腎炎；在廣東民間，曾有腎結(jié)石患者煎服毛蜂窩菌子實體有排石效果的案例。毛蜂窩菌在藥用及保健方面的開發(fā)利用具有廣闊前景，但在自然界，由于受生長環(huán)境和季節(jié)等條件的限制，野生資源較為稀有，不易獲得，且采收的成本較高，品質(zhì)參差不齊，同時也常常發(fā)生將靈芝、桑黃、擬層孔菌等木生真菌當作毛蜂窩菌的現(xiàn)象，不利于毛蜂窩菌作為醫(yī)藥保健品的開發(fā)和利用。近年來，毛蜂窩菌的人工栽培已獲成功，同時帶動了毛蜂窩野生資源的開發(fā)利用。DNA是生物儲存遺傳信息的物質(zhì)，每個生物物種乃至個體均具有獨特的特征性核苷酸序列，可以作為該生物物種或個體區(qū)別于其他物種或個體的標志。DNA是細胞生物的基本組成部分，作為遺傳信息的載體，具有一定的穩(wěn)定性，不會受表型的影響而改變，是用來鑒別物種、個體的可靠依據(jù)，特別對于原料檢測等已無法進行形態(tài)鑒定的情況特別有效。通過生物信息學的分析可以找到不同物種或個體的特征性核苷酸序列，利用分子生物學的手段對該序列進行探測即可快速、準確的對物種或個體進行鑒別。目前，未見與毛蜂窩菌相關(guān)的核苷酸特征性序列的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供來源于毛蜂窩菌(Hexagonia apiaria)核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1、ITS2以及5. 8S rRNA基因，用于鑒別毛蜂窩菌的特征性核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO. I所示。
本發(fā)明提供的利用分子生物學手段鑒別毛蜂窩菌的特征性核苷酸序列來源于毛蜂窩菌核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1、ITS2以及5. 8S rRNA基因(核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl、ITS2以及5. 8S rRNA基因合并簡稱ITS區(qū))，其序列如SEQ ID NO. I所示，所在位置以及特征見圖I，該序列包含毛蜂窩菌的ITSl、5. 8S rDNA以及ITS2的序列。該序列可通過實施例I所述的方法獲得，亦可通過人工合成的方法在商業(yè)化的DNA合成儀器上按照發(fā)明人提供的核苷酸序列合成。本發(fā)明以上述毛蜂窩菌的特征性核苷酸序列(如SEQ ID NO. I所示)為模板而設(shè)計得到全長序列或不少于16個核苷酸組成的寡核苷酸序列，以及在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)修飾、加工、變化而獲得核苷酸序列，也包括在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上在5’端添加或改變10個核苷酸以 下或改變原有核苷酸序列數(shù)量小于10%以及3’端6個核苷酸改變不足I個核苷酸的核苷酸序列作為毛蜂窩菌鑒定的專一性核苷酸分子探針。上述序列可通過DNA自動合成儀等DNA合成裝置按照設(shè)計好的順序合成而獲得，并可以通過酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等方式進行標記。本發(fā)明的第二個目的是提供一種針對上述ITS區(qū)的如SEQ ID NO. I所示的序列的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針包括Probe I :5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’(序列如 SEQ ID NO. 2 所示)和 Probe II 5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’(序列如 SEQ ID NO. 3 所示)。Probe I,Probe II 的具體位置見圖2，這些序列樣適用于上述修飾、加工與變化、添加酶切位點、改變部分核苷酸序列以及標記等操作。本發(fā)明提供的上述毛蜂窩菌專一'丨生核苷酸分子探針Probe I和Probe II具有極高的專一性，可以與毛蜂窩菌發(fā)生專一性的反應(yīng)而不與其他種類的真菌發(fā)生反應(yīng)。利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交的方法可以快速的對毛蜂窩菌的菌絲體、子實體及其相關(guān)制品進行檢測，從而快速鑒別毛蜂窩菌。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于鑒別毛蜂窩菌的試劑盒，包括核酸分子探針和常規(guī)的PCR反應(yīng)試劑，其特征在于，所述的核酸分子探針為毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針，具體為Probe I :5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’(序列如 SEQ ID NO. 2 所示)和Probe II :5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’(序列如 SEQ ID NO. 3 所示)。所述的用于鑒別毛蜂窩菌的試劑盒，優(yōu)選還含有真菌核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITSl :5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(序列如 SEQ ID NO. 4 所示)和 ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 (序列如SEQ ID NO. 5所示)。以此引物對的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。本發(fā)明的第四個目的是提供一種用于鑒別毛蜂窩菌的方法，其特征在于，是以毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe I :5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’(序列如SEQID NO. 2 所示)和 Probe II :5’ -TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’(序列如 SEQ ID NO. 3 所示)作為引物，利用PCR的方法鑒定毛蜂窩菌。所述的PCR的方法鑒定毛蜂窩菌，優(yōu)選以真菌核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITSl :5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(序列如 SEQ ID NO. 4 所示)和 ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 (序列如SEQ ID NO. 5所示)的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。本發(fā)明還提供了另外一種用于鑒別毛蜂窩菌的方法，其特征在于，是以Probe I :5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’、ITSl :5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 作為引物；或以 Probe II 5，-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3，、ITSl :5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，和 ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作為引物；在同一管中進行PCR，根據(jù)擴增產(chǎn)物條帶鑒定毛
蜂窩菌。PCR方法I :采用前面所述的毛蜂窩菌專一11"生核苷酸分子探針Probe I及Probe II作為一組PCR引物，以如前所述真菌ITS區(qū)通用引物ITSl及ITS4作為陽性對照組的PCR引物，分別利用上述兩組引物按照常規(guī)的PCR方法擴增待測樣品，兩者均能擴增到特異性DNA片段的樣品即為毛蜂窩菌，其中利用Probe I及Probe II獲得的DNA片斷長為293bp左右，利用ITSl及ITS4獲得的DNA片斷長為600bp左右。僅真菌ITS通用引物ITSl及ITS4能夠得到特異性片段而本發(fā)明提供的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針組成的PCR引物ProbeI及Probe II不能擴增到特異性DNA片段的樣品則不是毛蜂窩菌樣品。不能擴增到任何條 帶的樣品，其總DNA不滿足分子鑒定的要求。其中，PCR反應(yīng)可以按照常規(guī)的分子生物學方法提取的毛蜂窩菌樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窩菌樣品加入PCR反應(yīng)體系作為模板。PCR方法2 :采用前面所述的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe I及如前所述真菌ITS區(qū)通用引物ITSl及ITS4作為PCR引物，在同一管中利用PCR方法擴增待測樣品，能擴增到兩條特異性DNA片段的樣品即為毛蜂窩菌，其中兩條DNA片斷長分別為500bp左右及600bp左右。僅能擴增到一條特異性DNA片段的樣品則不是毛蜂窩菌樣品。不能增到任何條帶的樣品，其總DNA不滿足分子鑒定的要求。其中，PCR反應(yīng)可以按照常規(guī)的分子生物學方法提取的毛蜂窩菌樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窩菌樣品加入PCR反應(yīng)體系作為模板。PCR方法3 :采用前面所述的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe II及如前所述真菌ITS區(qū)通用引物ITSl及ITS4作為PCR引物，在同一管中利用PCR方法擴增待測樣品，能擴增到兩條特異性DNA片段的樣品即為毛蜂窩菌，其中兩條DNA片斷長分別為400bp左右及600bp左右。僅能擴增到一條特異性DNA片段的樣品則不是毛蜂窩菌樣品。不能擴增到任何條帶的樣品，其總DNA不滿足分子鑒定的要求。其中，PCR反應(yīng)可以按照常規(guī)的分子生物學方法提取的毛蜂窩菌樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窩菌樣品加入PCR反應(yīng)體系作為模板。本發(fā)明的毛蜂窩菌專一'丨生核苷酸分子探針Probe I和Probe II具有極高的專一性，可以與毛蜂窩菌發(fā)生專一性的反應(yīng)而不與其他種類的蟲草或其他真菌發(fā)生反應(yīng)。利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交或熒光定量PCR的方法可以快速的對毛蜂窩菌及其相關(guān)制品進行檢測。本發(fā)明由于采用DNA序列作為檢測標記，因此可以準確、快速的檢測未知樣品是否為或含有毛蜂窩菌，其中樣品可以為子實體、其粉碎加工產(chǎn)品及包含有毛蜂窩菌的中成藥制劑、保健品。采用PCR方法檢測時，所需樣品量極少，方法簡單，半天內(nèi)可完成檢測。


圖I是核糖體rRNA基因結(jié)構(gòu)示意圖，其中標示為ITS區(qū)的范圍為本發(fā)明涉及的DNA序列，即核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1、ITS2以及5. 8S rRNA基因；圖2是本發(fā)明所述的毛蜂窩菌特征性核苷酸序列全序列以及毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe I、Probe II的位置圖，該圖顯示ITS區(qū)正鏈序列，左側(cè)為5’端，右側(cè)為3’端，其中下劃 線部分分別為Probe I (位于正鏈上)、Probe II (位于負鏈上)；圖3是實施例3中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌；M為DNA分子量標準。圖4是實施例4中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌；M為DNA分子量標準。圖5是實施例5中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌；M為DNA分子量標準。圖6是實施例6中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌；M為DNA分子量標準。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :鑒別毛蜂窩菌的特征性核苷酸序列(rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5. 8S rRNA基因)的制備取毛蜂窩菌樣品O. 1-0. 5g，液氮中研磨成粉，加入300 μ L尿素提取液(SDS I. 5%，尿素 7mol/L, Tris-HCl ρΗ8· O O. 05mol/L, NaCl O. 5mol/L),移入 I. 5mL 微型離心管中,在液氮中冷卻，迅速移到65°C融化。反復(fù)凍融:Γ5次后，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)，震蕩，13000r/min離心IOmin,上清移入新管中加入等體積氯仿異戍醇(24
I)，震蕩，13000r/min離心IOmin,上清移入新管中加入微量Rnase A, 37°C保溫30min,加A 3倍體積無水乙醇，3M NaAc (pH5. 2)，-20 °C放置至少30min后，13000rpm離心15min,回收DNA沉淀，用70%乙醇和無水乙醇洗滌，抽干或風干，每管加入50 μ L TE (IOOmmoI/LTris-Cl, lOmmol/LEDTA, pH8. O)回溶，獲得毛蜂窩菌的總 DNA。取O. 2ml PCR管一支，加入20 μ L PCR反應(yīng)液(包括IOxPCR緩沖液2 μ L，引物ITS1、ITS4 各 40ng，2mmol/L dNTP I μ L，Taq 酶 I 個單位，加超純水至 20 μ L)，加入 O. 5 μ L毛蜂窩菌總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應(yīng)94° C預(yù)變性3min，然后93° C變性lmin，50° C復(fù)性lmin，72° C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72° C延伸lOmin。反應(yīng)完成后利用商業(yè)化的純化試劑盒進行產(chǎn)物的純化并直接在DNA測序儀上測序。獲得核苷酸序列即為鑒別毛蜂窩菌的特征性核苷酸序列(rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1、ITS2以及5. 8SrRNA基因，圖1)，其序列如SEQ ID NO. I所示。實施例2 毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針(引物)PiObe I，Probe II的制備將毛蜂窩菌的ITS區(qū)序列與其他真菌的同源序列進行比較，獲得最適于鑒別毛蜂窩菌寡核苷酸片段組成與排列順序，即Probe I (如SEQ ID NO. 2所示)，Probe II (如SEQID NO. 3所示)。如圖2所示，Probe I位于正鏈上；Probe II位于負鏈上。根據(jù)Probe I,Probe II的核苷酸排列和組成可以在商業(yè)化的DNA合成儀上通過化學合成的方法合成，即可用作毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針(引物)。再此基礎(chǔ)上，可以利用常規(guī)的分子生物學方法利 用酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等對Probe I及Probe II進行標記，即可用做雜交用探針。實施例3 鑒定毛蜂窩菌的正對照試驗本試驗用以確定DNA樣品符合PCR要求可獲得特異性PCR產(chǎn)物。方法I :總DNA提取參照實施例I進行，對不同的樣品(日本平芝，牛樟芝，有柄靈芝，擬層孔菌，桑黃及毛蜂窩菌)分別提取DNA，再進行PCR擴增，各個樣品的PCR反應(yīng)體系為20yL PCR 反應(yīng)液(包括 IOxPCR 緩沖液 2 μ L，引物 ITSl、ITS4 各 40ng，2mmol/L dNTPI μ L，Taq酶I個單位，加超純水至20 μ L)，加入O. 5 μ L各個樣品的總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應(yīng)94° C預(yù)變性3min，然后93° C變性lmin，50° C復(fù)性lmin，72° C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72° C延伸lOmin。擴增的產(chǎn)物在1%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當?shù)淖贤夤庠聪虏榭匆约芭恼铡７椒? :用牙簽直接挑取適量的各個樣品(粉碎子實體、粉碎的相關(guān)制品)(日本平芝，牛樟芝，有柄靈芝，擬層孔菌，桑黃及毛蜂窩菌)在裝20 μ L超純水的O. 2mL PCR管中攪動，并分別稀至O. I倍以及O. Ol倍，取2 μ L上述三個濃度的樣品懸濁液加入含有20 μ LPCR 反應(yīng)液(包括 IOxPCR 緩沖液 2 μ L，引物 ITSl、ITS4 各 40ng，2mmol/L dNTP I μ L, Taq酶I個單位，加超純水至20 μ L)的O. 2m L PCR管中，充分混勻閉緊管蓋，全部PCR管置于PCR儀上進行如下PCR反應(yīng)94° C預(yù)變性3min，然后93° C變性lmin，50° C復(fù)性lmin，72° C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72° C延伸lOmin。擴增的產(chǎn)物在1%的含有DNA著色劑的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當?shù)淖贤夤庠聪虏榭匆约芭恼?。圖3為按方法I進行的實驗結(jié)果，顯示六種真菌(I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌)均可正常的擴增得到ITS區(qū)DNA特異性片段，該結(jié)果表明待測真菌提取的總DNA符合PCR擴增的要求，可以用作專一性檢測的待測樣品。實施例4 毛蜂窩菌專一性鑒別利用Probe I及Probe II作為引物。用以從符合PCR要求的樣品中專一性的擴增毛蜂窩菌，從而鑒別毛蜂窩菌。方法I :使用實施例3方法I中符合PCR反應(yīng)要求的樣品，以這些樣品的總DNA作為模板，參照實施例I中方法進行PCR擴增，其中引物替換為Probe I及Probe II。方法2 :使用實施例3方法2中符合PCR反應(yīng)要求的樣品懸濁液，如實施例3中方法2所述進行PCR反應(yīng)，其中引物替換為Probe I及Probe II。圖4為按方法I進行的實驗結(jié)果，顯示六種真菌(I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌)中僅毛蜂窩菌被專一性的擴增獲得300bp左右的特異性DNA片段，而其他真菌均無特異性DNA片段被擴增，該結(jié)果表明，毛蜂窩菌專一性核苷酸探針(引物)Probe I及Probe II可以從多種真菌中準確的鑒別出毛蜂窩菌，同時根據(jù)實施例3排除了假陰性(不符合PCR擴增條件而造成的陰性結(jié)果)的可能。實施例5 毛蜂窩菌專一性鑒別利用Probe I及ITSl、ITS4作為引物。
用以直接在樣品中專一性的擴增毛蜂窩菌，同時評價總DNA質(zhì)量，從而鑒別毛蜂窩菌。方法I :參照實施例3方法I所述方法進行總DNA提取及PCR擴增，不同之處在于20 μ LPCR反應(yīng)液還包含引物Probe I 4 ng。方法2 :參照實施例3方法2所述方法進行PCR反應(yīng)，不同之處在于20 μ L PCR反應(yīng)液還包含引物Probe I 4 ng。圖5為按方法I進行的實驗結(jié)果，顯示六種真菌(I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌)中僅毛蜂窩菌擴增獲得500bp左右及600bp左右兩條特異性DNA片段，而其他真菌均獲得一條600bp左右特異性DNA片段，該結(jié)果表明，毛蜂窩菌專一性核苷酸探針(引物)Probe I及真菌通用引物ITSl、ITS4同時作為引物時，可以從多種真菌中準確的鑒別出毛蜂窩菌，同時排除了假陰性(不符合PCR擴增條 件而造成的陰性結(jié)果)的可能。實施例6:毛蜂窩菌專一性鑒別利用Probe II及ITSl、ITS4作為引物。用以直接在樣品中專一性的擴增毛蜂窩菌，同時評價總DNA質(zhì)量，從而鑒別毛蜂窩菌。方法I :參照實施例3方法I所述方法進行總DNA提取及PCR擴增，不同之處在于20 μ LPCR反應(yīng)液還包含引物Probe II 4 ng。方法2 :參照實施例3方法2所述方法進行PCR反應(yīng)，不同之處在于20 μ L PCR反應(yīng)液還包含引物Probe II 4 ng。圖6為按方法I進行的實驗結(jié)果，顯示六種真菌(I為日本平芝；2為牛樟芝；3為有柄靈芝；4為擬層孔菌；5為桑黃；6為毛蜂窩菌)中僅毛蜂窩菌擴增獲得400bp左右及600bp左右兩條特異性DNA片段，而其他真菌均獲得一條600bp左右特異性DNA片段，該結(jié)果表明，毛蜂窩菌專一性核苷酸探針(引物)Probe II及真菌通用引物ITS1、ITS4同時作為引物時，可以從多種真菌中準確的鑒別出毛蜂窩菌，同時排除了假陰性(不符合PCR擴增條件而造成的陰性結(jié)果)的可能。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別毛蜂窩菌(Hexagonia apiaria)的特征性核苷酸序列,其特征在于,其序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種用于鑒別毛蜂窩菌的專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針包括 Probe 1:5，-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3，和 Probe 11 5’ -TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’。
3.一種用于鑒別毛蜂窩菌的試劑盒，包括核酸分子探針和常規(guī)PCR反應(yīng)試劑，其特征在于，所述的核酸分子探針為權(quán)利要求2所述的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe I 5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’ 和 Probe II :5’ -TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還含有真菌核糖體 rRNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITSl :5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
5.一種用于鑒別毛蜂窩菌的方法，其特征在于，是以權(quán)利要求2所述的毛蜂窩菌專一性核苷酸分子探針Probe 1:5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’ 和 Probe II 5’ -TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’作為引物，利用PCR的方法鑒定毛蜂窩菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于鑒別毛蜂窩菌的方法，其特征在于，所述的用PCR的方法鑒定毛蜂窩菌，還以真菌核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITSl 5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTAITGATATGC-3’ 的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。
7.—種用于鑒別毛蜂窩菌的方法，其特征在于，是以Probe I 5’ -ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’、ITSl :5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 作為引物；或以 Probe II 5，-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3，、ITSl :5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作為引物，在同一管中進行PCR，根據(jù)擴增產(chǎn)物條帶鑒定毛蜂窩菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別毛蜂窩菌(龍眼梳)的特征性核苷酸序列及其探針和方法。所述的用于鑒定毛蜂窩菌(Hexagonia apiaria)的特征性核苷酸序列來自毛蜂窩菌核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其序列如SEQ ID NO.1所示。以此特征性核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計的核苷酸分子探針Probe I(如SEQ ID NO.2所示)和Probe II(如SEQ ID NO.3所示)，以及包含該核酸分子探針的鑒定試劑盒，以及利用該探針通過PCR鑒別毛蜂窩菌的方法。利用本發(fā)明，可以方便、快速、準確的進行毛蜂窩菌及相關(guān)制品的快速鑒定，本發(fā)明使用分子生物學手段排除了鑒定中的人為影響、鑒定結(jié)果客觀準確，鑒定時間短，半天即可完成。
文檔編號C12Q1/68GK102776292SQ20121029250
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者李浩華, 潘清靈, 王磊, 章衛(wèi)民, 譚國慧, 陳玉嬋, 陶美華 申請人:廣東省微生物研究所