專利名稱：高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
尿嘧啶核苷酸⑴ridine-5’ -monophosphate, UMP)作為基礎(chǔ)嘧啶核苷酸，具有重要的生理作用，可與其他單體核苷酸配合使用，廣泛應(yīng)用于食品和飼料添加劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等方面。同時(shí)，尿苷酸參與肝臟解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸的生物合成，不僅本身可用于治療肝炎，改善冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白細(xì)胞減少癥患者的自覺癥狀等，還是脂核苷酸、糖核苷酸以及低聚核苷酸類似物的合成原料，這些核苷酸衍生物對腫瘤和被感染的病毒細(xì)胞可以有效地釋放核苷，提高抗病毒效果。其市場需求很大，蘊(yùn)含有良好的商業(yè)潛力。近幾年國內(nèi)外涌現(xiàn)出很多關(guān)于微生物發(fā)酵法制備UMP的專利報(bào)道，主要的工作都集中在菌種改造方面，主要的方法還是通過傳統(tǒng)的誘變方法，篩選出嘧啶類似物(2-硫尿嘧啶(2-TU)、6-氮尿嘧啶(6-AU)、尿嘧啶、氟尿嘧啶)抗性菌株，氨甲酰磷酸類似物抗性 (璜氨胍)菌株，或者嘌呤類似物抗性菌株。但由于誘變工作量大、盲目性高，而且所篩選到的突變株的生理狀態(tài)處于病態(tài)或完全失調(diào)的情況下，所以產(chǎn)量的進(jìn)一步提高有一定的局限性。新的策略就是用基因工程技術(shù)來改造菌株。利用DNA重組技術(shù)，建立一整套克隆載體系統(tǒng)，通過基因分離、鑒定、克隆、轉(zhuǎn)移和表達(dá)進(jìn)行定向培育來制備有價(jià)值的菌株。并期望通過克隆增加限速酶基因拷貝數(shù)或通過對所克隆基因的定點(diǎn)突變技術(shù)來消除反饋調(diào)節(jié)和代謝旁路調(diào)節(jié)等多種DNA操作途徑，增強(qiáng)基因的表達(dá)能力，從而提高產(chǎn)量。UMP是嘧啶核苷酸合成途徑中處于結(jié)點(diǎn)位置的重要核苷酸，由它可以進(jìn)一步合成其他嘧啶核苷酸。工業(yè)上所用的生物催化法合成UMP通常是以乳清酸為底物，通過從頭合成途徑，利用菌體自身產(chǎn)生的5-磷酸核糖焦磷酸(5-PRPP)，經(jīng)過兩步酶反應(yīng)合成UMP。參與反應(yīng)的兩個(gè)酶分別是乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(OPRTase EC 2. 4. 2. 10)和乳清苷酸脫羧酶 (ODCase EC 4. 1. 1. 23)。OPRTase是嘧啶核苷酸從頭合成途徑的第五個(gè)酶，也是催化法合成UMP的第一步反應(yīng)酶。該酶催化乳清酸轉(zhuǎn)移到5-PRPP上，釋放一分子焦磷酸(PPi)，形成乳清苷酸(OMP)，再被ODCase催化脫羧形成UMP。因此，利用基因工程手段，克隆高活性的 OPRTase基因和ODCase基因，構(gòu)建OPRTase和ODCase共表達(dá)的雙酶耦聯(lián)系統(tǒng)，以乳清酸為原料生產(chǎn)UMP，是UMP高效合成的一條可行途徑。此途徑具有工藝簡單、條件溫和、周期短、 副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，而且清潔無污染，最終實(shí)現(xiàn)UMP的高效清潔生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌。本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供上述重組菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述重組菌的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中科院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC No. 5047。上述高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌，它包含乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF的大腸桿菌，所述的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，所述的乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF來源于谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCCl3032。其中，所述的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，基因長度為55^p，編碼了 184個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，計(jì)算分子量和理論等電點(diǎn)分別為19. 43kDa和5. 40。其中，所述的乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF的核苷酸序列如SEQ IDNO :3所示，基因長度為837bp，編碼了 278個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，編碼的氨基酸序列如SEQID NO 4所示，計(jì)算分子量和理論等電點(diǎn)分別為28. 92kDa和4. 76。上述高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌的構(gòu)建方法，采用PCR方法從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032中提取乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-pyrE-pyrF,將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選到一株產(chǎn)酶量最高的菌株CGMCC No. 5047。上述高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌在高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶中的應(yīng)用。培養(yǎng)上述重組菌，利用IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒中OPRTase基因pyrE和ODCase基因pyrF的表達(dá)，收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，得到的上清作為粗酶液，經(jīng)M柱純化即得乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶。有益效果本發(fā)明首次將谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032中的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF在大腸桿菌Rosetta中的高效共表達(dá)。重組工程菌株能夠高效表達(dá)OPRTase基因 pyrE,分泌表達(dá)OPRTase ；也能夠高效表達(dá)ODCase基因pyrF，分泌表達(dá)ODCase。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，將破碎后收集的粗酶液經(jīng)Ni柱純化后，進(jìn)行酶反應(yīng)，OPRTase和ODCase 的酶活分別為9U/mg和12U/mg蛋白。


圖1為本發(fā)明多順反子質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 含pET28a_pyrE和pET28a_pyrF重組大腸桿菌的構(gòu)建。1、C. glutamicum ATCC130320PRTase 基因 pyrE 和 ODCase 基因 pyrF 的克隆。(1) C. glutamicum ATCC13032 基因組的提取C. glutamicum ATCC13032 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。將 C. glutamicum ATCC13032 接種于 5mLLB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組。(2)擴(kuò)增基因pyrE序列和pyrF序列C. glutamicum ATCC13032基因pyrE序列為已知序列，根據(jù)pyrE的基因序列設(shè)計(jì)引物Pl :5’ -CGGGATCCATGTCATCTAATTCCATTAAC-3，P2 :5， -GGAATTCTTAGTTGAGTCCAAGATCAGAAAGTC-3，C. glutamicum ATCC13032基因pyrF序列為已知序列，根據(jù)pyrF的基因序列設(shè)計(jì)引物Pl :5’ -CGGGATCCATGACATTCGGCGAGAAGC-3’P2 :5’ -GGAATTCCTATGACCTGGGGAAACCAGGAAAG-3，pyrE序列擴(kuò)增的PCR方法94°C變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性lmin，52°C退火30s，72°C延伸 30s。最后 72°C延伸 IOmin0 pyrF序列擴(kuò)增的PCR方法94°C變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性lmin，57. 6°C退火30s，72°C延伸 30s。最后 72°C延伸 IOmin0凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物并進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接到PMDIST-vector， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性平板。挑取LB平板上的單菌落，接種到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C， 220rpm下培養(yǎng)8-12小時(shí)。利用上海申能博彩有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并將菌液送南京金斯瑞有限公司測序，測序結(jié)果與已報(bào)道的基因序列完全匹配，如SEQ IDN0. 1和 SEQ ID NO. 3 所示。2、基因pyrE、pyrF表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)獲得的pyrE、pyrF基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3所示)設(shè)計(jì)表達(dá)引物，在引物的5’端和3’端分別引入NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增，連接 PMD18T-simple，分別構(gòu)建 PMD18T_pyrE 和 PMD18T_pyrF 重組質(zhì)粒。采用 NdeI 和 BamHI 雙酶切PMD18T-pyrE、PMD18T-pyrF重組質(zhì)粒和pET28a質(zhì)粒，連接酶切產(chǎn)物，獲得重組質(zhì)粒 pET28a-pyrE和pET28a_pyrF，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。挑取單菌落，接種到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C，220rpm下培養(yǎng)8-12小時(shí)。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切篩選獲得含有pyrE、pyrF基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并測序確認(rèn)重組質(zhì)粒的閱讀框均正確。3、表達(dá)C. glutamicum ATCC13032基因pyrE和pyrF的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建及篩選將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，挑取單菌落，接種5mL含有氯霉素和卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，220rpm下培養(yǎng)12小時(shí)。提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，PCR驗(yàn)證都正確。實(shí)施例2 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含pET28a_pyrE和pET28a_pyrF的重組大腸桿菌挑取重組大腸桿菌Rosetta (pET28a-pyrE、pET28a_pyrF)及含有pET28a空質(zhì)粒的對照菌大腸桿菌Rosetta (DE3)至含50mg/L卡拉霉素和3%ig/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C，220rpm培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37°C，220rpm培養(yǎng)至 0D600 約為 0. 8 時(shí)，加入 IPTG 至終濃度 0. 8mM，30°C，220rpm，誘導(dǎo)表達(dá) 6h 后，8000rpm，4°C 離心5min，菌泥用50mM Tris-HCl (pH7. 0)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率200W，超聲3s，間歇如，共5min)，8000rpm，4°C離心5min，收集上清液，通過Ni柱純化得到純酶液。OPRTase 酶活測定(IOml) :500umol/L 乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/ LMgcI2,50mmo 1 /LTris-Hc 1 ρΗ8· 0，ImlOPRTase 純酶液與底物混合 37 °C，220rpm 反應(yīng) 0/5/10/20/30min后，迅速取樣1ml，加入3. 5%的高氯酸終止反應(yīng)，用HPLC檢測OA的減少量。ODcase 酶活測定(IOml) :500umol/L 乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/LMgcl2、 50mmol/LTris-Hcl pH8. 0，ImlOPRTase 純酶液和 ImlODCase 純酶液與底物混合 37 °C， 220rpm反應(yīng)0/5/10/20/30min后，迅速取樣Iml，加入3. 5 %的高氯酸終止反應(yīng)，用HPLC檢測OA的減少量與UMP的生成量。對照體系(IOml):500umol/L 乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/LMgcl2、50mmol/ LTris-Hcl pH8. 0，Iml空白對照菌超聲破碎后經(jīng)Ni柱純化得到的酶液。經(jīng)檢測UMP的最大生成速率達(dá)到0. 2mg/ml/min,反應(yīng)20min后OA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到 90%以上。OPRTase和ODCase的酶活分別為9U/mg和12U/mg蛋白。對照體系中OA無明顯變化，且無UMP生成。酶活檢測方法(HPLC)江蘇淮陰漢邦科技有限公司Lichrospher C18 [4. 6x 250mm, 5um]色譜柱；流動相pH6. 6的磷酸三乙胺溶液；柱溫室溫；檢測波長260nm ；流速^?。。?！^！！^！^；進(jìn)樣量丨?！?^以下相同。一個(gè)單位的OPRTase酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化Iumol乳清酸所需的OPRTase的量。 一個(gè)單位的ODCase酶活定義為每分鐘生成IumolUMP所需的ODCase的量。實(shí)施例3 多順反子質(zhì)粒pET28a-pyrE_pyrF和pET28a-pyrF_pyrE重組大腸桿菌的構(gòu)建通過合理設(shè)計(jì)多順反子系統(tǒng)中的調(diào)控區(qū)域的SD序列(TAAGGAGG)和AS序列 (ATATACAT)，將來源于 C. glutamicum ATCC13032 的 OPRTase 和 ODCase 進(jìn)行共表達(dá)，并成功地構(gòu)建了多順反子質(zhì)粒pET28a-pyrE-pyrF和pET28a-pyrF_pyrE，并有效地解決了 UMP合成體系中兩個(gè)酶反應(yīng)速率的平衡和匹配問題，有利于UMP的高效生成。具體構(gòu)建方法如下為了構(gòu)建 pET28a-pyrE-pyrF，以 pET28a_pyrF 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增片段 SD-AS-pyrF。SD-AS-pyrF 的PCR產(chǎn)物由BamH I和Bio I進(jìn)行雙酶切。將酶切純化后的片段SD-AS-pyrF克隆到 pET28a-pyrE質(zhì)粒的Bam H I/Xho I酶切位點(diǎn)上。得到多順反子質(zhì)粒(pEI^8a-pyrE_pyrF)， 將其轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta (DE3)中進(jìn)行表達(dá)，pET28a-pyrF_pyrE質(zhì)粒的構(gòu)建方法相同。 每條克隆的引物如表1所示。表1擴(kuò)增片段的引物列表
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5047。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，它包含乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因 OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF的大腸桿菌，所述的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因 OPRTase pyrE 來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 所述的乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌，其特征在于，所述的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因 OPRTase pyrE的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌，其特征在于，所述的乳清苷酸脫羧酶基因 ODCasepyrF的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
5.權(quán)利要求1所述高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，采用PCR方法從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032中提取乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因 ODCase pyrF,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-pyrE-pyrF，將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選到一株產(chǎn)酶量最高的菌株CGMCC No. 5047。
6.權(quán)利要求1所述高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌在高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的重組菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5047。本發(fā)明還公開了上述重組菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明首次將谷氨酸棒桿菌中的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脫羧酶基因ODCase pyrF在大腸桿菌中高效共表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，將破碎后收集的粗酶液經(jīng)Ni柱純化后，進(jìn)行酶反應(yīng)，OPRTase和ODCase的酶活分別為9U/mg和12U/mg蛋白。
文檔編號C12N15/70GK102304490SQ20111026026
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 李楠, 柏建新, 王艷, 許琳, 謝婧婧, 趙小迪, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學(xué)