專利名稱：一種黑曲霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌種及其應用，具體的說是一種黑曲霉菌株其及在煙草黑脛病防治中的應用。
背景技術：
煙草黑脛病是一類重要的煙草土傳病害，它們通常侵染煙草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的經濟損失。目前， 生產上主要采用抗病品種和作物輪作等農業(yè)措施來防治煙草土傳病害病。中國科學院昆明植物研究所研究出抗黑脛病的品種(專利號CN01108714. 5)，但是由于抗病品種需要抗病基因多樣化，并且受環(huán)境的影響比較大，防治效果不理想；作物輪作也是防治煙草青枯病和黑脛病的有效方法之一，但是由于我國人多地少，生產中正常的輪作措施無法實現(xiàn)；也有使用化學藥劑防治煙草黑脛病的，云南煙草科學研究所研究一種對甲霜靈可以治理黑脛病(專利號CN200710065691. 3)，大量使用化學藥劑來防治煙草黑脛病會造成環(huán)境污染，藥物殘留對人體的身體健康有害，同時，化學農藥的長期使用，病原菌易對其產生抗藥性，因而導致防治效果下降甚至防治失敗。大量研究表明，煙田土壤中不僅存在引起煙草病害的微生物而且也存在多種多樣的非致病性的、提高煙草生命力的有益微生物，因而煙草的生物防治以及生態(tài)防治日益受到重視。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌對植物的危害，生態(tài)防治則是通過向土壤引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多樣性等措施，進而使土壤微生態(tài)達到平衡，最終通過土壤中不同生物之間的拮抗與競爭實現(xiàn)對土壤病害的防治。專利號CN200710300087和專利號CN200910233578專利文獻分別篩選防治黑脛病的菌株，分別為淡紫青霉ZY-19-2和多粘類芽孢桿菌C-5。淡紫青霉ZY-19-2產幾丁質酶能力強可以分解蠅蛆體壁，抵抗煙草黑脛病的侵染，但沒有菌株直接拮抗黑脛病病原菌的說明，另外，外來菌株施入土壤還存在定殖難的問題。CN200910233578的文獻公開了一種把拮抗菌做成有機肥料，菌株和有機肥料一起施入土壤，有利于菌株的定殖，但是肥料利用完以后，作為一種外來菌，菌株的生長能力變差，拮抗作用就會降低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠防治煙草黑胚病的黑曲霉菌(Aspergillus niger)Ty-3。同時，還涉及一種該菌株的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案提供了一種黑曲霉菌(Aspergillusniger) Ty-3,保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2011年7月8日，保藏號CCTCC N0:M2011241 。同時,本發(fā)明的技術方案還提供了一種黑曲霉菌(Aspergillus niger) Ty-3在制備防治煙草病害的菌劑中的應用。
更進一步地,本發(fā)明的技術方案提供了一種黑曲霉菌(AspergiJJtts niger) Ty-3在制備防治煙草黑脛病菌劑中的應用。本發(fā)明提供的菌株是從煙草黑脛病植株的根圍土壤中篩選出的一株拮抗菌，該菌株已于2011年7月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCC N0:M2011241o黑曲霉菌{Aspergillus niger) Ty-3具體通過如下方法篩選獲得
I.病原菌采集與分離
從信陽羅山縣和漯河舞陽縣采集的較典型黑脛病病癥煙株。分離病菌前，先將煙桿沖洗干凈，再用75%的酒精對煙桿和小刀 消毒，接著在無菌條件下用小刀剖開煙株莖桿上的病斑，將感病維管束組織切成若干小塊，用滅菌過的鑷子夾取煙塊于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿中放4飛塊，重復3皿，培養(yǎng)溫度為30°C 32°C。培養(yǎng)48 h，待煙塊周圍長出像棉絮狀的菌絲體時，挑取少許菌絲分離純化，接入PDA斜面培養(yǎng)基。2.黑脛病病原菌致病性測定
選用煙草K326為試驗品種，于盆缽內將煙草種子播種后，待煙株生長到有維管束組織時，將煙草的根部破壞并將培養(yǎng)好的黑脛病原菌稀釋一定濃度制成菌懸液，于煙草根圍倒A 30 ml菌懸液，并保持高溫高濕，20天后觀察發(fā)病情況。3. 土壤真菌分離
取染病煙株根際周圍的土壤10 g，放入90 ml無菌水的三角瓶中，震蕩培養(yǎng)30分鐘后靜置20分鐘，然后稀釋至10_4、10_5和10_6 (g/ml)3個濃度梯度，分別在3個濃度的溶液中加入I ml 8萬單位的硫酸慶大霉素。分別吸取上述3個溶液0.2 ml在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂布，重復3皿，置于28°C溫箱中培養(yǎng)72小時后，挑取單菌落進行純化并移入斜面培養(yǎng)基上保存。4.拮抗菌篩選
分別將培養(yǎng)72小時的土壤真菌和黑脛病病原菌在PDA培養(yǎng)基上進行對峙培養(yǎng)。培養(yǎng)基中間接黑脛病病原菌，兩邊接種分離得到的土壤真菌，兩菌相距2. 5 cm，3天后檢查對峙培養(yǎng)結果，根據兩菌菌落發(fā)展速度、菌落之間有無抑制帶、菌落邊緣的菌絲是否發(fā)生稀疏和萎縮的現(xiàn)象等來判斷分離的真菌對病原菌有無拮抗作用。5.拮抗作用測定
制備PDA平板后，采用對峙培養(yǎng)法將上述分離出的拮抗菌分別接種在煙草黑脛病病原菌的兩側，28°C恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察兩菌落生長情況及其菌落間的相互影響，以兩菌之間拮抗帶的大小來判斷拮抗作用大小。6.寄生現(xiàn)象觀察
挑起上述對峙培養(yǎng)4天后的菌落交界處的菌絲塊，于普通光學顯微鏡下觀察，進而判明拮抗菌抑制病原菌的作用方式和機理。經篩選，得到Ty-3菌種。經鑒定,關于該菌株的信息包括黑曲霉菌{Aspergillus質地絨狀,分生包子頭深褐色至黑褐色，菌落背面淺褐色，無水溶性色素。Ty-3對煙草黑脛病的拮抗機理為Ty_3菌的菌絲可附著并纏繞在黑脛病菌絲之上，該菌可通過寄生在黑脛病病原菌上進行生長，通過長時間的寄生生長可把病原菌殺死并將其分解，從而對病原菌的生長產生強烈抑制作用。
Ty-3菌發(fā)酵條件如下種子培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，發(fā)酵初始pH為5. 5-6. 5，250 mL三角瓶裝瓶量為150 mL，28°C搖床轉數(shù)為150 r/min，發(fā)酵時間為48小時，以10%的接種量接種到麩皮固體培養(yǎng)基培養(yǎng)96小時，產生大量孢子后，烘干或自然晾干，至水分含量小于30%。本發(fā)明從煙草黑脛病原位土壤中篩選分離到一株拮抗菌Ty-3，通過寄生和營養(yǎng)競爭抑制黑脛病病原菌的生長，與其它類似產品相比，有如下優(yōu)點 1)Ty-3從煙草黑脛病發(fā)病的原位土壤中分離出來，制成菌劑后施入土壤，有利于拮抗菌的定殖，能快速繁殖成為優(yōu)勢菌；
2)Ty-3通過寄生和營養(yǎng)競爭，抑制黑脛病病原菌的生長，從而有效防治煙草黑脛病；
3)Ty-3為霉菌，產孢子能力較強，這一方面有利于產品的保存，另一方面有利于菌種在土壤中抵抗不良環(huán)境，環(huán)境適宜即可大量生長繁殖。通過寄生和營養(yǎng)競爭，抑制黑脛病病原菌的生長，從而有效防治煙草黑脛病。該菌種從煙草黑脛病發(fā)病的原位土壤中分離出來，制成菌劑后施入土壤，有利于拮抗菌的定殖，能快速繁殖成為優(yōu)勢菌。Ty-3為霉菌，產孢子能力較強，這一方面有利于產品的保存，另一方面有利于菌種在土壤中抵抗不良環(huán)境，環(huán)境適宜即可大量生長繁殖。


圖I為接種黑脛病病原菌后30天煙草發(fā)病情況；
圖2為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-I ；
圖3為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-2 ；
圖4為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-3 ；
圖5為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-4 ；
圖6為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-5 ；
圖7為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-6 ；
圖8為Ty-3菌分生孢子梗；
圖9為Ty-3菌分生孢子；
圖10為Ty-3菌與黑脛病菌對峙生長2天后；
圖11為Ty-3菌與黑脛病菌對峙6天的抑制情況；
圖12為Ty-3菌與黑脛病病菌對峙培養(yǎng)6天后，Ty-3菌在黑脛病菌菌絲上生長，并產生了大量孢子；
圖13為Ty-3菌對黑脛病菌菌絲纏繞、附著；
圖14為黑脛病菌菌絲原生質濃縮、液泡化情況；
圖15為Ty-3菌的菌落形態(tài)；
圖16為Ty-3菌的顯微特征圖。
具體實施例方式實施例I煙草黑脛病拮抗菌的分離與篩選I)病原菌分離
從信陽羅山縣和漯河舞陽縣采集的煙草發(fā)病煙株中分離出煙草黑脛病。待煙塊周圍長出像棉絮狀的菌絲體時，挑去少許菌絲純化，接入PDA斜面培養(yǎng)基備用。PDA培養(yǎng)基馬鈴薯 200 g，蔗糖 20 g，瓊脂 15-20 g，蒸餾水 1000 ml，自然 pH，壓力 1.05 kg/cm2、121. 3°C下滅菌20 min。顯微照片顯示該菌菌絲無色、無隔；孢囊梗從發(fā)病組織氣孔中伸出，1-3根束生；孢子囊頂生或側生，梨形至橢圓形，有乳突，孢子囊可釋放5-30個游動孢子；游動孢子近圓形或腎形，無色，側生二根鞭毛。2)致病性鑒定
選用煙草K326為試驗品種。于盆缽內將煙草種子播種后，待煙株生長到有維管束組織時，將煙草的根部破壞并將培養(yǎng)好的黑脛病原菌稀釋一定濃度制成菌懸液，于煙草根圍倒A 30 ml菌懸液，并保持高溫高濕。20 d后觀察發(fā)病情況。 根據Koch氏法則，將從黑脛病發(fā)病煙株中分離的菌株接種到健康煙草植株上，以測定其致病性。將分離出的供試菌株接種10株健康煙草，經過30天后有2株煙草出現(xiàn)了黑脛病癥狀如圖I所示。3) 土壤真菌的分離
取樣品煙株根際周圍的土壤10 g，放入90ml無菌水的三角瓶中，震蕩30 min后靜置20min，然后稀釋至10_4、10_5和10_6 (g/ml) 3個濃度梯度，分別在3個濃度的溶液中加入Iml8萬單位的硫酸慶大霉素。分別吸取上述3個溶液0. 2 ml在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂布，重復3皿，置于28°C溫箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落進行純化并移入斜面培養(yǎng)基上保存。經過平板稀釋涂布分離，從土壤中共獲得6種真菌，其菌落顏色分別綠色、棕色、黑色、土黃色、白色、褐藍色6個菌株。將其分別編號為Ty-I如圖2所示、Ty-2如圖3所示、Ty-3如圖4所示、Ty-4如圖5所示、Ty-5如圖6所示和Ty_6如圖7所示。
4)拮抗菌株的篩選及其拮抗作用
分別將培養(yǎng)72 h的土壤真菌和黑脛病病原菌在PDA培養(yǎng)基上進行對峙培養(yǎng)。培養(yǎng)基中間接黑脛病病原菌，兩邊接種分離得到的土壤真菌，兩菌相距2. 5 cm, 3 d后檢查對峙培養(yǎng)結果，根據兩菌菌落發(fā)展速度、菌落之間有無抑制帶、菌落邊緣的菌絲是否發(fā)生稀疏和萎縮的現(xiàn)象等來判斷分離的真菌對病原菌有無拮抗作用。通過對峙培養(yǎng)，從6株真菌菌株中篩選出I株對煙草黑脛病病菌具有極強寄生和拮抗作用的菌株Ty-3。實施例2 Ty-3形態(tài)學觀察
Ty-3菌初期菌落平展，白色，菌絲稀疏，成熟的菌落黑色，背面無色。菌絲無色有明顯分隔，具有分枝，直徑3-4 Mm。成熟時菌絲長出分生孢子梗，主干和每個側枝的頂端都著生梗，梗呈兩頭尖的紡錘棒狀，分生孢子為圓球形或卵圓形如圖8、圖9所示。實施例3 Ty-3寄生現(xiàn)象觀察
Ty-3菌和黑脛病病原菌對峙培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)Ty-3菌生長旺盛，可產生大量短絨狀氣生菌絲和黑色分生孢子叢，黑脛病菌絲和Ty-3菌交界處出現(xiàn)明顯的拮抗帶，拮抗帶寬度達12-15.4 mm。Ty-3菌能越過菌落交界處直接占據黑脛病菌落生長空間，并且能夠在病菌上生長，產生孢子，逐漸將病菌消解如圖10、圖11、圖12所示。該菌的拮抗作用表現(xiàn)為產生抑菌帶或抑菌圈，使病原菌菌絲生長明顯受到抑制，具有明顯的營養(yǎng)競爭和分泌抗生物質產生拮抗作用。用顯微鏡觀察菌落交界處的菌絲，發(fā)現(xiàn)Ty-3菌菌絲可附著并纏繞在黑脛病菌絲之上如圖13、圖14所示，表明該真菌可通過寄生在黑脛病病原菌進行生長，通過長時間的寄生生長可把病原菌殺死并將其分解，從而對病原菌的生長產生強烈抑制作用。實施例4 Ty-3菌的鑒定分類 Ty-3經中科院微生物研究所鑒定結果為
I)菌落形態(tài)及顯微特征
麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上菌落生長快，25 °C黑暗條件下7天菌落直徑50-63 mm，質地絨狀；產孢結構大量形成，分生孢子頭深褐色至黑褐色，初期球形，后期裂開為幾個柱狀結構；菌落背面淺褐色，無水溶性色素如圖15所示。分生孢子梗高大，寬6-15 Pm，壁光滑，直或彎曲；頂囊球形，直徑22-30 ym，全部表面可育；產孢結構雙層；分生孢子近球形，淺到褐色，壁粗糙或具小刺，3. 0-4. 8 Pm。未見有性孢子如圖16所示。2) rRNA基因序列測序結果
權利要求
1.一種黑曲霉菌fliger)Ty-3，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2011年7月8日，保藏號CCTCC N0:M2011241。
2.一種如權利要求I所述的黑曲霉菌在制備防治煙草病害的菌劑中的應用。
3.—種如權利要求I所述的黑曲霉菌在制備防治煙草黑脛病菌劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑曲霉(Aspergillusniger)Ty-3及其應用，該菌株的保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2011年7月8日，保藏號CCTCC NO:M 2011241。上述菌株的菌絲可附著并纏繞在煙草黑脛病菌絲之上，寄生在煙草黑脛病病原菌上進行生長，通過長時間的寄生生長可把病原菌殺死并將其分解，從而對病原菌的生長產生強烈抑制作用。該黑曲霉菌可以用于制備防治煙草病害的菌劑。
文檔編號C12N1/14GK102732430SQ201110260458
公開日2012年10月17日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權日2011年9月5日
發(fā)明者李玉紅, 李紅麗, 王巖, 郭夏麗 申請人:鄭州大學