專利名稱：一種黑曲霉菌及用其生產香草酸和香草醛的微生物轉化方法
所屬領域本發(fā)明涉及一種新的用于微生物轉化反應生產香草酸和香草醛的黑曲霉菌(Aspergillus niger)，以及利用該黑曲霉菌生產香草酸和香草醛的微生物轉化方法。
背景技術：
香草酸(Vanillic acid)即4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(4-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid)，又稱香莢蘭酸，分子式為C8H8O4，分子量168.15。作為香草醛生物合成途徑中的中間體，與香草醛同屬肉桂酸類衍生物，廣泛存在于自然界中，如在香莢蘭豆、香子蘭的莢、秘魯香膏、安息香膏、爪哇香毛油、丁香花蕾油、丁子香芽油中等許多植物及精油中均有發(fā)現(xiàn)。
香草醛(Vanillin)，即香蘭素，又名香草素、香蘭醛或香茅醛，化學名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)。分子式C8H8O3，分子量152.15。
隨著世界各國對食品安全越來越重視，對天然香草醛的需求越來越大。由于采用植物組織提取的方法生產的天然香草醛產率低，成本高，價格昂貴，不能滿足日益增長的需求，由此促使研究人員去尋找生產天然香蘭素的替代方法。天然香料是指由動植物材料經物理(包括蒸餾、溶劑萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通過傳統(tǒng)的食品加工方法(包括干燥、焙烤、發(fā)酵)加工后用于人類消費的物質。用生物法生產的香草醛，屬天然產品，可以生物降解，符合消費者追求天然產品的消費心理。因此，利用微生物細胞轉化等生物技術過程生產生物香蘭素，成為一種有效的、很有前途的替代方法。
許多微生物(包括細菌、放線菌和霉菌)都可以降解阿魏酸產生香草醛，已有很多報道絲狀真菌和擔子菌類的白腐真菌，可以轉化阿魏酸生成香草酸或香草醛，但香草醛的產量總是很低。一般情況下香草醛只是代謝的中間產物，會繼續(xù)發(fā)生降解而不易積累。已報道微生物轉化法的研究有多種技術路線。如瑞士GivaudanRoure研究公司的MuheimAndreas等人申請了專利(USP6,235,507)，用Streptomyces.setoniiATCC 39116培養(yǎng)5～40h，至碳源葡萄糖幾乎消耗完后，在發(fā)酵液中按分批方法添加阿魏酸5～40g/L，繼續(xù)培養(yǎng)(生物轉化)約5～50h，阿魏酸轉化香草醛積累達到8～16g/L，但副產物較多，有香草醇、香草酸、愈創(chuàng)木酚、對-乙烯基愈創(chuàng)木酚和2-甲基4-乙基-苯酚等，不利于轉化產物的分離提取。
法國國家農業(yè)研究所(INRA，Institut National de la Recherche Agronomique)生物技術實驗室的Asther Marcel的課題組開發(fā)了用絲狀真菌二步法生產香草醛工藝，在該工藝中先用黑曲霉(Aspergillus niger)將阿魏酸轉化為香草酸，再用朱紅密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)或黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)將香草酸還原成香草醛。Lesage-Meessen L等申請了專利(US6,162,637)。用黑曲霉菌株Aspergillus niger MIC 373的發(fā)酵培養(yǎng)液，按每24小時加阿魏酸430mg/L均衡方式添加了5.05g/L阿魏酸。培養(yǎng)發(fā)酵15天后HPLC檢測培養(yǎng)液中的香草酸最終濃度為3.30g/L，添加的阿魏酸完全消耗，很大部分轉化為香草酸(82％)，小部分(2％)為代謝產物甲氧基氫醌，沒有香草醛和香草醇。添加大豆磷脂激活阿魏酸向香草酸的生物轉化，以加快生物轉化。提取的香草酸用作生物轉化香草醛的前體，并選用選擇性樹脂XAD-2使培養(yǎng)基中的香草醛濃度減少，減小了香草醛對菌體的毒性，也同時限制了進一步還原成香草醇，香草醛的濃度達到1,575mg/L(Stenielaire C.，Lesage-meessen.L.，Oddou J.等，J of Biosci and Bioengineering.2000，89，223-230)。但該方法生物轉化阿魏酸到香草酸的時間仍然很長，需要6-7天，生產效率低。而且，發(fā)酵培養(yǎng)需要添加大豆磷脂、鹽酸硫胺素(VB1)等促生長劑，增加了生產成本。另外，轉化產物中仍然含有較多量的甲氧基氫醌，給分離與后續(xù)香草醛的轉化帶來困難。
技術方案本發(fā)明的目的是提供一種能有效轉化反式阿魏酸為香草酸的微生物新菌株，并提供一種新的微生物轉化反應生成香草酸和香草醛的方法。
本發(fā)明的能有效轉化反式阿魏酸為香草酸的微生物新菌株，在馬鈴薯或米飯培養(yǎng)基上，菌絲生長初期無色，成熟時為深褐色至近黑色。菌絲有分隔，有厚壁而膨大的足細胞，有直立的分生孢子梗有子囊，孢子頭上有?；咦宇^黑色孢子頭球形至放射形，緊接頂囊處分生孢子梗不縊縮，分生孢子梗光滑。根據K.B.Raper和D.I.Fennell《曲霉屬》(The Genus Aspergillus，1965)，該菌株具有典型的黑曲霉表征。對照《真菌鑒定手冊》(魏景超遺著，上?？茖W技術出版社，1979，上海p609～638)，按渥侖韋柏和萊因欽(Wollenweber & Reinking)的分類系統(tǒng)，應屬于曲霉屬中的黑曲霉Aspergillus niger，命名為黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305。
此菌株是選擇Aspergillus nigerSW-33為出發(fā)菌株，按常規(guī)方法進行紫外線、C0-60誘變處理制得。紫外線照射為15W，距離27cm，時間2～3分鐘；C0-60照射為劑量2～8萬倫琴，時間為20～30分鐘。經處理的菌絲體移種到含香草酸的基本培養(yǎng)基及完全培養(yǎng)基上，20～40℃培養(yǎng)3～7天，檢出在含香草酸的基本培養(yǎng)基不長、在完全培養(yǎng)基上生長的菌落。與此同時，將上述誘變和篩選的菌絲體移種到含阿魏酸的篩選培養(yǎng)基上，20～40℃培養(yǎng)3～7天，檢出不生長或生長勢較弱的菌落。
含香草酸或阿魏酸的基本培養(yǎng)基包含Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、維生素、微量元素溶液和瓊脂諸組分。
此菌株已于2002年7月19日保存在中國北京中關村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號CGMCC No.0774。
本發(fā)明生產香草酸的微生物轉化方法，包括(1)將菌株SW-3305進行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得濕菌絲體或用卡拉膠等載體固定化后作為生物催化劑；(2)以米糠、麩皮等為原料，采用微生物或酶降解法，制備得到的反式阿魏酸，精制后配制成溶液作為生物轉化底物；(3)將(1)的發(fā)酵液，或過濾收集的濕菌絲體，或用卡拉膠等載體固定化后的濕菌絲體，加入(2)的底物溶液進行轉化反應，生成香草酸；(4)將(3)的轉化液，用乙酸乙酯萃取，再脫水，脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得到白色粉狀結晶香草酸。
轉化用菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖1～10％，馬鈴薯浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％，pH6～9的培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養(yǎng)3～7天。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵麥芽糖5～50g/L、酒石酸二銨0～10g/L、酵母膏1～5g/L、磷酸二氫鉀0～2g/L、氯化鈣1～10g/L、硫酸鎂0～5g/L，pH值為4～9的培養(yǎng)基，裝液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％，20～40℃，搖瓶轉速100～250r/min。在上述條件下進行搖瓶發(fā)酵試驗，培養(yǎng)1～5天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
底物阿魏酸鈉鹽溶液的制備用0.1N的NaOH溶液，按每g阿魏酸約66ml的堿溶液配制成100g/L的鈉鹽溶液，中和至中性(終pH7.2)，經微孔濾膜無菌過濾后作為底物，避光保藏待用。
微生物轉化反應用培養(yǎng)后的發(fā)酵液作為酶源，以阿魏酸鈉鹽溶液為底物，底物濃度為1～10g/L，加濕菌體量為1～50g/g底物，轉化反應溫度為20～50℃，轉化反應時間為5～48小時。在此條件下所得的轉化液進行高壓液相色譜分析(HPLC)及薄層層析法(TLC)測定表明，已轉化的主要組分為香草酸。
或者，發(fā)酵產得濕菌絲體，或用生理鹽水制成菌絲體懸液，以海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質等載體包埋等方法制得固定化細胞。以此作為酶源進行生物轉化。菌絲體或固定化細胞可反復回用，進行多次生物轉化反應。
分批補料轉化法于發(fā)酵培養(yǎng)基中，或菌絲體懸浮液中，每天一次加入阿魏酸0.1g的阿魏酸鈉鹽底物溶液進行轉化，連續(xù)四天，最后一次加底物后再轉化24小時。
阿魏酸與香草酸的HPLC測定柱型為RP-18(Lichrospher 100，5μm，125×4mm)。分步洗脫溶劑為A0.01％的醋酸溶液和B甲醇。洗脫曲線開始為B 20％，A 80％，維持4min，第24min增加B至40％，第27min增加B至100％，維持2min，第30min再回至B 20％。流速為1ml/min，紫外檢測波長為280nm。
阿魏酸與香草酸的TLC測定硅膠GF254層析板(上海+++++廠)，將待測轉化樣品用乙酸乙酯萃取后靜置分層，用微量進樣器在干燥的薄板上點樣，將薄板放入層析缸中層析。展開劑正己烷∶三氯甲烷∶五水乙醚∶冰醋酸的比例4∶3∶2∶0.1。碘蒸氣顯色，呈現(xiàn)黃褐色色斑。
香草酸的提取發(fā)酵液用布氏漏斗濾去菌絲體，收集發(fā)酵液，真空蒸發(fā)濃縮，以等體積的乙酸乙酯萃取，飽和氯化鈉溶液，反萃乙酸乙酯萃取液，再進一步無水硫酸鈉脫水。乙酸乙酯萃取脫水液中加入1-4％(w/v)的活性炭，加熱脫色過濾，收集濾液。將所得的脫色有機相再次真空蒸發(fā)，回收乙酸乙酯，蒸至晶體將要析出時停止，傾出，于培養(yǎng)皿中，干燥，得白色或微黃色粉狀結晶香草酸，稱重。
本發(fā)明生產香草醛的微生物轉化方法，是用含香草酸的轉化液，或者用提取的結晶香草酸，加入朱紅密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW-0203發(fā)酵培養(yǎng)液，得到轉化產物香草醛。


圖1是本發(fā)明的工藝流程示意圖。
有益效果本發(fā)明微生物轉化法相對于傳統(tǒng)的化學合成法或從香蘭屬植物中提取的方法具有以下優(yōu)點①有害物質含量極低，安全無毒副作用；②可進行大規(guī)模生產，不受季節(jié)影響；③生產操作簡便，產品得率高；④比提取法費用低，節(jié)省成本；⑤反應條件溫和，環(huán)境友好。
本發(fā)明的優(yōu)點是選育了一株能使阿魏酸轉化成香草酸、且不利用不降解香草酸的微生物菌株黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305(即CGMCCNo.0536)，而且，發(fā)酵培養(yǎng)不需添加大豆磷脂、鹽酸硫胺素(VB1)等促生長劑，轉化阿魏酸后的產物為香草酸，沒有甲氧基氫醌、香草醛、香草醇等代謝副產物，提取得率為75～80％％；產品純度為90％。該菌株不利用不降解香草酸，微生物轉化收率高，對底物摩爾轉化率30～90％。本發(fā)明的轉化工藝可以直接用發(fā)酵培養(yǎng)液添加阿魏酸進行轉化，也可以用發(fā)酵后分離得到的游離菌絲體或其固定化細胞加阿魏酸底物溶液進行轉化，菌絲體或其固定化細胞可反復利用多次。
實施例實施例1斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為100ml馬鈴薯浸汁(含去皮馬鈴薯20g)，葡萄糖2g，瓊脂2g，pH6.5，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉菌Aspergillusniger SW-3305 CGMCC No.0774，30℃培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖30g/L、酒石酸二銨5g/L、酵母膏5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、氯化鈣10g/L、硫酸鎂5g/L，pH6.0，裝液量為250ml三角瓶裝液100ml，120℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，150rpm搖床，30℃培養(yǎng)2天，作為種子或發(fā)酵酶液。
發(fā)酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，按25g濕菌體/g底物的濃度添加阿魏酸，150rpm搖床，30℃繼續(xù)培養(yǎng)(轉化)48小時，轉化過程中每隔12小時取樣HPLC測定香草酸生成量，結果如下表1表1黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305轉化阿魏酸生成香草酸

實施例2黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305 CGMCC No.0774，按實例1方法發(fā)酵培養(yǎng)48小時后，發(fā)酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，每天一次按25g濕菌體/g底物的濃度添加阿魏酸進行轉化，每次加入阿魏酸量為0.1g，連續(xù)四天，共加入阿魏酸0.4g。最后一次加底物后繼續(xù)轉化24小時，HPLC檢測轉化液中的香草酸的濃度為1.46g/L，mol轉化率為50.58％。再繼續(xù)轉化24小時，HPLC檢測轉化液中的香草酸的濃度為2.61g/L，mol轉化率為90.43％。
實施例3用黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305 CGMCC No.0536，按實例1方法發(fā)酵，過濾得到菌絲體，將制備的濕菌絲體，按每瓶濕菌絲體(2.5g)加入100ml滅過菌的pH6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，加入10g/L的阿魏酸底物溶液10ml(計算加濕菌體量為25g/g底物)進行轉化，30℃，150rpm，轉化12小時，取樣測定轉化液中香草酸含量，反應結束后濾出的菌絲體，再次加入新的反應底物(含10ml 10g/L的阿魏酸底物溶液的100ml滅過菌的pH6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液)進行轉化，在同一條件轉化12小時，如此反復轉化重復利用5次。結果表明，濾出的發(fā)酵濕菌絲體在配制的底物溶液中經過24小時生物轉化后，得到的mol酶轉化率為30％左右。菌體使用5次后，轉化率仍然沒有明顯的下降。結果如表2所示表2 發(fā)酵濕菌絲體反復分批酶轉化結果

實施例4按實例1方法，發(fā)酵，得濕菌絲體100g，加100ml生理鹽水制成菌絲體懸液，30℃保溫；另稱取20g卡拉膠，加400ml生理鹽水，加熱溶解后，冷卻到55℃保溫。兩者在50℃以下混勻，倒入平皿，冷卻，加KCl溶液，放冰箱中硬化3hr，稱重得約500g固定化細胞。將此固定化細胞，按實例3方法進行生物轉化。反復分批生物轉化10次結果見表3。
表3 固定化細胞反復分批酶轉化結果

實施例5按實施例2的方法，所得轉化液3500ml，轉化液中的香草酸的濃度為1.06g/L，過濾所得的清液，真空旋轉蒸發(fā)濃縮，至原體積的1/10左右。用體積比為1∶1的乙酸乙酯萃取3次，用HPLC或TLC檢測水相中無殘留香草酸，合并的乙酸乙酯萃取液。向乙酸乙酯萃取液中加入4％(w/v)的活性炭，加熱脫色，濾紙過濾，收集濾液。再用100ml的飽和氯化鈉溶液進行反萃乙酸乙酯萃取液，脫除其中殘留水份，再加約1％(w/v)的無水硫酸鈉，攪拌，進一步脫水。將按以上步驟處理所得到的脫色有機相再次真空蒸發(fā)，回收溶劑。將濃縮至接近油狀的乙酸乙酯相傾入蒸發(fā)皿中，室溫自然干燥，即得白色粉狀結晶香草酸，稱重為2.78g。經HPLC測定，純度為85.9％，計算香草酸收率為64.34％。
實施例6用朱紅密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW-0203，在土豆斜面上培養(yǎng)7天的菌絲接入裝100ml液體培養(yǎng)基(采用實例1發(fā)酵培養(yǎng)基)的250ml三角瓶中，30℃，150rpm，培養(yǎng)3天。將按實施例5的方法提取的香草酸粗晶體0.1g(純度85.9％)，用0.5mol/l的NaOH溶液將其溶解并中和至pH7.0，用去離子水定容到100ml，無菌過濾處理后作為添加的底物溶液。取30ml底物溶液加入到朱紅密孔菌的培養(yǎng)液中，30℃，120rpm轉化12小時，再向培養(yǎng)液中加入30ml底物，第24小時再加入30ml底物，三次總共向培養(yǎng)基中添加了77.3mg的香草酸。在第三次添加底物后，再轉化12小時，HPLC測定，香草醛的濃度達到0.118g/L，190ml轉化液中共生成香草醛22.4mg，由此計算相應的香草醛mol轉化率為32.03％。
權利要求
1.一種能有效轉化反式阿魏酸為香草酸的微生物菌株，它是黑曲霉菌(Aspergillus niger)SW-3305 CGMCC No.0774。
2.一種生產香草酸的微生物轉化方法，包括(1)將權利要求1所述的菌株SW-3305，進行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)酵，獲得濕菌絲體或用卡拉膠等載體固定化后做為生物催化劑；(2)將反式阿魏酸精制后配制成溶液作為生物轉化底物；(3)將(1)的發(fā)酵液，或過濾收集的濕菌體，或用卡拉膠等載體固定化后的濕菌體，加入(2)的底物溶液進行轉化反應，生成香草酸；(4)將(3)的轉化液，用乙酸乙酯萃取，再脫水，脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得到白色粉狀結晶香草酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中菌株SW-3305發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為麥芽糖5～50g/L、酒石酸二銨0～10g/L、酵母膏1～5g/L、磷酸二氫鉀0～2g/L、氯化鈣1～10g/L、硫酸鎂0～5g/L，pH值為4～9。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中菌株SW-3305發(fā)酵培養(yǎng)條件為250ml三角瓶裝液量20～150ml，培養(yǎng)溫度20～40℃，搖床轉速100～250r/min，培養(yǎng)1～7天。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中底物濃度為1～20g/L，加濕菌體量為1～50g/g底物，轉化反應溫度為20～50℃，轉化反應時間為5～48小時。
6.一種生產香草醛的微生物轉化方法，其特征在于用權利要求2所得到的含香草酸的轉化液，或者所提取的結晶香草酸，加入朱紅密孔菌(Pycnporuscinnabarnus)SW-0203發(fā)酵培養(yǎng)液，進行轉化反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物轉化制造香草酸與香草醛的方法，該方法利用發(fā)明人篩選并保藏的能使阿魏酸轉化成香草酸的微生物菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger)SW一3305(即CGMCCNo.0774)，在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體，發(fā)酵液或游離菌絲體或其固定化細胞用于阿魏酸轉化3～4天，轉化液中含香草酸1～2g/L，對底物摩爾轉化率50～90％；發(fā)酵液或菌絲體轉化液中未檢測到殘余底物阿魏酸及其它降解產物，轉化液中的香草酸用乙酸乙酯等溶劑萃取，得到白色粉狀結晶香草酸，提取得率為75～80％；產品純度為90％。用含香草酸的轉化液，或者用提取的結晶香草酸，加入朱紅密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW－0203發(fā)酵培養(yǎng)液，可得到轉化產物香草醛。
文檔編號C12P7/24GK1421523SQ0212556
公開日2003年6月4日 申請日期2002年7月22日 優(yōu)先權日2002年7月22日
發(fā)明者孫志浩 申請人:江南大學, 浙江鑫富生化股份有限公司