一種高效降解煙嘧磺隆的黑曲霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效降解煙嘧磺隆的黑曲霉菌及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明所述黑曲霉菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.8438。本發(fā)明涉及的黑曲霉菌能夠在5天內(nèi)將400mg·L-1的煙嘧磺隆完全降解，不污染環(huán)境，生態(tài)安全，是一株在受磺酰脲類除草劑污染土壤修復(fù)中有較高應(yīng)用價(jià)值菌株，具備實(shí)際應(yīng)用意義和價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種高效降解煙嘧磺隆的黑曲霉菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，特別是涉及黑曲霉在受磺酰脲類除草劑污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
[0002]
技術(shù)背景
[0003]磺酰脲類除草劑是目前世界上使用量最大的一類除草劑，它是由美國(guó)杜邦公司于20世紀(jì)70年代研究成功，并于1982年首次開(kāi)發(fā)出麥田除草劑氯磺隆，之后又開(kāi)發(fā)出許多的高效、廣譜、低毒、高選擇性磺酰脲類除草劑。此類除草劑作用于植物的乙酰乳酸合成酶(ALS)，導(dǎo)致無(wú)法合成支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)，從而使細(xì)胞受到抑制，對(duì)許多一年生或多年生雜草有特效，廣泛應(yīng)用于防除稻田、大豆田、玉米田、麥類作物田、油菜田、草坪和其他非耕地雜草。由于該類除草劑對(duì)哺乳動(dòng)物具有低的毒性，使用量很低，除草活性高等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)普遍應(yīng)用。不僅如此，磺酰脲之所以快速發(fā)展并被很好接受的原因還在于其與環(huán)境相容性好，該類除草劑應(yīng)用面積在不斷擴(kuò)大，新的品種也不斷產(chǎn)生，至今已有幾十個(gè)品種被商品化。我國(guó)目前廣泛應(yīng)用的磺酰脲類除草劑品種主要有吡嘧磺隆、煙嘧磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、芐嘧磺隆等，能防除大多數(shù)禾本科和闊葉雜草。
[0004]磺酰脲類除草劑自問(wèn)世以來(lái)，為世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作出了巨大的貢獻(xiàn)，由于其具有極高的殘留活性和選擇性，在其使用過(guò)程中已遇到一些難題，最突出的就是對(duì)后茬作物的長(zhǎng)殘留藥害問(wèn)題，由于該類除草劑的遷移淋溶性較弱，當(dāng)其殘留達(dá)到一定劑量后就會(huì)對(duì)后茬作物造成藥害。煙嘧磺隆、綠磺隆、甲磺隆已成為我國(guó)長(zhǎng)殘效除草劑品種。該類除草劑具有選擇性強(qiáng)、生物活性高的優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)不同作物的敏感性差異很大，例如在土壤中殘留的氯磺隆和甲黃隆就很容易對(duì)后茬敏感作物產(chǎn)生藥害。
[0005]農(nóng)藥在防治病蟲(chóng)害中發(fā)揮著重要的作用，隨著農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥特別是化學(xué)農(nóng)藥在其生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存、使用過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成的污染也越來(lái)越嚴(yán)重。微生物的資源豐富、處理相對(duì)簡(jiǎn)單、容易進(jìn)行篩選誘變和通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建高效能新菌株或者通過(guò)降解酶系統(tǒng)及降解酶的固定化可更有效的處理農(nóng)藥污染。農(nóng)藥的微生物降解研究開(kāi)始于20世紀(jì)40年代末，60年代中后期由于大規(guī)?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用帶來(lái)了日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，農(nóng)藥的微生物降解研究越來(lái)越受到重視。本課題組研究人員對(duì)除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、殺線蟲(chóng)劑的微生物降解進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，通過(guò)近幾年研究工作，已經(jīng)確定了土壤和水環(huán)境的農(nóng)藥降解中微生物起了主要作用，分離到一批能降解或轉(zhuǎn)化某種農(nóng)藥的微生物類群，在實(shí)踐生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種新的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株,所述菌株對(duì)磺酰脲類除草劑有明顯的降解作用。[0008]本發(fā)明所述的黑曲霉(Aspergillus niger)于2013年11月6日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8438。
[0009]本發(fā)明所提供的黑曲霉是從煙嘧磺隆農(nóng)藥廠的污水處理池中分離得到的，其實(shí)驗(yàn)室命名為菌株 NDl (nicosulfuron degradation)。
[0010]將菌株NDl在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)特征、測(cè)量菌落生長(zhǎng)速度，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形狀及孢子大小、形狀、類型等。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，自中伸出，直徑15~20pm，長(zhǎng)約1~3mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」?，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀，直徑2.5~4.0 μ m。分生孢子頭球狀，直徑700~800 μ m,褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》等方法初步鑒定菌株NDl為黑曲霉屬，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其ITS序列鑒定后該菌為黑曲霉Aspergillus niger。
[0011 ] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述黑曲霉在受磺酰脲類除草劑污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選地，磺酰脲類除草劑為煙嘧磺隆。煙嘧磺隆是一種重要的磺酰脲類除草劑，可以防除一年生和多年生禾本科雜草、部分闊葉雜草。研究表明，對(duì)藥敏感性強(qiáng)的雜草有禆草、狗尾草、野燕麥、反枝莧；敏感性中等的雜草有本氏寥、律草、馬齒莧、鴨舌草、蒼耳和苘麻、莎草；敏感性較差的雜草主要有藜、龍葵、鴨趾草、地膚和鼬瓣花。
[0013]進(jìn)一步的，本發(fā)明的黑曲霉菌可以制成微生物菌劑，即將本發(fā)明的上述菌株接種于馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，在25°C _30°C、搖床轉(zhuǎn)數(shù)125r/min-150r/min的條件下，培養(yǎng)3-4天，并調(diào)節(jié)孢子濃度為I X IO6個(gè)/mL，即制得本發(fā)明黑曲霉菌的2級(jí)培養(yǎng)液；隨后進(jìn)行如下的固體發(fā)酵:將麩皮、稻草、玉米粉、稻殼按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入適量的水使之濕度達(dá)到100%后滅菌備用，將IOmL上述黑曲霉菌的2級(jí)培養(yǎng)液加入到三角瓶中在25°C -30°C發(fā)酵培養(yǎng)3-4天后制得本發(fā)明所述微生物菌劑。
[0014]本發(fā)明的效果
1、在400 mg -L-1煙嘧磺隆的PDA平板中，本發(fā)明的黑曲霉菌株對(duì)煙嘧磺隆有較強(qiáng)的降解作用，在37°C條件下培養(yǎng)Id后，產(chǎn)生透明圈。
[0015]2、將本發(fā)明所述菌株制成微生物菌劑后，對(duì)煙嘧磺隆有較強(qiáng)的降解作用，在培養(yǎng)
24h時(shí)開(kāi)始降解煙嘧磺隆，培養(yǎng)到5 d即可將煙嘧磺隆完全降解。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)煙嘧磺隆有較高降解作用的黑曲霉菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，這些都被視為包括在被發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述的黑曲霉已經(jīng)通過(guò)較規(guī)范的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不擺脫本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)和適當(dāng)?shù)淖兏c組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1本發(fā)明黑曲霉菌株的分離
1、水樣中微生物的馴化處理與富集培養(yǎng)
向供試水樣中添加煙嘧磺隆，使其含量為400 !!^?171，將其置于301:、150 r.HIirT1條件下馴化培養(yǎng)14 d，取5 mL經(jīng)馴化的水樣加入到50 mL含200 mg.L-1煙嘧磺隆的富集培養(yǎng)基中，置于30°C、150 r ^mirT1條件下振蕩培養(yǎng)7 d，然后再取5 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到50 mL含200 mg.L-1煙嘧磺隆的富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，如此重復(fù)，共計(jì)5次。
[0019]2、可降解煙嘧磺隆微生物的菌株篩選
將上述經(jīng)馴化后的含有水樣微生物的培養(yǎng)基，將其均勻涂布到含有400 mg -L-1煙嘧磺隆的PDA平板上，在30°C條件下培養(yǎng)48~96 h后，挑取能產(chǎn)生透明圈的單菌落繼續(xù)在PDA平板上純化培養(yǎng)并保存菌種。
[0020]實(shí)施例2本發(fā)明所述黑曲霉菌株的鑒定 I形態(tài)學(xué)鑒定
根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》等方法，采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)特征、測(cè)量菌落生長(zhǎng)速度，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形狀及孢子大小、形狀、類型等。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，自中伸出，直徑15~20pm，長(zhǎng)約I~3_，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀，直徑2.5~4.0 μ m。分生孢子頭球狀，直徑700~800 μ m,褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》、等方法初步鑒定菌株NDl為黑曲霉屬(Aspergillusniger )。
[0021]2分子生物學(xué)鑒定
ITS鑒定:將篩選菌株的孢子液接入ro液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)48 h，過(guò)濾獲得菌絲，提取真菌基因組DNA。以提取的真菌DNA作為模板，以ITS5和ITS8引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，反應(yīng)體系為:基因組DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L, NSl引物 I μ L，NS8 引物 I μ L，dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反應(yīng)條件為:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循環(huán) 30 次；72°C 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，將獲得的DNA序列，輸入NCBI，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。經(jīng)過(guò)序列分析顯示，與其同源的序列黑曲霉菌株序列，且同源性菌在94%以上，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明所分離的菌株屬于黑曲霉(Aspergillusniger)。
[0022]實(shí)施例3本發(fā)明黑曲霉對(duì)煙嘧磺隆的降解效率
將煙嘧磺隆放于PDA培養(yǎng)基中，使其終濃度為400 mg.L-1，并制備PDA平板，待培養(yǎng)基完全凝固后，打取黑曲霉菌盤(pán)，將其放置于煙嘧磺隆PDA平板中央，置于37°C溫箱中培養(yǎng)Id后，檢測(cè)降解圈的有無(wú)及大小。
[0023]重復(fù)測(cè)試，基本方法同上，每平板點(diǎn)接3個(gè)菌株，各3次重復(fù)。
[0024]經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述黑曲霉對(duì)煙嘧磺隆有較強(qiáng)的降解作用，24h后產(chǎn)生透明降解圈，降解圈的直徑為3.8mm,如表1所不。
[0025]表1黑曲霉對(duì)煙嘧磺隆的降解圈:
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8438，其于2013年11月6日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉在受磺酰脲類除草劑污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于，所述磺酰脲類除草劑為煙嘧磺隆。
4.一種微生物菌劑，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的黑曲霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，在25°C -30°C、搖床轉(zhuǎn)數(shù)125r/min-150r/min的條件下，培養(yǎng)3_4天，并調(diào)節(jié)孢子濃度為IXlO6個(gè)/mL，即制得所述黑曲霉菌的2級(jí)培養(yǎng)液；隨后進(jìn)行如下的固體發(fā)酵:將麩皮、稻草、玉米粉、稻殼按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入適量的水使之濕度達(dá)到100%后滅菌備用，將IOmL上述黑曲霉菌的2級(jí)培養(yǎng)液加入到三角瓶中在25°C -30°C發(fā)酵培養(yǎng)3-4天后制得微生物菌劑。
5.一種生物降解肥料，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的黑曲霉的孢子液與無(wú)機(jī)肥料、有機(jī)肥料相混合制得，三者的重量比為1:6:13 ;所述無(wú)機(jī)肥料選自氮肥、磷肥和鉀肥，所述氮肥為尿素或硫酸銨，所述磷肥為磷酸銨或磷酸鈣，所述鉀肥為硫酸鉀或氯化鉀；所述有機(jī)肥料為堆肥或沼氣肥。
6.一種生物降解肥料，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的黑曲霉的孢子液與微肥、有機(jī)肥料相混合制得，三者的重量比為1:3:6 ;所述微肥選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述有機(jī)肥料為堆肥或沼氣肥。
【文檔編號(hào)】C12R1/685GK103805519SQ201310562398
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】趙斌, 張金林, 董金皋, 邢繼紅, 霍靜倩 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)