復(fù)制缺陷型沙粒病毒載體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷型沙粒病毒載體。本發(fā)明涉及一種感染性沙粒病毒顆粒，其被改造成包含能在被感染細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在正常的非基因工程細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生感染性后代顆粒的基因組。沙粒病毒的四個(gè)開(kāi)放閱讀框即糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白Z和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶中的一個(gè)或更多個(gè)被除去或突變，以阻止在正常細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，但是仍然可允許在被沙粒病毒載體感染的細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)，編碼抗原或其他目的蛋白質(zhì)的外源基因或或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的核酸在沙粒病毒啟動(dòng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的控制下進(jìn)行表達(dá)，或者在可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III讀出的調(diào)控元件的控制下進(jìn)行表達(dá)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】復(fù)制缺陷型沙粒病毒載體
[0001]本申請(qǐng)是中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200880123157.6的分案，后者是2008年12月22日提交的PCT申請(qǐng)PCT/EP2008/010994于2010年6月28日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及適合用作疫苗或基因治療之載體的經(jīng)基因修飾沙粒病毒(arenavirus)以及利用這些病毒進(jìn)行疫苗接種和疾病治療的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]預(yù)防性疫苗代表了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最成功的篇章之一，其使天花在世界上消失，并且控制了脊髓灰質(zhì)炎、麻疹和許多其他破壞性感染性疾病。最近，出現(xiàn)了預(yù)防癌癥的疫苗，人們正在努力開(kāi)發(fā)治療形式的“疫苗”，希望其可用于感染和惡性腫瘤。歷史上，疫苗接種策略包括多種方法:從最開(kāi)始利用野生型傳染源和自(再)接種腫瘤細(xì)胞，然后用減毒活傳染劑和死腫瘤組織，隨著時(shí)間的推移，臨床醫(yī)學(xué)越來(lái)越傾向于使用分別來(lái)自傳染源或腫瘤的(惰性)蛋白質(zhì)和/或其它提取物(一般稱(chēng)為“抗原”)。這個(gè)逐漸的過(guò)程代表了尋找更安全的疫苗制劑的過(guò)程，然而，這常常伴隨著疫苗效力的相對(duì)損失。近年來(lái)，生物工程技術(shù)的發(fā)展使得另一種方法成為可能，所述方法目前被廣泛認(rèn)為是最具有前景的方法之一:給用作“船渡”(稱(chēng)為“載體”)的傳染源裝備來(lái)自所選病原體或腫瘤的抗原。由此，在所述載體賦予的強(qiáng)免疫增強(qiáng)(“免疫原性”)情形下，疫苗接種者的免疫應(yīng)答識(shí)別目的抗原。
[0004]這種“載體方法”已經(jīng)可在組織培養(yǎng)物水平下將外源基因直接引入活細(xì)胞中，也可在多細(xì)胞生物(包括人)中將外源基因直接引入活細(xì)胞中，因此，載體還可用于在培養(yǎng)細(xì)胞中或在基因治療中表達(dá) 基因。
[0005]目前有很多載體用于實(shí)驗(yàn)研究中，包括疫苗接種和基因治療，最終目的是優(yōu)化針對(duì)臨床應(yīng)用(疫苗和基因治療)或生物技術(shù)(細(xì)胞培養(yǎng)物中的基因轉(zhuǎn)移)的效力和安全性。
[0006]一般認(rèn)為，載體常具有其來(lái)源生物(例如病毒)的一般性狀。因此，開(kāi)發(fā)用于載體設(shè)計(jì)的新病毒家族提供了發(fā)現(xiàn)新的性狀組合的前景，所述性狀組合可賦予這種新型載體以空前的能力以及在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的相應(yīng)應(yīng)用。然而，載體設(shè)計(jì)需要將所用生物的安全性考慮在內(nèi)，所以必須提出如何以不干擾期望的性狀(比如作為疫苗施用的免疫原性)的方式消除所述生物的致病潛能的策略。
[0007]70多年以來(lái)，已知一般的沙粒病毒(特別是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV))能引發(fā)特別強(qiáng)和持久的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。值得注意的是，盡管如此，針對(duì)病毒包膜糖蛋白(GP)的保護(hù)性中和抗體免疫性極低，感染導(dǎo)致的針對(duì)再感染的抗體介導(dǎo)保護(hù)作用極低(如果有的話(huà))。而且，幾十年來(lái)已經(jīng)穩(wěn)固地確定，由于其非細(xì)胞溶解性(不破壞細(xì)胞的特性)，沙粒病毒可在某些條件下于動(dòng)物中維持長(zhǎng)期的抗原表達(dá)而不引起疾病。最近，已經(jīng)描述了用于操作感染性沙粒病毒基因組的反向遺傳系統(tǒng)(L.Flatz,A.Bergthaler,J.C.de la Torre, and D.D.Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA103:4663-4668.2006 ；A.B.Sanchez and J.C.de la Tore, Virology350:370，2006)，但是，到目前為止，沙粒病毒還未被用作疫苗載體。這主要是因?yàn)閮蓚€(gè)主要障礙:i)沙粒病毒可引發(fā)極嚴(yán)重的感染，這可隨后導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病和免疫抑制。ii)還不能引入選定的外源抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種感染性沙粒病毒顆粒，其被改造成包含能在被感染細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在正常的非基因工程細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生感染性后代顆粒的基因組。
[0009]更具體地，本發(fā)明涉及這樣的沙粒病毒顆粒，其包含可以編碼目的蛋白或調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的額外的核糖核酸。
[0010]本發(fā)明的沙粒病毒包含經(jīng)修飾的基因組，其中:
[0011]i)沙粒病毒的四個(gè)開(kāi)放閱讀框即糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白Z和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L中的一個(gè)或更多個(gè)被除去或突變，以防止感染性在正常細(xì)胞中傳播，但是仍然允許在這些細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)；
[0012]ii)引入編碼一種或多種蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸，并且通過(guò)沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子(S節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR)之中的一個(gè)或更多個(gè)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，或者通過(guò)額外引入的可分別被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III讀出的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其中編碼蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的核糖核酸可自身進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或通過(guò)與沙粒病毒蛋白質(zhì)開(kāi)放閱讀框融合而被通讀(read-through);以及任選地
[0013]iii)將一個(gè)或者多個(gè)內(nèi)部 核糖體進(jìn)入位點(diǎn)引入到病毒轉(zhuǎn)錄序列中，來(lái)增強(qiáng)被沙粒病毒感染的細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0014]此外，本發(fā)明還涉及含有這種基因工程化沙粒病毒的疫苗和藥物制劑以及利用這些基因工程化沙粒病毒進(jìn)行疫苗接種和基因治療的方法。
[0015]此外，本發(fā)明還涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)目的蛋白質(zhì)或在細(xì)胞培養(yǎng)物中調(diào)芐基因表達(dá)，其中利用基因工程沙粒病毒感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1
[0017]由于對(duì)野生型沙粒病毒基因組進(jìn)行了改造，所以所得沙粒病毒載體僅在回補(bǔ)細(xì)胞(complementing cell)中復(fù)制。
[0018]A:沙粒病毒載體⑴可感染正常細(xì)胞(2)或回補(bǔ)細(xì)胞(C細(xì)胞，3)。C細(xì)胞被感染后，可形成進(jìn)一步的感染性后代載體，而正常細(xì)胞被感染后不產(chǎn)生載體顆?；蚍歉腥拘灶w粒。
[0019]B:利用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)而不是LCMV-GP的基于LCMV的載體(rLCMV/GFP)感染C細(xì)胞(I)和正常細(xì)胞(2)，并且在不同的時(shí)間點(diǎn)(3，以小時(shí)表示)收集上清樣品。采用噬斑形成測(cè)定法來(lái)檢測(cè)所述上清中的感染性(4，以PFU/ml表示)。
[0020]C:野生型沙粒病毒基因組由大節(jié)段(L ；1)和小節(jié)段(S ；2)組成。所述L節(jié)段表達(dá)L基因(3)和Z基因(4)，而所述S節(jié)段攜帶NP基因(5)和GP基因(6)。一種產(chǎn)生復(fù)制缺陷型沙粒病毒載體的策略可以是利用目的基因(例如GFP (7)或卵清蛋白(0VA ；8))替代GP基因。[0021]圖2
[0022]回補(bǔ)質(zhì)粒(C質(zhì)粒)、用于胞內(nèi)表達(dá)反式作用因子的質(zhì)粒(TF質(zhì)粒)和用于胞內(nèi)表達(dá)沙粒病毒載體基因組節(jié)段的質(zhì)粒(GS質(zhì)粒)的示意圖。
[0023]A:C質(zhì)粒的實(shí)例。
[0024]B:分別表達(dá)病毒NP和L蛋白的TF質(zhì)粒的實(shí)例。
[0025]C:分別表達(dá)沙粒病毒載體S節(jié)段和L節(jié)段的GS質(zhì)粒的實(shí)例。
[0026]1:聚合酶II啟動(dòng)子；2:為進(jìn)行回補(bǔ)而表達(dá)的病毒基因；3:內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；4:哺乳動(dòng)物選擇性標(biāo)記，例如嘌呤霉素抗性基因；5:多腺苷酸化信號(hào)；6:氨芐西林抗性盒；7:復(fù)制起點(diǎn)；8:病毒反式作用因子，例如NP ORF ；9:病毒反式作用因子，例如L ORF ；10:驅(qū)動(dòng)沙粒病毒基因組節(jié)段在C-細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如聚合酶I啟動(dòng)子；11:所述S節(jié)段的5’ UTR; 12:目的抗原；13:所述S節(jié)段的IGR; 14:NP基因；15:所述S節(jié)段的3’UTR;16:聚合酶I終止子；17:所述L節(jié)段的5’ UTR ; 18:Z基因；19:所述L節(jié)段的IGR ；20:L基因；21:所述L節(jié)段的3’ UTR0
[0027]圖3
[0028]沙粒病毒載體在接種后數(shù)天內(nèi)被清除，因此不會(huì)在免疫接種者中引起免疫抑制。
[0029]A:第O天，用rLCMV/GFP⑴靜脈內(nèi)免疫小鼠。其后，在不同的時(shí)間點(diǎn)(2;以天數(shù)表示)，測(cè)量脾臟中病毒基因組拷貝數(shù)(3 ；以1glO表示)。 [0030]B:作為初次免疫/感染(1° )，用rLCMV/0VA(5)免疫小鼠，或者不感染(6)，或者用野生型LCMV(7)感染。在第20天，所有的小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)感染水皰性口炎病毒(VSV，8)(2° )。然后，收集血液用于測(cè)量抗病毒和抗載體的T細(xì)胞應(yīng)答(3)和抗病毒抗體應(yīng)答(4)。在第28天，在肽再次刺激后，通過(guò)Y干擾素的細(xì)胞內(nèi)染色來(lái)測(cè)量外周血中H-2Kb-SIINFEKL(來(lái)源于卵清蛋白的⑶8+T細(xì)胞表位)特異性⑶8+T細(xì)胞(9)和H-2Kb-VSV-NP52-29 (來(lái)源于VSV-NP的CD8+T細(xì)胞表位)特異性CD8+T細(xì)胞(10)(數(shù)值以CD8+T細(xì)胞中特定細(xì)胞的百分比來(lái)表示)。在第27天(以VSV感染后的時(shí)間點(diǎn)為參照，以“d7”表示)、第29天(以“d9”表示)和第61天(以“d41”表示)，采用50%空斑減少試驗(yàn)測(cè)試血清中的總VSV中和抗體(11)和β_巰基乙醇抗性IgG(12)(數(shù)值以40倍預(yù)稀釋血清的log2表示)，。
[0031]圖4
[0032]沙粒病毒載體以高效價(jià)誘導(dǎo)高比率的具有長(zhǎng)期記憶的⑶8+T細(xì)胞和具有長(zhǎng)期記憶的抗體。
[0033]A:用rLCMV/OVA免疫小鼠，并且在一段時(shí)間內(nèi)(2 ;以天數(shù)表示)收集血液樣品，用于以I類(lèi)MHC四聚體檢測(cè)H2Kb-0VA/SIINFEKL特異性⑶8+T細(xì)胞的比率(3，數(shù)值表示為CD8+T細(xì)胞區(qū)室中四聚體陽(yáng)性的CD8+T細(xì)胞的比率)。
[0034]B:通過(guò)皮下注射(s.c.)或靜脈內(nèi)(1.V.)途徑用指定劑量的rLCMV/OVA免疫小鼠(I)，在第14天(5)和第58天(6)通過(guò)ELISA測(cè)量血清中OVA特異性IgG。數(shù)值以得到兩倍于背景光密度(OD)的測(cè)量值的血清稀釋度表示。
[0035]圖5
[0036]沙粒病毒載體不引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0037]給小鼠腦內(nèi)免疫接種rLCMV/OVA (空心方塊)或者野生型LCMV (黑色圓)，然后在指定的時(shí)間點(diǎn)(1，以天數(shù)表示)監(jiān)控終末性脈絡(luò)叢腦膜炎的臨床體征。顯示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的健康動(dòng)物數(shù)/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)(2)。
[0038]圖 6
[0039]沙粒病毒載體賦予了針對(duì)感染攻擊的T細(xì)胞介導(dǎo)的和抗體介導(dǎo)的保護(hù)作用。
[0040]A)在實(shí)驗(yàn)的第O天，給小鼠免疫接種rLCMV/OVA(AA組)或用作陰性對(duì)照的表達(dá)無(wú)關(guān)的Cre重組酶抗原的rLCMV對(duì)照載體(BB組)。間隔16天或58天(dl6，d58)后，用表達(dá)OVA的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌進(jìn)行靜脈內(nèi)攻擊。攻擊后第四天，測(cè)量動(dòng)物脾臟中的細(xì)菌效價(jià)(I)(以每個(gè)器官的菌落形成單位的對(duì)數(shù)(1glO)來(lái)表示)。黑色圖表示每只小鼠的值。豎線(xiàn)表示每組的平均值。
[0041]B)給I類(lèi)干擾素受體缺陷型小鼠免疫接種LCMV載體(實(shí)心方塊)或不進(jìn)行免疫接種(空心圈)，所述LCMV載體表達(dá)水皰性口炎病毒包膜蛋白G的具有抗原特性但不具有功能的變體(通過(guò)在胞外結(jié)構(gòu)域中插入外源多肽序列來(lái)修飾)。一個(gè)月后，用2X IO6PFU的水皰性口炎病毒來(lái)靜脈內(nèi)攻擊所有的動(dòng)物。在攻擊后的指定時(shí)間點(diǎn)(2，以天數(shù)表示)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的終束腦脊髓炎臨床體征。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和組，健康存活表示為健康動(dòng)物數(shù)/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)⑶。
【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明涉及感染性沙粒病毒顆粒(稱(chēng)為沙粒病毒載體)，其被改造成包含能在被感染細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在正常的非基因工程細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生感染性后代顆粒的基因組。圖1A示意性顯示該原理。圖1B中示出了實(shí)例數(shù)據(jù)。
[0043]沙粒病毒載體的復(fù)制需要對(duì)復(fù)制缺陷型載體進(jìn)行回補(bǔ)的基因工程細(xì)胞。細(xì)胞被感染后，沙粒病毒載體的基因組不僅表達(dá)沙粒病毒蛋白質(zhì)，而且還表達(dá)額外的目的蛋白質(zhì)，例如目的抗原。沙粒病毒載體是通過(guò)針對(duì)LCMV描述的標(biāo)準(zhǔn)反向遺傳技術(shù)產(chǎn)生的(L.Flatz, A.Bergthaler, J.C.de la Torre 和 D.D.Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA103:4663-4668,2006 ；A.B.Sanchez and J.C.de la Tore, Virology350:370，2006)，但是它們的基因組是通過(guò)以下一種或更多種方法進(jìn)行修飾以獲得上述特征的:
[0044]i)沙粒病毒的四個(gè)開(kāi)放閱讀框(糖蛋白(GP);核蛋白(NP);基質(zhì)蛋白Z ;RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L)中的一個(gè)或者更多個(gè)(例如兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))被除去或者突變，以防止在正常細(xì)胞中形成感染性顆粒，但是仍然允許在被沙粒病毒載體感染的細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。
[0045]ii)可引入編碼一種或多種蛋白質(zhì)的外源核酸，或者，或另外，可引入外源核酸來(lái)調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)。這些外源核酸包括但不限于短發(fā)夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(SiRNA)、微RNA(miRNA)及其前體。這些外源核酸可通過(guò)沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子(S節(jié)段的5’UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR)之中的一個(gè)或更多個(gè)(例如兩個(gè)或三個(gè))進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，或者通過(guò)額外引入的可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III讀出的啟動(dòng)子序列(例如天然存在于病毒UTR中的病毒啟動(dòng)子序列的拷貝、28S核糖體RNA啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或5S核糖體RNA啟動(dòng)子)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的核糖核酸可自身或者可通過(guò)與沙粒病毒開(kāi)放閱讀框相融合被通讀而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。可在病毒轉(zhuǎn)錄序列的合適位點(diǎn)引入一個(gè)或更多個(gè)(例如兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0046]本文所用的“調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)”指在所有被載體靶向的細(xì)胞中(或以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式)減少或增加宿主基因的表達(dá)。這些所期望的特征可通過(guò)將核酸序列引入到載體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0047]沙粒病毒載體可用于改善一般生活和健康，并且可在多種情形下用于免疫(以預(yù)防形式)或治療(以免疫治療方式)動(dòng)物(包括人)，所述情形包括但不限于
[0048]i)感染:包括但不限于病毒(比如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒和呼吸道合胞體病毒(RSV))、細(xì)菌(比如分枝桿菌、嗜血桿菌(haemophilus spp)和肺炎雙球菌(pneumococcus spp))和寄生蟲(chóng)(比如痕原蟲(chóng)、阿米巴蟲(chóng)(amebia)和philaria)以及朊病毒(prion)(比如可以導(dǎo)致經(jīng)典和變異的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)和瘋牛病的傳染劑)；
[0049]ii)自身免疫病:包括但不限于I型糖尿病、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和銀屑?。?br> [0050]iii)腫瘤疾病:包括但不限于黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤；
[0051]iv)代謝疾病:包括但不限于2型糖尿病、肥胖和痛風(fēng)；
[0052]V)退行性疾病:包括但不限于阿爾茨海默病和帕金森??；
[0053]vi)遺傳病:包 括但不限于亨廷頓舞蹈病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病和脂質(zhì)貯積癥；
[0054]vii)物質(zhì)依賴(lài):包括但不限于煙草和酒精濫用；和
[0055]viii)變應(yīng)性疾病:包括但不限于季節(jié)性或慢性鼻結(jié)膜炎、哮喘和濕疹。
[0056]出于同樣目的，沙粒病毒載體可用于將目的基因(例如外源核酸)引入活體動(dòng)物(包括人)的細(xì)胞中，即基因治療，或者在生物技術(shù)應(yīng)用中用于引入和表達(dá)目的基因產(chǎn)物。通過(guò)從其基因組缺失例如病毒顆粒釋放所需的Z基因或者感染靶細(xì)胞所需的GP基因可以消除沙粒病毒載體的復(fù)制(參見(jiàn)圖3)，感染細(xì)胞的總數(shù)受到施用給例如受接種者或基因治療接受者的接種物或者意外傳播給涉及醫(yī)療應(yīng)用或生物技術(shù)應(yīng)用的人或動(dòng)物的接種物的限制。已知野生型沙粒病毒感染中的沙粒病毒病和免疫抑制都是由不受抑制的病毒復(fù)制引起的。因此，消除沙粒病毒載體的復(fù)制可預(yù)防有目的地或意外傳播載體顆粒所導(dǎo)致的致病性。在本發(fā)明中，一個(gè)重要的方面是為了表達(dá)一種或更多種外源蛋白質(zhì)(例如目的抗原)而以有益方式利用上述消除復(fù)制的必要性:除去(例如在結(jié)構(gòu)上缺失或從功能上誘變)沙粒病毒的一個(gè)或更多個(gè)基因釋放了相應(yīng)啟動(dòng)子以用于表達(dá)所選蛋白質(zhì)。
[0057]本發(fā)明的沙粒病毒載體策略的多個(gè)組合優(yōu)點(diǎn)是:值得注意的是，盡管沙粒病毒載體不能傳播，但是其準(zhǔn)確保留了免疫原性，這對(duì)于那些從事沙粒病毒免疫學(xué)研究的免疫學(xué)家來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的驚喜。在關(guān)鍵的時(shí)間段存在相當(dāng)多的病毒和抗原負(fù)載通常被認(rèn)為是造成沙粒病毒的卓越的免疫原性特性所必需的。就安全性而言，所述病毒(和所述載體)的非溶胞行為是優(yōu)于大多數(shù)可用載體系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)，沙粒病毒一般不具有致癌潛能也是其主要優(yōu)點(diǎn)。而且，就安全性而言，沙粒病毒載體不能進(jìn)行復(fù)制也是非常重要的。特別是用作疫苗的應(yīng)用中，沙粒病毒載體針對(duì)抗體中和具有高水平抗性是非常有利的。這個(gè)特點(diǎn)是許多沙粒病毒包膜所固有的，并且可利用相同的沙粒病毒載體進(jìn)行重復(fù)免疫而獲得重復(fù)加強(qiáng)的免疫應(yīng)答。同樣地，人群中預(yù)存在的針對(duì)沙粒病毒的免疫性是非常低的或可忽略不計(jì)。[0058]沙粒病毒被認(rèn)為是舊世界病毒(例如拉沙病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、Mopeia病毒或伊派病毒(IPPy病毒))或新世界病毒(例如阿馬帕里病毒、Flexal病毒、瓜納瑞托病毒、胡寧病毒、萊蒂羅氏病毒、馬丘波病毒、Oliveros病毒、Parana病毒、皮欽德病毒、Pirital病毒、Sabia病毒、Tacaribe病毒、他米阿米病毒、BearCanyon病毒或白水河病毒)。優(yōu)選舊世界病毒的成員，例如拉沙病毒或LCMV，尤其是LCMV。
[0059]編碼一種或多種目的蛋白質(zhì)的外源核酸是例如來(lái)源于信使RNA的序列或?qū)?yīng)于初級(jí)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA，當(dāng)本發(fā)明攜帶此RNA的沙粒病毒顆粒感染細(xì)胞后，導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，也可以考慮那些通過(guò)例如RNA干擾來(lái)修飾被沙粒病毒載體顆粒感染的細(xì)胞中的基因表達(dá)的外源核酸。
[0060]可引入到本發(fā)明的基因工程沙粒病毒中的目的核糖核酸是編碼蛋白或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的任意序列，所述序列可通過(guò)替換糖蛋白GP、基質(zhì)蛋白Z、核蛋白NP或者聚合酶蛋白L的開(kāi)放閱讀框或者與其融合而被引入到沙粒病毒載體基因組中，即其可在沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子(S節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR)或者插入了可分別被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III讀出的調(diào)控元件(例如天然存在于病毒UTR中的病毒啟動(dòng)子序列的拷貝、28S核糖體RNA啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或5S核糖體RNA啟動(dòng)子)的核糖核酸的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。所述蛋白或核酸可自身進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)或者可分別通過(guò)與沙粒病毒開(kāi)放閱讀框融合被通讀和/或與一個(gè)或更多個(gè)(例如兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)相組合被通讀而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。如利用GFP和卵清蛋白基因替換GP所證實(shí)的，所插入的基因的長(zhǎng)度和所表達(dá)蛋白的特性不是關(guān)鍵性的，這使得表達(dá)多種目的蛋白質(zhì)成為可能。
[0061 ] 優(yōu)選的目的蛋白質(zhì)是肽抗原或蛋白性抗原。本發(fā)明的肽抗原或蛋白性抗原可例如選自(a)適用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對(duì)感染性疾病的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或者肽；(b)適用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對(duì)腫瘤疾病即癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或者肽；和(C)適用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對(duì)變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或者肽?？蓪⒖乖M合(例如來(lái)自一種或更多種感染性生物或者腫瘤或變應(yīng)原的抗原的組合)進(jìn)行組合以分別誘導(dǎo)或者調(diào)節(jié)用于保護(hù)或治療多于一種的感染、腫瘤類(lèi)型或變應(yīng)性疾病的免疫應(yīng)答。
[0062]本文所用的“調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”是指i)在質(zhì)量或數(shù)量上提高患者的有益的免疫應(yīng)答。這是所期望的，例如，在對(duì)被感染個(gè)體進(jìn)行免疫治療的情形下增強(qiáng)HIV特異性T細(xì)胞和抗體免疫應(yīng)答時(shí)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”還指ii)通常稱(chēng)為脫敏的過(guò)程，例如通過(guò)抑制變應(yīng)類(lèi)型的免疫應(yīng)答(例如免疫球蛋白E同種型中的一種)來(lái)對(duì)變應(yīng)原進(jìn)行脫敏，目的是替代或者加強(qiáng)保護(hù)性免疫應(yīng)答或者減輕致病性免疫應(yīng)答。
[0063]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述抗原是可用于預(yù)防感染性疾病的抗原?？乖蚩乖瓫Q定簇的具體實(shí)例包括HIV抗原gp41、gpl20、gag和pol,丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，流感抗原血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶，乙型肝炎表面抗原和瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。
[0064]優(yōu)選地，所述抗原選自呼吸道合胞體病毒抗原、人免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、水痘帶狀皰疫病毒抗原、單純皰疫病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原和來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌的抗原。
[0065]對(duì)用于治療癌癥的組合物和方法中的抗原的選擇是治療這種疾病的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。此類(lèi)抗原的代表性實(shí)例包括:HER2/neu(乳腺癌)、GD2(神經(jīng)母細(xì)胞瘤)、EGF-R (惡性膠質(zhì)瘤)、CEA(甲狀腺髓樣癌)、⑶52 (白血病)、MUC1 (在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá))、gplOO蛋白、MELAN-A/MART1或者腫瘤抑制基因WTl的產(chǎn)物。
[0066]對(duì)用于治療變態(tài)反應(yīng)的組合物和方法中的抗原的選擇是治療這種疾病的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。此類(lèi)抗原的代表性實(shí)例包括但是不限于樺樹(shù)花粉Bet Vl和貓變應(yīng)原Fel dl0
[0067]對(duì)用于治療肥胖的組合物和方法中的抗原的選擇是治療這種疾病的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。此類(lèi)抗原的代表性實(shí)例包括但是不限于生長(zhǎng)激素釋放肽(ghrelin)和抑胃肽(GIP)。
[0068]沙粒病毒載體基因組的設(shè)計(jì)
[0069]從野生型沙粒病毒基因組開(kāi)始(圖1C)，設(shè)計(jì)沙粒病毒載體基因組以保留所述兩個(gè)節(jié)段的5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)中至少必需的調(diào)控元件，優(yōu)選還保留基因間隔區(qū)(IGR)。在被感染細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)所需的最小反式作用因子作為可表達(dá)開(kāi)放閱讀框保留在所述載體基因組中，但是它們可位于基因組中的不同位置并且可受控于與天然啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)子，或者可由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)。四個(gè)病毒基因(NP，L，GP，Z)中的至少一個(gè)被除去或者在功能上失活?？蓪⒁粋€(gè)或更多個(gè)額外目的基因或者核酸區(qū)段插入到沙粒病毒載體基因組中，其位置和取向使它們能在四個(gè)病毒啟動(dòng)子(S節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR)或者內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或者可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III讀出的啟動(dòng)子的控制下在受感染的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。圖1C顯示一個(gè)實(shí)例，其中沙粒病毒GP開(kāi)放閱讀框(ORF)被卵清蛋白(OVA)或綠色熒光蛋白(GFP ) ORF替換。
[0070]回補(bǔ)細(xì)胞系的$生
[0071]由于“缺失”(是指除去或者在功能上失活)了沙粒病毒載體中的一個(gè)或更多個(gè)病毒基因(在這里以缺失糖蛋白GP為例)，因此沙粒病毒載體必須在反式(in trans)提供缺失病毒基因(例如本實(shí)例中的GP)的細(xì)胞中產(chǎn)生并擴(kuò)增。這樣的回補(bǔ)細(xì)胞系(本文稱(chēng)為C細(xì)胞)是通過(guò)用表達(dá)目的病毒基因的一種或更多種質(zhì)粒(回補(bǔ)質(zhì)粒，稱(chēng)為C質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(比如BHK-21、HEK293、VERO或者其他細(xì)胞系(在這里以BHK-21為例))而產(chǎn)生的。所述C質(zhì)粒(示例見(jiàn)圖2A)表達(dá)沙粒病毒載體中被缺失的病毒基因，其是在一個(gè)或更多個(gè)適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒(例如哺乳動(dòng)物聚合酶II啟動(dòng)子，比如帶有多腺苷酸化信號(hào)的CMV或者EFla啟動(dòng)子)的控制下產(chǎn)生的。此外，回補(bǔ)質(zhì)粒的特征是哺乳動(dòng)物選擇性標(biāo)記，例如如嘌呤霉素抗性，其受控于適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的表達(dá)盒(例如上文所述的聚合酶II表達(dá)盒)，或者在病毒基因轉(zhuǎn)錄本之后接內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(如腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))，然后再接哺乳動(dòng)物抗性標(biāo)記。就在大腸桿菌(巨。。Ii)中產(chǎn)生而言，質(zhì)粒的其它特征是細(xì)菌選擇性標(biāo)記，如氨芐西林抗性盒。
[0072]將待使用的細(xì)胞(如BHK_21、HEK293、MC57G或者其他細(xì)胞)保持在培養(yǎng)物中，并通過(guò)任何常用的策略(例如基于磷酸鈣、脂質(zhì)體的方法或者電穿孔法)用回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。數(shù)天后，加入合適濃度的合適的選擇劑，例如嘌呤霉素。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法分離存活的克隆并進(jìn)行亞克隆，然后利用針對(duì)目的病毒蛋白的抗體，通過(guò)Western印跡或者流式細(xì)胞術(shù)鑒定高表達(dá)的C細(xì)胞克隆。作為使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C細(xì)胞的替代方案，對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可在下面使用C細(xì)胞的每個(gè)步驟中回補(bǔ)被缺失的病毒基因。
[0073]用于回收沙粒病毒載體的質(zhì)粒
[0074]需要兩種類(lèi)型的質(zhì)粒:
[0075]i)用于在C細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)沙粒病毒的最小反式作用因子的兩個(gè)質(zhì)粒，稱(chēng)為T(mén)F-質(zhì)粒(實(shí)例見(jiàn)圖2B)，所述載體來(lái)自例如本實(shí)施例中LCMV的NP蛋白和L蛋白。
[0076]ii)用于在C細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)沙粒病毒載體基因組節(jié)段(例如圖1C中所述的經(jīng)設(shè)計(jì)修飾的節(jié)段)的質(zhì)粒，稱(chēng)為GS質(zhì)粒(實(shí)例見(jiàn)圖2C)。TF質(zhì)粒表達(dá)相應(yīng)沙粒病毒載體的NP蛋白和L蛋白，其受控于適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)盒(例如哺乳動(dòng)物聚合酶II啟動(dòng)子，比如CMV或者EFla啟動(dòng)子，其中任何一個(gè)優(yōu)選與多腺苷酸化信號(hào)組合)(圖2B)。GS質(zhì)粒表達(dá)所述載體的小(S)和大(L)基因組節(jié)段。通常，可使用聚合酶I驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒(圖2C)或者T7噬菌體RNA聚合酶(T7)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，后者優(yōu)先與3’末端核酶一起用于加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，從而獲得正確的末端。在利用基于T7的系統(tǒng)的情形下，C細(xì)胞中T7的表達(dá)必須通過(guò)在回收過(guò)程中包含額外的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)提供，所述表達(dá)質(zhì)粒與TF質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)相似并且提供T7，或者將C-細(xì)胞構(gòu)建成以穩(wěn)定方式另外表達(dá)T7。
[0077]沙粒病毒載體的回收
[0078]第一天:用兩種TF質(zhì)粒和兩種GS質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)染C細(xì)胞(通常在M6孔板中的匯合度為80% )。就此而言，可采用任何常用的策略，比如基于磷酸鈣、脂質(zhì)體的方法或者電穿孔法。
[0079]3-5天后:收獲培養(yǎng)物上清(沙粒病毒載體制備物)，分成等份式樣，并根據(jù)使用前沙粒病毒載體應(yīng)當(dāng)儲(chǔ)存的時(shí)間的長(zhǎng)短，分別貯存在4°C、_20°C或者_(dá)80°C下。然后通過(guò)免疫噬斑實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)C細(xì)胞上沙粒病毒載體制備物的感染性效價(jià)。
[0080]沙粒病毒載體感染性的滴定
[0081]為了測(cè)定沙粒病毒載體的感染性，按照病毒學(xué)中常用的原理，將C細(xì)胞用于典型的免疫噬斑實(shí)驗(yàn)，如下文所述:
[0082]用10倍稀釋的沙粒病毒載體制備物感染C細(xì)胞單層(通常在M24孔板中，80%匯合度)90分鐘。然后，在所述細(xì)胞層上覆蓋補(bǔ)充有I %甲基纖維素的合適的細(xì)胞培養(yǎng)基。2~3天后，根據(jù)所用的C細(xì)胞系的許可性，除去培養(yǎng)物上清，通常用乙醇/丙酮或者4%福爾馬林固定所述細(xì)胞層，然后用柔和的去污劑來(lái)增加細(xì)胞層的通透性。隨后用針對(duì)待測(cè)試沙粒病毒載體中蛋白質(zhì)之一或者所引入抗原的單克隆或多克隆抗體制備物鑒定沙粒病毒載體感染的細(xì)胞噬斑。采用合適的試劑(比如與顯色體系(如辣根過(guò)氧化物酶)綴合的抗同種型或者抗種屬抗體)檢測(cè)結(jié)合抗體，然后與合適的發(fā)色團(tuán)(如鄰苯二胺)進(jìn)行顏色反應(yīng)。對(duì)所述板上的所得噬斑進(jìn)行計(jì)數(shù)以計(jì)算每單位體積沙粒病毒載體制備物中感染性噬斑形成單位(FFU)的數(shù)量。
[0083]疫苗和藥物制劑
[0084]本發(fā)明還涉及含有上述基因工程化沙粒病毒的疫苗和藥物制劑。根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法制備用于其它用途的疫苗和藥物制劑。
[0085]用于腸內(nèi)施用(例如鼻腔、口含、直腸或者口服施用)和用于胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或者皮下施用)給溫血?jiǎng)游?特別是人)的組合物是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是用于胃腸道外施用的組合物。所述組合物包含單獨(dú)的基因工程沙粒病毒，或者優(yōu)選包含基因工程沙粒病毒和可藥用載體?；钚猿煞值膭┝咳Q于免疫接種的類(lèi)型、待治療的疾病以及種屬、年齡、體重和個(gè)體狀況、個(gè)體的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和施用方式。
[0086]所述藥物組合物包含約IO3至約IO11個(gè)噬斑形成單位的基因工程化沙粒病毒。用于胃腸道外施用的單位劑量形式比如為安瓿或者西林瓶，例如含有約IO3至IOltl個(gè)噬斑形成單位或IO5至IO15個(gè)基因工程沙粒病毒物理顆粒的西林瓶。
[0087]優(yōu)選使用基因工程化沙粒病毒的懸浮液或者分散體，尤其是等張含水分散體或懸浮液。所述藥物組合物可以是無(wú)菌的和/或可含有賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑，而且可以本身公知的方法進(jìn)行制備，例如通過(guò)常規(guī)的分散和懸浮方法。所述分散體或者懸浮液可包含粘性調(diào)節(jié)劑。所述懸浮液或者分散體在約2-4°C的溫度下保存，或者優(yōu)選地，可冷凍以長(zhǎng)期保存，然后在使用前不久解凍。
[0088]本發(fā)明還涉及用于制備藥物制劑形式的疫苗的方法以及基因工程化沙粒病毒制備藥物制劑形式的疫苗中的用途，所述疫苗包含基因工程沙粒病毒用作活性成分。本發(fā)明的藥物組合物可以本身公知的方法進(jìn)行制備，例如通過(guò)傳統(tǒng)的混合和/或分散方法。
[0089]向疫苗接種者和基因治療接受者施用
[0090]本發(fā)明還涉及利用基因工程化沙粒病毒進(jìn)行疫苗接種和基因治療的方法，如上文所述。
[0091]施用沙粒病毒載體用于提高生活質(zhì)量，包括但不限于疫苗接種、免疫治療和基因治療，以預(yù)防、治療 或改善以下情況:
[0092]i)感染:包括但不限于病毒(比如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、細(xì)菌(比如分枝桿菌、嗜血桿菌和肺炎雙球菌)、寄生蟲(chóng)(比如瘧原蟲(chóng)、阿米巴蟲(chóng)和philaria)以及朊病毒(比如可以導(dǎo)致經(jīng)典和變異的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布氏病和瘋牛病的傳染劑)；
[0093]ii)自身免疫疾病:包括但不限于I型糖尿病、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和銀屑??；
[0094]iii)腫瘤疾病:包括但不限于黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤；
[0095]iv)代謝疾病:包括但不限于2型糖尿病、肥胖和痛風(fēng)；
[0096]V)退行性疾病:包括但不限于阿爾茨海默病和帕金森病；
[0097]vi)遺傳病:包括但不限于亨廷頓舞蹈病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病和脂質(zhì)貯積癥；
[0098]vii)物質(zhì)依賴(lài):包括但不限于煙草和酒精濫用。
[0099]特別地，本發(fā)明涉及預(yù)防由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和朊病毒引起的感染的方法，其包括向有此需求的患者施用含有基因工程化沙粒病毒的疫苗，同樣地，本發(fā)明還涉及預(yù)防上文所述的腫瘤疾病和退行性疾病的方法。
[0100]此外，本發(fā)明還涉及治療由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和朊粒引起的感染、自身免疫疾病、腫瘤疾病、代謝疾病、退行性疾病、遺傳病或物質(zhì)依賴(lài)的方法，其包括向有此需求的患者施用含有基因工程化沙粒病毒的藥物制劑。
[0101]可以通過(guò)一種或者更多種可用的途徑向受接種者施用沙粒病毒載體，所述途徑包括但不限于肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、口服、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑，例如，如圖3A中列舉的實(shí)驗(yàn)中。這將導(dǎo)致細(xì)胞被感染以及病毒基因組節(jié)段在這些高度相同的初始感染細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，例如在靜脈內(nèi)接種后。這包括脾臟中可誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的樹(shù)突細(xì)胞。由于沙粒病毒載體不能在受接種者的細(xì)胞中復(fù)制(因其缺乏C細(xì)胞中存在的回補(bǔ)病毒蛋白質(zhì))，所以沙粒病毒載體RNA水平會(huì)隨時(shí)間迅速下降，病毒基因組將在接種沙粒病毒載體后數(shù)天內(nèi)消失(圖3A)。由于沙粒病毒載體不能復(fù)制且持久存在，因此與利用相同劑量的野生型病毒進(jìn)行的感染相比，沙粒病毒載體免疫接種不會(huì)引起免疫抑制(圖3B)或者疾病(圖5)。這在感染了野生型LCMV或者表達(dá)OVA而不是LCMV-GP的基于LCMV的載體(rLCMV/OVA ;與圖1C的結(jié)果進(jìn)行比較)的小鼠中進(jìn)行測(cè)試。隨后，水皰性口炎病毒感染在之前用rLCMV/OVA免疫的動(dòng)物中引發(fā)了正常的CD8T細(xì)胞和抗體應(yīng)答，但是在之前用野生型LCMV感染的動(dòng)物中則被抑制。同樣地，當(dāng)顱內(nèi)施用時(shí)，野生型LCMV在小鼠中引起致死性脈絡(luò)叢腦膜炎，而rLCMV/OVA沒(méi)有引起任何臨床上可檢測(cè)的疾病體征(圖5)。
[0102]盡管其具有短暫的性質(zhì)，然而目的抗原的表達(dá)確實(shí)誘發(fā)了強(qiáng)烈和長(zhǎng)期的T細(xì)胞應(yīng)答(見(jiàn)圖4A)，并且誘發(fā)了高效價(jià)的特異性抗體(圖4B)。這個(gè)反應(yīng)是劑量依賴(lài)性的，但是即使小劑量也有效(圖4B)。在小鼠中測(cè)試了由基于LCMV的疫苗載體誘發(fā)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的保護(hù)能力。免疫接種rLCMV/OVA可對(duì)表達(dá)OVA的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌(rLM/0VA)的感染性攻擊提供保護(hù)。這表現(xiàn)為在進(jìn)行疫苗接種的動(dòng)物的脾臟中rLM/OVA的效價(jià)顯著下降或者檢測(cè)不到(見(jiàn)圖6A)。在I型干擾素受體缺陷型小鼠中測(cè)試了 LCMV載體對(duì)抗體介導(dǎo)的保護(hù)作用的誘導(dǎo)。這些小鼠對(duì)水皰性口炎病毒(VSV)非常敏感，其50%致死劑量(LD5tl)在50PFU范圍左右。就針對(duì)VSV的免疫而言，利用表達(dá)水皰性口炎病毒包膜蛋白G的具有抗原性但不具有功能性的變體(通過(guò)在其胞外結(jié)構(gòu)域中插入一個(gè)外源肽序列進(jìn)行修飾)LCMV載體。經(jīng)免疫的小鼠可在感染2 X IO5PFU VSV (即> 10000倍LD5tl)后仍然存活，而未免疫的對(duì)照小鼠在VSV攻擊后2~3天內(nèi)出現(xiàn)了終末性脈絡(luò)叢腦膜炎(圖6)。但是，值得注意的是，通過(guò)UV輻射使沙粒病毒載體基因組失活導(dǎo)致其免疫原性消失，表明了病毒載體在感染細(xì)胞中的復(fù)制和基因表達(dá)是疫苗保持效力所必需的。此外，可通過(guò)重復(fù)利用同樣的(同源的)或不同(異 源的)沙粒病毒載體(即通過(guò)加強(qiáng)免疫接種的形式)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞和抗體免疫應(yīng)答。在同源性初免-加強(qiáng)方案中，其中不存在中和抗體誘導(dǎo)，這使得加強(qiáng)免疫特別有效。
[0103]當(dāng)用于基因治療時(shí)，沙粒病毒載體可全身施用(例如靜脈內(nèi))或者局部施用(例如利用合適的裝置進(jìn)行定位注射)用于靶向和遞送至其中應(yīng)當(dāng)表達(dá)目的抗原的特定組織中。由于其非溶胞的性質(zhì)，沙粒病毒載體不會(huì)對(duì)其感染的細(xì)胞有害，并且可在功能上替代目的基因。
[0104]作為采用沙粒病毒載體來(lái)治療多細(xì)胞生物的替代方案，將用生物相容材料包衣的回補(bǔ)細(xì)胞(C細(xì)胞)或者非回補(bǔ)(正常)細(xì)胞植入受種者體內(nèi)可防止受種者的免疫排斥，但仍允許感染性(植入感染性C細(xì)胞)顆?；蛘叻歉腥拘?植入被感染的正常細(xì)胞)顆粒或者蛋白質(zhì)和/或核糖核酸從包裹細(xì)胞中穿過(guò)包衣層恒定釋放到受種者組織中。
[0105]在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)目的蛋白質(zhì)
[0106]此外，本發(fā)明還涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)目的蛋白質(zhì)，其中利用細(xì)胞基因工程化沙粒病毒感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物。當(dāng)用于在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白質(zhì)或者核酸區(qū)段(例如目的抗原)時(shí)，涉及以下兩種方法:[0107]i)在感染復(fù)數(shù)(MOI)為I或更高(例如2、3或者4)的情形下用沙粒病毒載體制備物感染目的細(xì)胞類(lèi)型，導(dǎo)致在感染后不久在所有細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。
[0108]?)或者，可使用較低的Μ0Ι，并可針對(duì)其病毒驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平來(lái)選擇單細(xì)胞克隆。隨后，單克隆可進(jìn)行無(wú)限擴(kuò)增，因?yàn)樯沉２《据d體具有非溶胞性質(zhì)。不管采用哪種方法，然后可從培養(yǎng)物上清或者細(xì)胞本身收集目的蛋白質(zhì)，這取決于所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
[0109]然而，本發(fā)明不限于這兩種策略，也可考慮采用基因工程化沙粒病毒作為載體來(lái)驅(qū)動(dòng)目的蛋白質(zhì)或者核酸之表達(dá)的其它方法。
[0110]以下部分對(duì)應(yīng)于母案申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū):
[0111]1.一種感染性沙粒病毒顆粒，其被改造成包含能在被感染細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在正常的非基因工程細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生
[0112]感染性后代顆粒的基因組。
[0113]2.根據(jù)項(xiàng)I的沙粒病毒顆粒，其包含編碼目的蛋白質(zhì)或肽的額外的核酸。
[0114]3.根據(jù)項(xiàng)I的沙粒病毒顆粒，其包含調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的額外的核酸。
[0115]4.根據(jù)項(xiàng)2或3的沙粒病毒顆粒，其包含經(jīng)修飾的基因組，其中:
[0116]i)沙粒病毒的四個(gè)開(kāi)放閱讀框即糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白Z和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L中的一個(gè)或更多個(gè)被除去或突變，以阻止在正常細(xì)胞中復(fù)制，但是仍允許在被沙粒病毒載體感染的細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)；
[0117]ii)使編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸在沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子即S節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR之中一個(gè)或更多個(gè)的控制下進(jìn)行表達(dá)，和/或在可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III讀出的調(diào)控元件的控制下進(jìn)行表達(dá)，其可自身進(jìn)行表達(dá)或者通過(guò)與沙粒病毒蛋白質(zhì)開(kāi)放閱讀框融合而被通讀；以及任選地
[0118]iii)引入一個(gè)或者多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)在被沙粒病毒感染的細(xì)胞中的表達(dá)。
[0119]5.根據(jù)項(xiàng)4的沙粒病毒顆粒，其中所述沙粒病毒的開(kāi)放閱讀框糖蛋白(GP)被除去或突變。
[0120]6.根據(jù)項(xiàng)5的沙粒病毒顆粒，其中所述沙粒病毒顆粒的開(kāi)放閱讀框糖蛋白(GP)被除去，并且替換成編碼一種或多種目的蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸。
[0121]7.根據(jù)項(xiàng)5的沙粒病毒顆粒，其中所述沙粒病毒顆粒的開(kāi)放閱讀框糖蛋白(GP)被除去，并且替換成編碼來(lái)自感染性生物、腫瘤或變應(yīng)原的肽或蛋白質(zhì)抗原的外源核糖核酸。
[0122]8.根據(jù)項(xiàng)5的沙粒病毒顆粒，其中所述沙粒病毒顆粒的開(kāi)放閱讀框糖蛋白(GP)被除去，并且替換成選自短發(fā)夾RNA (shRNA)、小干擾二 RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)的外源核糖核酸。
[0123]9.根據(jù)項(xiàng)I至8中任一項(xiàng)的沙粒病毒顆粒，其中所述沙粒病毒顆粒是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)。
[0124]10.根據(jù)項(xiàng)9的沙粒病毒顆粒，其包含編碼抗原的外源核糖核酸，所述抗原選自呼吸道合胞體病毒抗原、人免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、帶狀皰疫病毒抗原、單純皰疫病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原和來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的抗原。
[0125]11.疫苗或藥物制劑，其包含根據(jù)項(xiàng)2至10中任一項(xiàng)的沙粒病毒顆粒。[0126]12.預(yù)防患者中由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和朊病毒所致感染的方法，其包括向有此需求的患者施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)2至10中任一項(xiàng)所述沙粒病毒顆粒。
[0127]13.治療患者中由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和朊病毒所致感染、自身免疫疾病、腫瘤疾病、代謝疾病、退行性疾病、遺傳病、變應(yīng)性疾病或物質(zhì)依賴(lài)的方法，其包括向有此需求的患者施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)2至10中任一項(xiàng)所述沙粒病毒顆粒。
[0128]14.在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)目的蛋白質(zhì)或修飾基因表達(dá)的方法，其中利用根據(jù)項(xiàng)2至10中任一項(xiàng)所述沙 病毒顆粒感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物。
【權(quán)利要求】
1.復(fù)制缺陷型感染性沙粒病毒顆粒的沙粒病毒基因組，其能夠在被所述病毒顆粒感染的細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在非回補(bǔ)細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生感染性后代顆粒，其中在所述沙粒病毒基因組中，編碼糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白Z和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L的四個(gè)沙粒病毒開(kāi)放閱讀框中的至少一個(gè)被除去或在功能上失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙粒病毒基因組，其通過(guò)引入編碼選自下列之抗原的外源核糖核酸被改造:呼吸道合胞體病毒抗原、人免疫缺陷病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、帶狀皰疹病毒抗原、單純皰疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、結(jié)核分枝桿菌抗原、適用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對(duì)腫瘤疾病之免疫應(yīng)答的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙粒病毒基因組，其中所述外源核糖核酸編碼HIVgp41、gpl20、gag或pol，丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，流感病毒血球凝集素或神經(jīng)氨酸酶，或者瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的沙粒病毒基因組，其中所述編碼糖蛋白(GP)的沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的沙粒病毒基因組，其中所述編碼糖蛋白(GP)的沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼來(lái)自感染性生物、腫瘤或變應(yīng)原的肽或蛋白質(zhì)抗原的外源核糖核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的沙粒病毒基因組，其中所述編碼糖蛋白(GP)的沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成選自短發(fā)夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)的外源核糖核酸序 列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的沙粒病毒基因組，其中所述沙粒病毒是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)。
8.包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述沙粒病毒基因組的載體。
9.權(quán)利要求8所述的載體，其中所述復(fù)制缺陷型沙粒病毒顆粒包含調(diào)節(jié)被所述沙粒病毒顆粒所感染的細(xì)胞中基因表達(dá)的另外的核酸序列。
10.權(quán)利要求8所述的載體，其中所述沙粒病毒基因組被進(jìn)一步修飾成: a.表達(dá)外源核糖核酸序列，其在沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子即S節(jié)段的5’UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR之中一個(gè)或更多個(gè)的控制下，和/或在可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III讀出的調(diào)控元件的控制下，編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或者適于調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，其中所述外源核糖核酸序列自身進(jìn)行表達(dá)或者通過(guò)與沙粒病毒蛋白質(zhì)開(kāi)放閱讀框融合而被通讀；以及任選地包含 b.一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，來(lái)增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)在被沙粒病毒載體感染的細(xì)胞中的表達(dá)。
11.回補(bǔ)細(xì)胞，其用于進(jìn)一步產(chǎn)生沙粒病毒顆粒的感染性后代顆粒， 其中所述回補(bǔ)細(xì)胞被改造成α)包含權(quán)利要求1的沙粒病毒基因組，和αυ表達(dá)已從權(quán)利要求1的沙粒病毒基因組中被除去或者在功能上失活的開(kāi)放閱讀框。
12.權(quán)利要求11所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中所述復(fù)制缺陷型沙粒病毒顆粒包含編碼目的蛋白質(zhì)或肽的另外的核酸序列。
13.權(quán)利要求11或12所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中所述復(fù)制缺陷型沙粒病毒顆粒包含調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的另外的核酸序列。
14.權(quán)利要求11至13所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中所述沙粒病毒的所述基因組被進(jìn)一步修飾成: a.表達(dá)外源核糖核酸序列，其在沙粒病毒的四個(gè)啟動(dòng)子即S節(jié)段的5’UTR和3’ UTR以及L節(jié)段的5’ UTR和3’ UTR之中一個(gè)或更多個(gè)的控制下，和/或在可被病毒RNA依賴(lài)性RNA聚合酶、細(xì)胞RNA聚合酶1、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III讀出的調(diào)控元件的控制下，編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或者適于調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，其中所述外源核糖核酸序列自身進(jìn)行表達(dá)或者通過(guò)與沙粒病毒蛋白質(zhì)開(kāi)放閱讀框融合而被通讀；以及任選地包含 b.一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，來(lái)增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)在被沙粒病毒載體感染的細(xì)胞中的表達(dá)。
15.權(quán)利要求11至13所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中編碼糖蛋白(GP)的所述復(fù)制缺陷型沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去或者在功能上失活。
16.權(quán)利要求11至13所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸序列。
17.權(quán)利要求11至13所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼來(lái)自感染性生物、腫瘤或變應(yīng)原的肽或蛋白質(zhì)抗原的外源核糖核酸序列。
18.權(quán)利要求11至13所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成選自短發(fā)夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)的外源核糖核酸序列。
19.權(quán)利要求11至18所述的回補(bǔ)細(xì)胞，其中所述沙粒病毒是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)。
20.用于產(chǎn)生復(fù)制缺陷型感染性沙粒病毒顆粒的方法，所述沙粒病毒顆粒能在被所述沙粒病毒顆粒感染的細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)其遺傳信息但不能在非回補(bǔ)細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生感染性后代顆粒，其中在所述沙粒病毒顆粒中，編碼來(lái)自所述沙粒病毒顆粒的所述基因組的糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白Z和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L的沙粒病毒四個(gè)開(kāi)放閱讀框中的一個(gè)或更多個(gè)被除去或者在功能上失活，其中所述方法包括: (a)對(duì)權(quán)利要求11的經(jīng)轉(zhuǎn)染的回補(bǔ)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；以及 (b)收獲包含所述沙粒病毒顆粒的培養(yǎng)物上清。
21.權(quán)利要求20的方法，其中編碼糖蛋白(GP)的所述復(fù)制缺陷型沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去或者在功能上失活。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼一種或更多種目的蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的外源核糖核酸序列。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成編碼 來(lái)自感染性生物、腫瘤或變應(yīng)原的肽或蛋白質(zhì)抗原的外源核糖核酸序列。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼糖蛋白(GP)的所述沙粒病毒開(kāi)放閱讀框被除去，并且替換成選自短發(fā)夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)的外源核糖核酸序列。
25.權(quán)利要求20-24所述的方法，其中所述沙粒病毒是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)。
26.權(quán)利要求2所述的沙粒病毒基因組，其中所述腫瘤疾病選自黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
27.權(quán)利要求2所述的沙粒病毒基因組，其中適用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對(duì)腫瘤疾病之免疫應(yīng)答的抗原選自HER2/neu (乳腺癌)、⑶2 (神經(jīng)母細(xì)胞瘤)、EGF_R (惡性膠質(zhì)瘤)、CEA (甲狀腺髓樣癌)、⑶52(白血病 )、MUC1 (在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá))、gp100蛋白、和MELAN-A/MARTl或者腫瘤抑制基因WTl的產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103993012SQ201410126161
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月27日
【發(fā)明者】丹尼爾·D·平舍韋爾, 盧卡斯·弗拉茨, 安德烈亞斯·貝格塔勒, 羅爾夫·青克納格爾 申請(qǐng)人:蘇黎士大學(xué)