順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法及其固定化酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法。該固定化方法通過(guò)將組氨酸標(biāo)簽與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶進(jìn)行融合表達(dá)，利用組氨酸咪唑基與親和層析介質(zhì)中的金屬離子Ni2+之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在親和層析介質(zhì)上的固定化；該固定化方法的酶活性收率高，所得固定化酶穩(wěn)定性好、催化效率高，并且省略了酶的分離純化步驟，操作簡(jiǎn)單。
【專利說(shuō)明】順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法及其固定化酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法，其固定化酶，以及基于該固定化酶生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著手性藥物在臨床上的不斷應(yīng)用，手性藥物的拆分技術(shù)也日趨完善。手性酒石酸作為一種重要的手性拆分劑，有著良好的市場(chǎng)前景及應(yīng)用價(jià)值。目前，在抗結(jié)核藥乙胺丁醇的生產(chǎn)過(guò)程中，L_(+)_酒石酸作為唯一的、不可替代的手性拆分劑已取得成功應(yīng)用。同時(shí)，以手性酒石酸為前體的一些酒石酸衍生物類藥物也已經(jīng)進(jìn)入臨床，如酒石酸美托洛爾片。此外，手性酒石酸也是重要的食品添加劑和化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、印染、電鍍、皮革等領(lǐng)域。
[0003]手性酒石酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)拆分法、糖質(zhì)發(fā)酵法和酶法合成四種。其中，酶法合成以石油化工產(chǎn)品馬來(lái)酸為初始原料，通過(guò)過(guò)氧化氫環(huán)氧化制成順式環(huán)氧琥珀酸鹽，然后在L-(+)_型或D-(-)_型順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(ESH)的作用下水解生成L_(+)_型或D-(-)_型酒石酸。自1974年日本學(xué)者佐藤英次等首次報(bào)道可采用酶法制備L-(+)_酒石酸以來(lái)，由于其轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于L-(+)_酒石酸的工業(yè)生產(chǎn)。
[0004]目前已報(bào)道的ESH生產(chǎn)菌種有:假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium validum)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、諾卡氏菌(Nocardia tartaricans)、紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)、無(wú)色桿菌(Achromobaeter sp.),其中棒狀桿菌和諾卡式菌是L-(+)-酒石酸的工業(yè)生產(chǎn)用菌種。由于游離細(xì)胞催化時(shí)ESH的表觀活性很低，導(dǎo)致了酶的催化效率很低。毛慶靜研究了N.tartaricans細(xì)胞膜通 透性對(duì)ESH表觀酶活的影響，結(jié)果表明，N.tartaricans細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后，ESH活性比完整細(xì)胞提高了 40倍以上，但是細(xì)胞破碎后內(nèi)源蛋白酶會(huì)影響ESH的穩(wěn)定性(華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，29 (3): 264-267)。Rosenberg等人研究了表面活性劑對(duì)ESH表觀酶活的影響,發(fā)現(xiàn)N.tartaricans細(xì)胞經(jīng)0.02%(w/v)脫氧膽酸鈉處理后,ESH表觀活性可提高 20 倍(Biotechnol.Lett, 1999，21:491-495)。
[0005]為了進(jìn)一步提高酶的催化效率及利用率，將細(xì)胞固定化技術(shù)引入了 L_(+)_酒石酸的生產(chǎn)過(guò)程。孫志浩等首次采用明膠包埋N.tartaricans,得到ESH活力較高的固定化細(xì)胞(生物工程學(xué)報(bào)，1995，11 (4): 372-376 )。張建國(guó)等以卡拉膠為載體固定化Corynebacterium sp.JZ-1菌株細(xì)胞，活化處理后ESH酶活力的總回收率在100%以上，且熱穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性均得以提高，1500L酶柱中連續(xù)運(yùn)行90d，ESH酶活基本保持不變(生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(2): 188-192)。Vikartovska 等將含 ESH 的 N.tartaricans ATCC31191細(xì)胞用果膠酸鈣微囊固定化，固定化后ESH的表觀酶活力為75.8~1^干細(xì)胞(41.^^Cells Blood Substit.1m mobil.Biotechnol, 2004，32 (I): 77-89)。之后，Budko等米用藻酸鈉-硫酸纖維素-聚乙烯(SA-CS/PMCG)微囊固定化N.tartaricans,研究發(fā)現(xiàn),此法可進(jìn)一步提高N.tartaricans ESH的表觀活性(91.5U/mg干細(xì)胞),縮短生物轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)效率(Enzyme Microb.Technol, 2005，36:118-126)。[0006]與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞有效克服了酶利用率低、催化效率低等缺陷，但仍無(wú)法徹底解除細(xì)胞膜的擴(kuò)散屏障作用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的固定化酶反應(yīng)器不僅可以解決細(xì)胞膜的擴(kuò)散限制效應(yīng)，還可以顯著提高酶的穩(wěn)定性和催化效率。崔球等將ESH基因和碳水化合物結(jié)合模塊CBM30融合表達(dá)，然后將ESH固定化在纖維素介質(zhì)上，提高了 ESH的穩(wěn)定性(CN102703419A)。但由于CBM模塊自身的序列和結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致了其對(duì)不同蛋白質(zhì)(或酶)分子的影響不同，因此適用性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提出一種酶活性收率高、穩(wěn)定性好的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法、其固定化酶以及基于該固定化酶生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]第一方面，本發(fā)明提供了一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法，該方法包括如下步驟:
[0010]( I)將順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的N末端或C末端與組氨酸標(biāo)簽連接，構(gòu)建二者的融合表達(dá)載體；
[0011](2)將步驟(1)所得融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌，獲得重組工程菌；
[0012](3)將步驟(2)所得重組工程菌進(jìn)行培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，得重組表達(dá)工程菌；
[0013](4)收集重組表達(dá)工程菌，并進(jìn)行菌體破碎，固液分離,收集上清液；
[0014](5)步驟(4)所得上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)進(jìn)行螯合反應(yīng)，即得固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶。
[0015]上述固定化方法中，作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述組氨酸標(biāo)簽由4~8個(gè)、優(yōu)選為6個(gè)組氨酸組成；
[0016]在具體實(shí)施方案中，所述組氨酸標(biāo)簽由4、5、6、7或8個(gè)組氨酸組成。
[0017]優(yōu)選地，所述融合表達(dá)載體的基礎(chǔ)載體為溫度誘導(dǎo)型的pBV220載體。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(2)所述工程菌為大腸桿菌E.coli。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述培養(yǎng)為將重組工程菌于30~37°C下、優(yōu)選35~37°C下、更優(yōu)選37°C下培養(yǎng)至0D600為0.6~1.0、優(yōu)選為0.7~0.9、更優(yōu)選為0.8 ；
[0020]在具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)為將重組工程菌于30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C或 37°C下培養(yǎng)，至 0D600 為 0.6,0.7,0.8,0.9 或 1.0。
[0021]優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)表達(dá)為:將培養(yǎng)溫度升至40~42°C、優(yōu)選42°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)4~6h,優(yōu)選為5h。
[0022]在具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)表達(dá)為:將培養(yǎng)溫度升至40°C、40.5°C、41°C、41.5°C或 42°C，誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h、5h 或 6h。
[0023]作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述菌體破碎采用高壓細(xì)胞破碎、超聲波破碎或溶菌酶破碎中的任意一種，優(yōu)選米用超聲波破碎；
[0024]優(yōu)選地，在所述菌體破碎前，用磷酸鹽緩沖液洗滌所述菌體；進(jìn)一步優(yōu)選地所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM ；
[0025]優(yōu)選地，所述固液分離通過(guò)離心進(jìn)行；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心條件為:2~8°C、優(yōu)選4°C下，以8，000~12，000g、優(yōu)選10，OOOg的轉(zhuǎn)速離心15~30min，優(yōu)選20min。
[0026]作為優(yōu)選，步驟(5)中，所述Ni2+螯合層析介質(zhì)的固相載體為瓊脂糖、葡聚糖或者纖維素中的任意一種，優(yōu)選的是瓊脂糖微球固相載體；
[0027]優(yōu)選地，在所述上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)前，所述Ni2+螯合層析介質(zhì)先用含
0.08~0.12M、優(yōu)0.1M NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM ；
[0028]在具體實(shí)施方案中，NaCl在磷酸鹽緩沖液中的含量為0.08M、0.09M、0.1M、0.1lM或0.12M;所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，濃度為18mM、19mM、20mM、21mM 或 22mM。
[0029]優(yōu)選地，在所述上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)后，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM。
[0030]在具體實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2,7.3,7.4、7.5或7.6，其濃度為18mM、19mM、20mM、21mM 或 22mM。
[0031]所述上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)時(shí)，上清液中融合表達(dá)蛋白(順式環(huán)氧琥珀酸水解酶與組氨酸的)中的組氨酸的咪唑基與金屬離子Ni2+相互作用，從而將含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的融合表達(dá)蛋白固定 在親和層析介質(zhì)上。
[0032]上述固定化方法既可用于L-型順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化，又可用于D-型順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化。
[0033]第二方面，本發(fā)明提供了一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，由本發(fā)明第一方面所述制備方法制得。
[0034]第三方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法，該方法為:順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽在第二方面所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的作用下發(fā)生酶解反應(yīng)而得;
[0035]優(yōu)選地，所述酶解反應(yīng)的溫度為30~40°C、優(yōu)選為32~38°C、更優(yōu)選為37°C ；
[0036]優(yōu)選地，所述酶解反應(yīng)的pH值為7~9、優(yōu)選為8 ；
[0037]優(yōu)選地，所述手性酒石酸鹽為手性酒石酸鈉、手性酒石酸鉀、手性酒石酸鉀鈉或手性酒石酸氫鉀；
[0038]優(yōu)選地，所述手性酒石酸或其鹽為L(zhǎng)型或D型。
[0039]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法為:將所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶裝填層析柱；然后將pH為7~9、優(yōu)選為8的順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的水溶液上樣至所述層析柱進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)期間將層析柱的溫度控制在30~40°C、優(yōu)選32~38°C、更優(yōu)選37°C ;最后收集反應(yīng)液即得。
[0040]在具體的實(shí)施方案中，采用蠕動(dòng)泵或AKTA進(jìn)行上樣，在上樣過(guò)程中，調(diào)整上樣速率以使反應(yīng)充分進(jìn)行；優(yōu)選地，將上樣速率控制在0.5~lBV/min、更優(yōu)選為lBV/min。當(dāng)?shù)孜镙斔退俾蕿閘BV/min時(shí)，酶解反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 99.5%以上。
[0041]在具體的實(shí)施方案中，所述層析柱的溫度用循環(huán)水浴鍋控制。
[0042]上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的水溶液的濃度為0.8~1.6M、優(yōu)選為1.0~1.4M、更優(yōu)選為1.2M。
[0043]上述生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法中，當(dāng)所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶為L(zhǎng)型時(shí)，所生產(chǎn)的酒石酸或其鹽為L(zhǎng)-(+)_酒石酸或其鹽；當(dāng)所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶為D型時(shí)，所生產(chǎn)的酒石酸或其鹽為D-(-)_酒石酸或其鹽。
[0044]本發(fā)明通過(guò)將組氨酸標(biāo)簽與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶進(jìn)行融合表達(dá)，利用組氨酸咪唑基與親和層析介質(zhì)中的金屬離子Ni2+之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在親和層析介質(zhì)上的固定化；該固定化方法的酶活性收率高，所得固定化酶穩(wěn)定性好、催化效率高(底物轉(zhuǎn)化率達(dá)99.5%以上)，并且省略了酶的分離純化步驟，操作簡(jiǎn)單。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1是本發(fā)明固定化ESH與游離ESH的熱穩(wěn)定性比較；其中，“ ●”表示本發(fā)明固定化ESH，“〇”表示游離ESH。
[0046]圖2是本發(fā)明固定化ESH與游離ESH的pH穩(wěn)定性比較；其中，“●”表示本發(fā)明固定化ESH，“〇”表示游離ESH。
[0047]圖3是本發(fā)明固定化ESH與游離ESH的儲(chǔ)存穩(wěn)定性比較；其中，“●”表示本發(fā)明固定化ESH，“〇”表示游離ESH。
[0048]圖4是使用本發(fā)明固定化ESH制備手性酒石酸鈉的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0050]實(shí)施例1本發(fā)明L-型順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的親和固定化
[0051]采用如下步驟:
[0052]( 1)在編碼L-型順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的C端引入6個(gè)組氨酸的組氨酸標(biāo)簽序列，以溫度誘導(dǎo)型的PBV220載體為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建融合表達(dá)載體；
[0053](2)在平板上挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的單菌落，接入5mL含100 μ L/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，于37°C，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)；
[0054](3)取上述菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的含100 μ L/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(4%接種量)，于37°C，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)0D600達(dá)到0.8±0.1時(shí)，將溫度升至42°C，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后，在4°C，8000 Xg條件下離心收集菌體；
[0055](4)用pH為7.4的20mM磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，去除殘留的培養(yǎng)基組分。用pH為7.4的20mM磷酸鹽緩沖液重懸菌體，配成20%的菌懸液，用超聲波破碎儀破碎菌體細(xì)胞，破碎后在4°C，1000OXg條件下離心20min，收集上清液，得到粗酶液。
[0056](5)將粗酶液適當(dāng)稀釋使其蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL。將裝填于層析柱的瓊脂糖金屬螯合介質(zhì)，用含0.1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)平衡好。將粗酶液上樣至該層析柱，直至介質(zhì)吸附飽和為止。然后用pH為7.4的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)一步淋洗，去除非特異性吸附蛋白，得到固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶。
[0057]實(shí)施例2本發(fā)明的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的穩(wěn)定性研究
[0058]以實(shí)施例1所制備的固定化ESH為穩(wěn)定性研究對(duì)象，按如下方法分別進(jìn)行熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性的研究。[0059](I)熱穩(wěn)定性:將固定化ESH置于不同的溫度條件下(45~60°C),每隔5min測(cè)定其殘留的ESH酶活力，直至其活力降至一半為止，測(cè)定其半衰期，同時(shí)用游離ESH作為對(duì)照。
[0060]結(jié)果表明，固定化ESH的熱穩(wěn)定性得到了很大程度的改善，增強(qiáng)了 ESH對(duì)反應(yīng)體系微環(huán)境的抗逆能力。如圖l所示，固定化ESH在45°C、5(rC、55°C和6(rC條件下的活力半衰期分別較游離ESH提高了 2.86,3.75,5.40和7.00倍。
[0061]崔球等通過(guò)融合表達(dá)CBM30碳水化合物結(jié)合模塊制備了一種纖維素固定化ESH，并研究了其在30~40°C條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，纖維素固定化ESH在40°C條件下的半衰期為81.53min，而同等條件下游離ESH的半衰期則僅為26.55min (CN102703419A)。本發(fā)明制備的瓊脂糖固定化ESH在40°C及以下具有良好的穩(wěn)定性，其半衰期大于4h，且當(dāng)溫度達(dá)到45°C時(shí)，其半衰期仍可達(dá)50min以上。
[0062]⑵pH穩(wěn)定性:將固定化ESH置于不同的pH條件下(pH3.0~10.0),每隔5min測(cè)定其殘留的ESH酶活力，直至其活力降至一半為止，測(cè)定其半衰期，同時(shí)用游離ESH作為對(duì)照。
[0063]結(jié)果如圖2所示，固定化ESH在ρΗΙΟ.0、9.5、6.0和5.5條件下，穩(wěn)定性較游離ESH分別提高了 3.62,3.24,3.75 和 4.80 倍。
[0064](3)儲(chǔ)存穩(wěn)定性:將固定化ESH置于pH7.5及室溫(25°C)條件下，每隔一定時(shí)間測(cè)定其殘留的ESH酶活力，直至其活力降至一半為止，分析其酶活的自然衰減周期，同時(shí)用游離ESH作為對(duì)照。
[0065]結(jié)果如圖3所示，固定化ESH的儲(chǔ)存穩(wěn)定性得到了很好的改善，較游離ESH提高了
11.6倍，酶活力的半衰期達(dá)到了 50天以上。
[0066]實(shí)施例3使用本發(fā)明固定化酶生產(chǎn)手性酒石酸鈉
[0067]用AKTA將pH為8.0，濃度為1.2M的底物順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液上樣至固定化酶層析柱，同時(shí)控制反應(yīng)溫度為37°C，使底物流經(jīng)固定化酶反應(yīng)柱，其生產(chǎn)流程示意圖如圖4所示。
[0068]當(dāng)?shù)孜镙斔退俾蕿閘BV/min時(shí)，底物順式環(huán)氧琥珀酸鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 99.5%以上，而專利文獻(xiàn)CN102703419A公開(kāi)的纖維素固定化ESH轉(zhuǎn)化制備手性酒石酸時(shí)，其底物轉(zhuǎn)化率僅為75%。
[0069] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法、其固定化酶及其用于生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技 術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的固定化方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的N末端或C末端與組氨酸標(biāo)簽連接，構(gòu)建二者的融合表達(dá)載體； (2)將步驟(1)所得融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌，獲得重組工程菌； (3)將步驟(2)所得重組工程菌進(jìn)行培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，得重組表達(dá)工程菌； (4)收集重組表達(dá)工程菌，并進(jìn)行菌體破碎，固液分離，收集上清液； (5)步驟(4)所得上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)進(jìn)行螯合反應(yīng)，即得固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述組氨酸標(biāo)簽由4~8個(gè)、優(yōu)選為6個(gè)組氨酸組成； 優(yōu)選地，所述融合表達(dá)載體的基礎(chǔ)載體為溫度誘導(dǎo)型的PBV220載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述工程菌為大腸桿菌 E.coliο
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述培養(yǎng)為將重組工程菌于30~37°C下、優(yōu)選35~37°C下、更優(yōu)選37°C下培養(yǎng)至0D600為0.6~1.0、優(yōu)選為0.7~0.9、更優(yōu)選為0.8 ； 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)表達(dá)為:將培養(yǎng)溫`度升至40~42°C、優(yōu)選42°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)4~6h，優(yōu)選為5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的固定化方法，其特征在于，步驟(4)中，所述菌體破碎采用高壓細(xì)胞破碎、超聲波破碎或溶菌酶破碎中的任意一種，優(yōu)選采用超聲波破碎； 優(yōu)選地，在所述菌體破碎前，用磷酸鹽緩沖液洗滌所述菌體；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM ； 優(yōu)選地，所述固液分離通過(guò)離心進(jìn)行；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心條件為:2~8°C、優(yōu)選4°C下，以8，000~12，000g、優(yōu)選10，OOOg的轉(zhuǎn)速離心15~30min，優(yōu)選20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的固定化方法，其特征在于，步驟(5)中，所述Ni2+螯合層析介質(zhì)的固相載體為瓊脂糖、葡聚糖或者纖維素中的任意一種，優(yōu)選的是瓊脂糖微球固相載體； 優(yōu)選地，在所述上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)前，所述Ni2+螯合層析介質(zhì)先用含0.08~0.12M、優(yōu)0.1M NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM ； 優(yōu)選地，在所述上清液經(jīng)過(guò)Ni2+螯合層析介質(zhì)后，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.6、優(yōu)選為7.4，濃度為18~22mM、優(yōu)選20mM。
7.一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，其特征在于，由權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述制備方法制得。
8.—種生產(chǎn)手性酒石酸或其鹽的方法，其特征在于，順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽在權(quán)利要求7所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的作用下發(fā)生酶解反應(yīng)而得； 優(yōu)選地，所述酶解反應(yīng)的溫度為30~40°C、優(yōu)選為32~38°C、更優(yōu)選為37°C ； 優(yōu)選地，所述酶解反應(yīng)的pH值為7~9、優(yōu)選為8 ； 優(yōu)選地，所述手性酒石酸鹽為手性酒石酸鈉、手性酒石酸鉀、手性酒石酸鉀鈉或手性酒石酸氫鉀； 優(yōu)選地，所述手性酒石酸或其鹽為L(zhǎng)型或D型。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將所述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶裝填層析柱；然后將PH為7~9、優(yōu)選為8的順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的水溶液上樣至所述層析柱進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)期間將層析柱的溫度控制在30~40°C、優(yōu)選32~38°C、更優(yōu)選37°C ；最后收集反應(yīng)液即得。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的水溶液的濃度為0.8 ~1.6M、優(yōu)選為1.0~1.4M、更優(yōu)選為1.2M。
【文檔編號(hào)】C12N9/14GK103882000SQ201410098975
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】王云山, 王自強(qiáng), 李彥良, 蘇志國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所