一株產(chǎn)黑曲霉葡萄糖氧化酶的畢赤酵母菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶酵母工程菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用重組DNA技術(shù)將黑曲霉accc30161的葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆連接到含3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pGAPZαA，并轉(zhuǎn)化Pichia?pastoris?KM71，經(jīng)篩選鑒定得到一株可以產(chǎn)較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母KM71-GOD。該菌株在3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)的葡萄糖氧化酶在酶活達(dá)107U/mL，為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】一株產(chǎn)黑曲霉葡萄糖氧化酶的畢赤酵母菌及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及巴斯德畢赤酵母的新的菌株KM71-G0D 以及該菌株的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,G0D)是一種需氧脫氫酶，廣泛應(yīng)用于蛋白脫糖、 葡萄糖定量分析、醫(yī)用檢測(cè)、食品工業(yè)及生物傳感器等多種領(lǐng)域。目前G0D主要從黑曲霉和 青霉中制備純化，但產(chǎn)量低、純化工藝繁雜，因此用基因工程方法構(gòu)建更優(yōu)良的G0D生產(chǎn)菌 株一直受到高度重視。
[0003] 巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的外源基因真核 表達(dá)系統(tǒng)之一，其蛋白表達(dá)量高，且被表達(dá)的蛋白中雜蛋白少。畢赤酵母還具有能夠嚴(yán)格調(diào) 控外源蛋白的表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工、折疊和翻譯后修飾，及可將外源蛋白分泌至胞外 等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 宿主菌的選擇顯著影響外源基因的表達(dá)。KM71是蛋白酶缺陷性菌株，特別適用于 分泌性表達(dá)載體，其P印4基因突變，缺失蛋白水解酶活性，而P印4編碼的蛋白酶A可激活 一系列蛋白酶，因此用KM71表達(dá)外源蛋白，可有效降低表達(dá)產(chǎn)物降解，提高表達(dá)量。研究顯 示使用蛋白酶缺陷菌株表達(dá)5-HT5A、乳糖酶等外源蛋白時(shí)，蛋白產(chǎn)量得到成倍增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本研究利用從黑曲霉aCCC30161克隆的G0D基因構(gòu)建了含3-磷酸甘油醛脫氫酶 基因啟動(dòng)子（glyceraldehyde-3-phosphate dehygrogenase gene promoter，pGAP)的分泌 型表達(dá)載體，并用其轉(zhuǎn)化了畢赤酵母蛋白酶缺陷性菌株KM71，實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效分 泌表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明的畢赤酵母KM71-G0D，是一種全新的菌株，該菌株能夠高效表達(dá)葡萄糖氧 化酶。

【具體實(shí)施方式】
[0007] 1材料與方法
[0008] 1. 1 材料
[0009] 1. 1. 1菌株和質(zhì)粒
[0010] 黑曲霉aCCC30161由山東師范大學(xué)生命科學(xué)院生物技術(shù)系戴美學(xué)教授提供；畢赤 酵母KM71及質(zhì)粒pGAPZaA購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5a購于北京全式金生物技 術(shù)有限公司。
[0011] 1.1.2 試劑
[0012] 限制性內(nèi)切酶Notl、ΚρηΙ和EcoRI為TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶和限制性 內(nèi)切酶Avr II為Fermentas公司產(chǎn)品；2XEasy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物 技術(shù)有限公司；引物合成和基因序列測(cè)定由深圳華大基因公司完成；GOD標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司；兔抗黑曲霉GOD -抗為Abeam公司廣品；HRP標(biāo)記的山羊抗兔_抗購自北點(diǎn)中杉金橋 生物技術(shù)有限公司；PVDF膜及ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；Omega SP Fungal DNA kit試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；BCA蛋白含 量檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。
[0013] 1.1.3引物設(shè)計(jì)
[0014] 根據(jù)Genebank中的多個(gè)黑曲霉G0D序列，利用Primer Premier5. 0軟件設(shè)計(jì)引物 P1和P2 (表1)，以從黑曲霉accc30161基因組中擴(kuò)增出含G0D基因的約2. Okb DNA片段。 該DNA片段經(jīng)擴(kuò)增并測(cè)序后，根據(jù)測(cè)序結(jié)果及質(zhì)粒pGAPZ α A上的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物P3 和P4 (表1)，擴(kuò)增具有酶切位點(diǎn)的G0D基因。
[0015] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0016] 1. 2. 1黑曲霉基因組提取
[0017] 將黑曲霉aCCC30161在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L)中 26°C振蕩培養(yǎng)2天，離心后用無菌雙蒸水洗滌菌體3次，將菌體在液氮中研磨至粉狀，用 Omega SP Fungal DNA kit試劑盒提取基因組DNA。
[0018] 1. 2. 2黑曲霉G0D基因擴(kuò)增與測(cè)序
[0019] 以黑曲霉基因組DNA為模板，以P1、P2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包 含：2XEasy Taq PCR SuperMix25yL，黑曲霉基因組DNA2yL，上下游引物各2yL，無菌雙 蒸水19yL。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性30s、50°C退火30s、72°C延伸 2min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測(cè)序。 1. 2. 3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0020] 以黑曲霉基因組DNA為模版，用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件 同1.2.2。？0?產(chǎn)物回收并用邱111和此七1雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的？64?2 〇六質(zhì)粒 以3 : l(w/w)混合，并用T4DNA連接酶22°C過夜連接。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a，然后在含25μ8/ιΛ Zeocin的低鹽LB平板（蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉4g/ L及瓊脂粉15g/L)上篩選陽性菌落。用含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)陽 性菌并提取質(zhì)粒，用PCR擴(kuò)增和EcoR I酶切分析篩選出G0D基因以正確方向插入pGAPZ a A 的重組子pGAPZaA-GOD，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。其中PCR擴(kuò)增所用方法同1.2.2,所用引物為 pGAP 和 3' A0X1 (表 1)。
[0021] 表1本研究所用引物序列
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組畢赤酵母KM71-G0D，利用基因工程方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將其電擊轉(zhuǎn)化畢 赤酵母，構(gòu)建高質(zhì)高產(chǎn)的黑曲霉葡萄糖氧化酶巴斯德畢赤酵母KM71-G0D。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畢赤酵母KM71-G0D，其特征是將黑曲霉accc30161葡 萄糖氧化酶基因擴(kuò)增后插入pGAPZa A質(zhì)粒，構(gòu)建了畢赤酵母葡萄糖氧化酶表達(dá)載體 pGAPZ a A-GOD。pGAPZ a A-GOD經(jīng)菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增、重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳、限制 性酶切分析及測(cè)序等方法驗(yàn)證后，被用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71-G0D。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畢赤酵母，其特征是葡萄糖氧化酶蛋白表達(dá)量高，且被表達(dá) 的蛋白中雜蛋白少，并可將蛋白分泌至細(xì)胞外，有利于純化回收。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104099259SQ201310116715
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月7日
【發(fā)明者】畢文祥, 邱占軍, 孔峰 申請(qǐng)人:畢文祥, 邱占軍, 孔峰