植物細(xì)胞堆疊的產(chǎn)生和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料的產(chǎn)生和培養(yǎng)，及其積累或收獲所期望的產(chǎn)物的用途。特別地，本發(fā)明提供去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的、非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料的產(chǎn)生方法，和所述細(xì)胞堆疊的后續(xù)維持方法，該方法包括下述步驟：(i)通過從植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中分離細(xì)胞而提供細(xì)胞堆疊，其中，使細(xì)胞堆疊所包含的液體的含量降低并調(diào)整為相當(dāng)于0.1g～0.9g濕細(xì)胞重量/cm3的細(xì)胞堆疊密度，從而建立所述細(xì)胞堆疊的去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，以及(ii)將所述去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞堆疊在非液體環(huán)境中以50～100％的相對濕度進(jìn)行培養(yǎng)。
【專利說明】植物細(xì)胞堆疊的產(chǎn)生和培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。特別地，本發(fā)明涉及非組織多層細(xì)胞堆疊形式的 植物細(xì)胞材料的產(chǎn)生和培養(yǎng)，及其積累或收獲所期望的產(chǎn)物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的十年里，一直致力于建立和培養(yǎng)用于積累和收獲天然或異源蛋白質(zhì)和次 生代謝物的以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。文獻(xiàn)提供了大量的證據(jù)材料，證明利用以植物為基礎(chǔ)的 系統(tǒng)產(chǎn)生各種所期望的物質(zhì)，該所期望的物質(zhì)或是被分泌到培養(yǎng)基中，或是從生產(chǎn)的細(xì)胞、 組織、細(xì)胞器、甚至整個(gè)植物或植物的一部分中被分離出來。同樣存在大量的轉(zhuǎn)化方案，以 確保建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的植物材料。然而，仍需要可靠、相對合算且快速的技術(shù)以從 植物細(xì)胞高收率地獲得所期望的產(chǎn)物。
[0003] 因此，本發(fā)明提供一種以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，以產(chǎn)生高水平的所期望的天然或重 組產(chǎn)物，該系統(tǒng)利用來自植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞并克服了現(xiàn)有技術(shù)中的問題，特別是 對于培養(yǎng)和后續(xù)處理中處理大量培養(yǎng)基的需要，該系統(tǒng)包括產(chǎn)品的去除、提取和純化。
[0004] 相應(yīng)地，本發(fā)明涉及天然或重組蛋白質(zhì)和代謝物的表達(dá)或產(chǎn)生，并且使用由通常 建立的植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物作為生產(chǎn)宿主而得到的特定植物細(xì)胞材料。
[0005] 與目前使用和開發(fā)的以使用完整植物或至少完整的分化植物組織為基礎(chǔ)的眾多 系統(tǒng)不同，利用懸浮細(xì)胞具有能夠在可控（controlled)、無菌的受控（contained)條件下 可重復(fù)地產(chǎn)生均質(zhì)材料的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 目前，在植物中表達(dá)重組蛋白有兩種主要的策略，即，（i)生產(chǎn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物 或懸浮細(xì)胞株，或（ii)在用細(xì)菌（例如農(nóng)桿菌）、病毒（例如煙草花葉病毒、馬鈴薯病毒X/ Y、5[豆花葉病毒等等）或二者組合（例如侵染（magnifection))感染植物表達(dá)宿主（植物、 組織或細(xì)胞）使宿主能夠表達(dá)異源遺傳信息（DNA或RNA)后，瞬時(shí)表達(dá)異源基因。
[0007] 雖然本發(fā)明也包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞材料的用途，但是用于瞬時(shí)表達(dá)的系統(tǒng)具 有速度優(yōu)勢（基因到產(chǎn)品、搶占市場、緊急應(yīng)對）以及有可能達(dá)到比通常穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因 植物或其部分（如細(xì)胞）能夠獲得的高得多的積累水平。
[0008] 根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明結(jié)合了植物懸浮培養(yǎng)物的固有優(yōu)點(diǎn)和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的 優(yōu)點(diǎn)。
[0009] 已經(jīng)嘗試并公開了將農(nóng)桿菌加入到植物懸浮培養(yǎng)物中，接著在懸浮物中進(jìn)一步培 養(yǎng)植物細(xì)胞和細(xì)菌的方案（參見US 6740526B1)，但所述方法的轉(zhuǎn)化效率低。此外，除非采 取有效的措施，例如使用抗生素殺滅細(xì)菌或使用營養(yǎng)缺陷型菌株抑制生長，農(nóng)桿菌會(huì)迅速 地長得超過植物懸浮細(xì)胞。其他人描述了共培養(yǎng)的細(xì)菌對植物懸浮細(xì)胞的直接有害作用 (細(xì)胞死亡，過敏性反應(yīng)）。結(jié)果，目前尚不存在以植物為基礎(chǔ)的生產(chǎn)系統(tǒng)，其結(jié)合完整植物 或組織的瞬時(shí)農(nóng)桿菌滲入/病毒感染的效率和植物懸浮培養(yǎng)物的優(yōu)點(diǎn)，使得能夠優(yōu)選在無 菌可控條件下生產(chǎn)均質(zhì)的生物質(zhì)，這是建立符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)的巨大優(yōu)勢。如上所述，US 6740526B1中公開的共同發(fā)酵方法存在轉(zhuǎn)化效率低和伴隨細(xì)菌過度生長的問題，盡管以葉 為基礎(chǔ)的系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化效率，但是，在擴(kuò)大規(guī)模方面遭遇問題，存在初始生物質(zhì)生產(chǎn)的時(shí) 空產(chǎn)率低、且依賴于在可控但并非無菌的條件下生產(chǎn)植物生物質(zhì)的問題。與微生物系統(tǒng)相 比生產(chǎn)成本高是這些系統(tǒng)沒有得到廣泛關(guān)注和作為生物制品的生產(chǎn)系統(tǒng)使用的主要原因。 因此，研究和開發(fā)著眼于速度和生產(chǎn)魯棒性（production robustness)的綜合優(yōu)勢是很重 要的更專業(yè)應(yīng)用，即緊急應(yīng)對（如流感疫苗，新出現(xiàn)的疾病，個(gè)體化用藥等）。本發(fā)明處理并 解決了這些問題，并且提供用于操縱任何指定植物宿主材料的遺傳背景的改進(jìn)手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 根據(jù)本發(fā)明，提供用于去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植 物細(xì)胞材料的產(chǎn)生以及所述細(xì)胞堆疊的后續(xù)維持的方法，該方法包括下述步驟：（i)通過 從植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中分離細(xì)胞而提供具有多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞堆疊，其中，使細(xì)胞堆疊所 包含的液體的含量降低并調(diào)整為相當(dāng)于〇. lg?〇. 9g濕細(xì)胞重量/cm3、優(yōu)選0. 2g?0. 85g 濕細(xì)胞重量/cm3、更優(yōu)選0. 4g?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3的細(xì)胞堆疊密度，從而建立所述細(xì)胞 堆疊的去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的性質(zhì)；以及（ii)在提供足夠的濕度（例如50?100% 的相對濕度）以防植物材料嚴(yán)重脫水的同時(shí)，在非液體環(huán)境中于維持或恢復(fù)所述細(xì)胞堆疊 的多孔結(jié)構(gòu)的條件下培育或培養(yǎng)所述去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞堆疊。
[0011] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，組織內(nèi)的細(xì)胞通常緊密相連，通常分化并經(jīng)常呈現(xiàn)出特定 形態(tài)和極性的細(xì)胞。此外，組織內(nèi)的細(xì)胞通常具有相對于彼此的特征定位。
[0012] 相反，本發(fā)明的細(xì)胞堆疊是由植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物 的特有性能是單個(gè)細(xì)胞或一些細(xì)胞的聚集體相對于彼此移動(dòng)或可移動(dòng)，并沒有表現(xiàn)出更高 的組織水平。
[0013] 因此，本發(fā)明的細(xì)胞堆疊包括彼此間沒有特定的相對定位的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞簇。 這些細(xì)胞按所得集合體堆疊成具有大量氣隙的三維多孔結(jié)構(gòu)的方式鑄型（cast)。在細(xì)胞堆 疊密度和氣隙存在之間有明顯的相關(guān)性。氣隙因?yàn)橐韵聨讉€(gè)原因而非常重要。首先，能夠 進(jìn)行有效率的氣體交換，從而可以容易地將足夠量的氧氣提供給細(xì)胞。其次，氣隙可以暫時(shí) 性且容易地再次被液體（處理）充滿。這種暫時(shí)的處理可用于使各種試劑與細(xì)胞堆疊的所 有細(xì)胞緊密接觸，從而提供有效率的遺傳轉(zhuǎn)化方法、生物轉(zhuǎn)化方法、通過洗脫或清洗細(xì)胞堆 疊而回收產(chǎn)物的方法，以及為診斷目的利用底物或分解物（例如以細(xì)胞堆疊為基礎(chǔ)的免疫 測定）。重要的是這些處理都只是暫時(shí)的，以及重新構(gòu)筑細(xì)胞堆疊的多孔結(jié)構(gòu)，并確定細(xì)胞 堆疊的密度以確保在后續(xù)培育步驟中的高生存能力。由于細(xì)胞堆疊的多孔性，在某些應(yīng)用 中更重要的是濕度足夠高，以防止細(xì)胞堆疊因?yàn)樵诩?xì)胞/氣隙的界面與氣相接觸的表面積 大而變干。
[0014] 特別是本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施例包括（i)第一培養(yǎng)步驟，優(yōu)選在受控和/或無 菌的條件下，對植物細(xì)胞懸浮物進(jìn)行培養(yǎng)，以提供均勻的植物生物質(zhì)，（ii)分離步驟，將液 體培養(yǎng)基從植物細(xì)胞中分離出來，生成密度在0. 1?〇.9g濕細(xì)胞重量/cm3之間、優(yōu)選在 0. 2?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3之間、最優(yōu)選在0. 4?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3之間的多孔細(xì)胞 堆疊，以及（iii)第二培養(yǎng)步驟，在非液體環(huán)境中受控條件下將細(xì)胞堆疊進(jìn)一步再培育（見 上文）至少一天。根據(jù)實(shí)際情況和實(shí)際操作者的意圖，可以將第二培養(yǎng)步驟進(jìn)行幾天。第 二培養(yǎng)步驟通常進(jìn)行2?7天，優(yōu)選3?5天。
[0015] 在當(dāng)前最先進(jìn)的所有培養(yǎng)方法中，植物細(xì)胞材料都是連續(xù)不斷地（亦即大部分時(shí) 間）與含有培養(yǎng)基的營養(yǎng)物直接或間接（多孔載體或膜介導(dǎo)）接觸。連續(xù)的培養(yǎng)基接觸僅 在細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)基時(shí)才會(huì)短暫（即短時(shí)間）地中斷?？梢詫?xì)胞進(jìn) 行過濾或清洗以移除"舊的"培養(yǎng)基，但隨后迅速轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，培養(yǎng)步驟是在保持細(xì)胞的生存能力、并以降低的或最小的細(xì)胞 生長和分裂促進(jìn)產(chǎn)物積累的條件下進(jìn)行的。通過在潮濕的環(huán)境中、優(yōu)選不接觸成分或營養(yǎng) 物從其中擴(kuò)散到細(xì)胞堆疊的液體或凝膠化的生長培養(yǎng)基地培育良好地通氣的堆疊細(xì)胞而 實(shí)現(xiàn)的（US2002/092037A1，W02005/103271A1)。在現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞薄層被鋪板或點(diǎn)樣在 放置于培養(yǎng)基中的支持（supportive)膜以給細(xì)胞提供營養(yǎng)物。然而，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)胞層具有因?yàn)樾枰佑|該培養(yǎng)基，所以只有少量的生物質(zhì)能夠被處理的缺點(diǎn)。與此相反， 本發(fā)明的細(xì)胞堆疊方法不依賴于支持培養(yǎng)基，是可擴(kuò)展的，因此適合于工業(yè)應(yīng)用。因此，上 述培育或培養(yǎng)步驟（ii)在非液體環(huán)境中進(jìn)行，優(yōu)選不將去除了培養(yǎng)基的多孔結(jié)構(gòu)細(xì)胞堆 疊置于（液體或凝膠固化的）維持或生長培養(yǎng)基或與之有任何接觸。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施例，第二培養(yǎng)步驟進(jìn)行數(shù)周或數(shù)月。在這樣的情況下， 可能必須調(diào)整培養(yǎng)條件以維持細(xì)胞的生存能力?？梢酝ㄟ^例如短暫地（即，至多3小時(shí)、優(yōu) 選至多1小時(shí)的一段時(shí)間）給細(xì)胞堆疊提供營養(yǎng)物質(zhì)和/或降低培育溫度而實(shí)現(xiàn)。
[0018] 在現(xiàn)有技術(shù)中，懸浮培養(yǎng)物用于積累所期望的產(chǎn)物，該所期望的產(chǎn)物保留在由培 養(yǎng)物組成的細(xì)胞內(nèi)或被分泌到培養(yǎng)基中。當(dāng)生產(chǎn)周期結(jié)束后，細(xì)胞被破壞以收獲積累的產(chǎn) 物或被丟棄。懸浮物（例如浸沒在液體培養(yǎng)基）中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞已被用于生產(chǎn)廣 泛的不同的治療性重組蛋白（S.Hellwig等，"用于生產(chǎn)重組蛋白的植物細(xì)胞培養(yǎng)物"，自然 生物技術(shù) 22 :1415 ?1422, 2004 年（S.Hellwig et al·，"Plant cell cultures for the production of recombinant proteins"，Nature Biotechnol22:1415-1422,2004))〇
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，包含懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞被用于產(chǎn)生由具有上述特定密度進(jìn)一步限定 的多孔結(jié)構(gòu)細(xì)胞堆疊形式的培養(yǎng)基被去除的非組織植物細(xì)胞材料?？扇芜x地以使用者定義 的形狀來提供的細(xì)胞堆疊可被看作是由已經(jīng)生長在液體培養(yǎng)基中的未分化的植物細(xì)胞構(gòu) 成的人工生成的多層細(xì)胞集合體或細(xì)胞餅。源細(xì)胞可以是能夠積累所期望的產(chǎn)物的、穩(wěn)定 和/或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、突變細(xì)胞或野生型（原生）細(xì)胞。通過在移除大部分周圍 的液體培養(yǎng)基的同時(shí)，將細(xì)胞懸浮物鑄型成細(xì)胞堆疊結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生三維多孔植物細(xì)胞材料。雖 然優(yōu)選通過過濾器的真空過濾、壓濾、離心分離之類過濾技術(shù)，但是只要確保上述細(xì)胞堆疊 密度，就也可以通過本領(lǐng)域已知的其他方式（例如，在食品工業(yè)中使用的分離器，連續(xù)離心 分離）移除液體培養(yǎng)基。建立、維持和/或重建細(xì)胞堆疊所包含的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇之間 的氣隙提供了確保良好通氣（氣體交換）的細(xì)胞堆疊的多孔結(jié)構(gòu)，對堆疊的植物細(xì)胞材料 在第二培養(yǎng)階段的生存能力和生產(chǎn)率來說，這是關(guān)鍵因素。在本發(fā)明的上下文中，該培養(yǎng)條 件不包括在固化（凝膠化）或液體的培養(yǎng)基中、在懸浮物中或與可能妨礙上述必需的通氣 的任何液體環(huán)境接觸的下培養(yǎng)細(xì)胞堆疊。因?yàn)樗雠囵B(yǎng)實(shí)質(zhì)上是在沒有任何包圍所述細(xì)胞 堆疊所包含的每個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基或液體的條件下進(jìn)行的，所以必須確保足夠的相對濕度。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，細(xì)胞堆疊的密度（g濕細(xì)胞重量/cm 3)、液體含量與通氣（由足夠 量和足夠體積的氣隙的結(jié)構(gòu)決定）之間存在嚴(yán)格的相關(guān)性。然而，如將在下面更詳細(xì)地解 釋，通氣的細(xì)胞堆疊可（暫時(shí)地）通過與小體積的轉(zhuǎn)化載體或物質(zhì)、包括但不限于營養(yǎng)物、 底物、激素、酶、代謝物和前體接觸而處理。在上下文中，"暫時(shí)地"意味著，在長期（即數(shù)周 或數(shù)月）培育過程中包括提供營養(yǎng)物質(zhì)的處理僅在短期內(nèi)（最多3小時(shí)，優(yōu)選最多1小時(shí)） 進(jìn)行，隨后再次撤掉該液體培養(yǎng)基并重建多孔細(xì)胞堆疊的氣隙，得到本文所定義的細(xì)胞堆 疊密度。
[0020] 因此，根據(jù)本發(fā)明的方法任選包括在分別包括或代表生物體、化學(xué)物質(zhì)和/或生 物物質(zhì)或分子的氣體、蒸汽、薄霧、粉塵和/或氣霧劑等的存在下培養(yǎng)細(xì)胞堆疊，。
[0021] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，包含細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞是原生（例如野生型）細(xì)胞或 者非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，在進(jìn)行第二培養(yǎng)步驟之前，該細(xì)胞與至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體 包含至少一種異源核酸序列，該異源核酸序列優(yōu)選被可操作地連接到功能性啟動(dòng)子，其中， 所述至少一種異源核酸序列對在本發(fā)明方法的步驟（ii)中積累和收獲的所期望的產(chǎn)物進(jìn) 行編碼。
[0022] 本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指將任何核酸或核酸類似物傳遞到植物細(xì)胞中。在轉(zhuǎn) 化后，核酸可以穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中?；蛘?，被傳遞的核酸可以不被整合到基 因組中，并可以對細(xì)胞溶質(zhì)或細(xì)胞核或任何細(xì)胞器發(fā)揮其作用。
[0023] 核酸可以是自主復(fù)制要素（element)，諸如類病毒、病毒或解構(gòu)病毒，或者由一個(gè) 以上病毒得到的必需要素組合。或者，傳遞的核酸可以僅是自主復(fù)制要素、諸如類病毒，病 毒或解構(gòu)病毒的一個(gè)組成部分。其他組成部分可以由宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞提供/補(bǔ) 充。
[0024] 本文所用的術(shù)語"異源"是指所討論的核苷酸的基因/序列已通過基因工程被引 入到植物細(xì)胞中。異源基因可以增強(qiáng)內(nèi)源性等效基因、即通常發(fā)揮相同或類似功能的基因 向目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，或插入的序列可以對內(nèi)源基因或其他序列進(jìn)行補(bǔ)充。另一種可能性 得到被放置在天然存在該核酸序列或其同源物的培養(yǎng)靶細(xì)胞內(nèi)的核酸序列，在其中核酸序 列被連接和/或鄰接到不會(huì)在細(xì)胞或者該類型或物種或品種的植物的細(xì)胞內(nèi)自然產(chǎn)生的 核酸以控制表達(dá)，如可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子序列。另一種可能性是 得到通過反義和/或沉默（作為要實(shí)現(xiàn)的結(jié)果的所期望的產(chǎn)物）誘導(dǎo)現(xiàn)有基因沉默的核酸 序列。另一種可能性得到具有調(diào)節(jié)功能的核酸，如miRNA(期望的產(chǎn)物）。另一種可能性是 得到為核酶或適體（所期望的產(chǎn)品）的核酸。
[0025] "載體"被定義為包括雙鏈或單鏈線型或環(huán)型的任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載 體及其他，它們能或不能自我傳播或移動(dòng)，可以轉(zhuǎn)化原核或真核宿主，并存在于染色體外 (如帶復(fù)制原點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒）。
[0026] "表達(dá)載體"是指核酸處于控制之下并且被可操作地連接于用以轉(zhuǎn)錄到宿主細(xì)胞 (例如微生物或植物細(xì)胞）中的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件的載體。載體可以是在多個(gè) 宿主中發(fā)揮功能的雙功能表達(dá)載體。在基因組或亞基因組DNA的情況下，可能包含它自己 的啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件，在cDNA的情況下，可以處于用以在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的適當(dāng)?shù)?啟動(dòng)子或其他調(diào)控元件的控制之下。"可操作地連接"是指作為同一核酸分子的一部分加 入、適當(dāng)?shù)囟ㄎ缓投ㄏ?，以使轉(zhuǎn)錄從啟動(dòng)子開始。
[0027] "生物載體"是能夠轉(zhuǎn)化植物宿主細(xì)胞、即能夠?qū)⒑怂醾鬟f進(jìn)植物細(xì)胞的任何微生 物或病毒。"生物載體"的例子是感染性微生物（例如屬于放射形農(nóng)桿菌和根瘤菌的微生 物）或病毒（例如煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒和豇豆花葉病毒）。更具體地，農(nóng)桿菌是"生 物載體"。
[0028] 對于細(xì)胞轉(zhuǎn)化，將生物載體的懸浮物或含有遺傳信息的不同的生物載體的混合物 施加到如上文所述地產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊中。該載體感染植物細(xì)胞，并傳遞遺傳信息。由于細(xì) 胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料的海綿結(jié)構(gòu)，載體僅通過毛細(xì)管力即可進(jìn)入各個(gè)靶細(xì)胞，無需 必須將細(xì)胞送達(dá)所需的完整葉片或植物的注射或真空浸潤之類特別的處理。而且，該細(xì)胞 堆疊的松散多孔結(jié)構(gòu)可獲得載體能夠進(jìn)入的大表面積，因此可實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化效率。這一點(diǎn)不 同于細(xì)胞具有更緊密的細(xì)胞間接觸而限制載體接觸細(xì)胞表面、導(dǎo)致較低的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物 積累的愈傷組織材料和分化的植物組織。通常情況下，細(xì)胞堆疊內(nèi)的50%以上的細(xì)胞被轉(zhuǎn) 化，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)。雖然U.S. Pat. 6, 740, 526 B1中沒有報(bào)道詳細(xì)的轉(zhuǎn)化效率數(shù)據(jù)，但是 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該專利所公開的方法比本發(fā)明的細(xì)胞堆疊方法差（例如參見實(shí)施例1，圖6C，6D)。 這一發(fā)現(xiàn)還可以被能獲得10?100倍的抗體產(chǎn)量這一觀察結(jié)果支持（參見例如實(shí)施例1)。 該載體懸浮物可以容易地應(yīng)用，例如通過簡單的滴加或噴霧。然而，更大和/或更厚的細(xì)胞 堆疊和某些使用者定義形狀可能需要真空或壓力輔助應(yīng)用并移除生物載體懸浮物以達(dá)到 此處定義的所期望的細(xì)胞堆疊密度。與葉片組織的真空輔助浸潤相比，所述方法的優(yōu)點(diǎn)是 過量的生物載體懸浮物可被移除并再利用，并且可以立即重新建立細(xì)胞堆疊的多孔性。被 浸潤的葉片的生存能力顯著依賴于過量液體的攝取和/或移除以恢復(fù)細(xì)胞間隙中的氣相。 因?yàn)檫@是很難控制的，所以使得葉片組織的真空輔助浸潤的易變性和失敗率高?？紤]到具 有操作、自動(dòng)操作、限控、擴(kuò)大規(guī)模以及廢物的產(chǎn)生和移除這幾個(gè)實(shí)際的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選的實(shí)施 方式是將載體懸浮物施用于細(xì)胞堆疊?；蛘?，可以在形成細(xì)胞堆疊之前，將植物細(xì)胞的懸浮 物與載體懸浮物混合。氣隙的恢復(fù)和滲入了農(nóng)桿菌之類生物載體的細(xì)胞堆疊的培養(yǎng)基被去 除的培養(yǎng)確保微生物載體不會(huì)因它們的過度生長而破壞植物細(xì)胞。
[0029] 可以代替生物載體懸浮物，使用含有核酸或核酸類似物的溶液、或顆粒的懸浮物、 或被覆有或含有核酸的乳液。
[0030] 應(yīng)用生物載體后，在受控條件下，將細(xì)胞堆疊培育或培養(yǎng)一定時(shí)間，使該植物細(xì)胞 堆疊通過恢復(fù)各個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇之間的氣隙而重建其多孔結(jié)構(gòu)，并允許植物細(xì)胞表達(dá)重組 蛋白，從而積累所期望的產(chǎn)物。培養(yǎng)條件（如時(shí)間、溫度、濕度、光強(qiáng)度）可以容易地調(diào)整為 有利于特定的所期望的產(chǎn)物的合成。無需特殊的設(shè)備來支撐細(xì)胞堆疊，廉價(jià)的一次性塑料 托盤就足以對它們進(jìn)行保持。在培養(yǎng)的第一個(gè)周期，通過蒸發(fā)和吸收施加有生物載體的液 體進(jìn)行氣隙重構(gòu)?；蛘?，通過真空或壓力輔助的方法移除過量的液體而進(jìn)行氣隙重構(gòu)。培養(yǎng) 完成后，收獲該細(xì)胞堆疊，并通過應(yīng)用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)募兓椒◤纳镔|(zhì)中分離/隔 離產(chǎn)物。在分析或診斷結(jié)果顯示就是所期望的產(chǎn)品的情況下，也可在培育/培養(yǎng)期間進(jìn)行 收獲。整個(gè)過程可以自動(dòng)操作，并且可以很容易地?cái)U(kuò)大規(guī)模或縮小規(guī)模。這個(gè)易于設(shè)置且 不復(fù)雜的方法使得設(shè)計(jì)高度可控的工藝以滿足GMP要求和/或高流通量的應(yīng)用和/或工業(yè) 規(guī)模生產(chǎn)是可行的。
[0031] 該方法特別適用于對人體、動(dòng)物和/或環(huán)境有害的產(chǎn)品，因?yàn)檎麄€(gè)過程可以在完 全封閉的條件下進(jìn)行，因此提供高生物安全性。還適用于在生產(chǎn)工藝中所用的化合物、載體 和/或核酸。
[0032] 本文所用的"收獲"一詞應(yīng)理解為包括基于所期望的產(chǎn)物的表達(dá)和積累的任何行 動(dòng)。除了包括上述所期望的產(chǎn)物的分離/隔離的收獲，收獲一般還涉及獲得基于天然或重 組積累的所期望的產(chǎn)物的任何診斷或分析結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚在這些情況下，可以 排除所期望的產(chǎn)物本身的分離/隔離。
[0033] 或者，也可以由含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)細(xì)胞堆疊，以增加所期望的產(chǎn) 物（例如重組蛋白質(zhì)，代謝物）的生產(chǎn)，例如，通過提供復(fù)制系統(tǒng)或代謝途徑的一個(gè)元件或 通過下調(diào)某宿主因子來實(shí)施。
[0034] 進(jìn)一步地本發(fā)明提供去除培養(yǎng)基、多孔結(jié)構(gòu)非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞 材料，密度在〇. lg?〇. 9g濕細(xì)胞重量/cm3之間、優(yōu)選在0. 2g?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3之 間、最優(yōu)選在〇. 4g?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3之間，是由本發(fā)明公開的方法獲得的或可由本 發(fā)明公開的方法獲得的。換言之，本發(fā)明提供培養(yǎng)基被去除的、多孔結(jié)構(gòu)非組織多層細(xì)胞堆 疊形式的植物細(xì)胞材料，密度在0. lg?0. 9g濕細(xì)胞重量/cm3之間、優(yōu)選0. 2g?0. 85g濕 細(xì)胞重量/cm3之間、最優(yōu)選0. 4g?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3之間。
[0035] 細(xì)胞堆疊還可以作為載體懸浮物的補(bǔ)充或代替載體懸浮物，用前體、誘導(dǎo)劑、激 素、穩(wěn)定劑（例如相容性溶質(zhì)）、抑制劑、RNAi/siRNA分子、信號化合物、酶（例如果膠酶）和 /或激發(fā)子處理，或在前體、誘導(dǎo)劑、激素、穩(wěn)定劑（例如相容性溶質(zhì)）、抑制劑、RNAi/siRNA 分子、信號化合物、酶（例如果膠酶）和/或激發(fā)子的存在下培養(yǎng)，以生產(chǎn)重組和/或內(nèi)源 (天然）蛋白質(zhì)或代謝物。
[0036] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所采用的物質(zhì)誘導(dǎo)包含在細(xì)胞堆疊中的未分化細(xì)胞 分化?？梢酝ㄟ^例如應(yīng)用激素或特定的激素組合，或通過轉(zhuǎn)化帶轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。
[0037] 細(xì)胞堆疊可以反復(fù)使用任何系列的載體懸浮物、核酸溶液或前述物質(zhì)和/或載體 懸浮物、核酸溶液或前述物質(zhì)的組合進(jìn)行處理。這意味著基本上只要在每次處理后細(xì)胞堆 疊的多孔性被維持且氣隙得到恢復(fù)，本發(fā)明的方法就能夠反復(fù)實(shí)施。尤其是還包括使用不 同載體懸浮物的混合物來同時(shí)共轉(zhuǎn)化具有不同核酸的細(xì)胞堆疊的細(xì)胞。
[0038] 細(xì)胞堆疊還可以包含不只一個(gè)不同種類的細(xì)胞和/或不同的克隆和/或不同的轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞株和/或非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。此外，異質(zhì)性細(xì)胞堆疊還可以包含來自不同物種甚至 生物界（kingdoms)的細(xì)胞，基本上使用植物細(xì)胞作為共培養(yǎng)的其它細(xì)胞（例如酵母、真菌、 動(dòng)物和人類細(xì)胞）的多孔支撐。
[0039] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，多孔細(xì)胞堆疊被用作可繁殖性高且評價(jià)共培 養(yǎng)生物體的生長和/或生存能力的均勻分析支撐，其中，所述評價(jià)用于表征所期望的產(chǎn)物。 優(yōu)選該細(xì)胞堆疊用于測試和/或篩選由細(xì)胞堆疊產(chǎn)生的分子（代謝物、肽和/或蛋白質(zhì)） 對共培養(yǎng)生物體的活性。此類分析通常包括以下步驟：（1)產(chǎn)生本發(fā)明的多孔性細(xì)胞堆疊， (2)將化合物、載體和/或核酸添加到細(xì)胞堆疊中，可選地將所述細(xì)胞堆疊培養(yǎng)適當(dāng)?shù)钠?間，（3)對所述多孔細(xì)胞堆疊的選擇區(qū)域接種第二生物體，（4)在使第二生物體生長的條件 下培養(yǎng)被接種的多孔細(xì)胞堆疊，（5)在合適的培養(yǎng)時(shí)間后評價(jià)在細(xì)胞堆疊中合成的產(chǎn)物對 第二生物體、例如對生長和/或生存能力的作用（所希望的產(chǎn)物）。如果使用例如轉(zhuǎn)基因懸 浮細(xì)胞株，則第二工序可以省略。
[0040] 因此，本發(fā)明提供了通過本文所公開的方法獲得或可獲得的、和/或具有上述定 義的密度的植物細(xì)胞材料在分析或診斷目的方面的應(yīng)用。例如，可以在待分析或診斷的生 物體或物質(zhì)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞堆疊所包含的細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了包含如本文所公 開的培養(yǎng)基被去除的多孔結(jié)構(gòu)非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料的診斷或分析工 具。
[0041] 相應(yīng)地本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解本發(fā)明的細(xì)胞堆疊也可用于檢測與細(xì)胞堆疊 接觸的樣品中的分析物（"處理"）。另外，用含有感興趣的分析物的樣品處理細(xì)胞堆疊 只是短暫地、即在短時(shí)間（最多3個(gè)小時(shí)）內(nèi)進(jìn)行。處理后，氣隙已經(jīng)再次被重建，S卩，必 須恢復(fù)細(xì)胞堆疊的相應(yīng)密度和孔隙率。然后，在沒有與任何液體或凝膠化/凝固的培養(yǎng) 基（供給營養(yǎng)物）連續(xù)接觸的情況下對細(xì)胞堆疊進(jìn)行培養(yǎng)。存在于樣品中的分析物可 能誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)或?qū)е录?xì)胞堆疊的可測量性變化或細(xì)胞堆疊所含的細(xì)胞的操 控（manipulation)的任何其他事件。可測量的變化或操控包括但不限于熒光報(bào)告蛋白 (fluorescent reporter protein)、突光報(bào)告分子（fluorescent reporter molecules)、 酶、導(dǎo)致細(xì)胞死亡、產(chǎn)生自發(fā)熒光的改變、可以通過用另外的試劑分析該細(xì)胞堆疊或培育該 細(xì)胞堆疊揭示的生理學(xué)或形態(tài)學(xué)變化，該試劑直接在細(xì)胞堆疊或洗出液、提取物或由細(xì)胞 堆疊衍生的其他樣品中產(chǎn)生可檢測的信號。應(yīng)當(dāng)理解的是，野生型和基因重組植物細(xì)胞都 可以使用，包括穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。特別是后者可以通過對由野生型細(xì)胞 產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊的前一個(gè)轉(zhuǎn)化處理而得到。
[0042] 本發(fā)明的細(xì)胞堆疊非常適合于不同類型的操控。與懸浮物中的細(xì)胞或原生質(zhì)體細(xì) 胞相比，細(xì)胞堆疊中的細(xì)胞的密度高。因此，可以更經(jīng)濟(jì)地以獲得相同的有效濃度所需的較 低值施用化合物（例如生產(chǎn)代謝物的誘導(dǎo)子）。此外，可施用高度濃縮的物質(zhì)，這對生物轉(zhuǎn) 化極其有用。與完整的植物相比，植物組織和/或愈傷組織的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是較大的可進(jìn)出細(xì) 胞表面積，這得自于細(xì)胞堆疊的多孔疏松結(jié)構(gòu)及其松散的細(xì)胞接觸。相比懸浮培養(yǎng)物和完 整的植物組織，物質(zhì)可以更容易且有效地施用于細(xì)胞堆疊并從細(xì)胞堆疊中移除。例如，前體 或有毒的化合物可以僅短期施用，并進(jìn)行脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)劑可以以更可控且適時(shí)地定 義的方式施用，從而允許最優(yōu)基因表達(dá)和其它產(chǎn)品積累條件的進(jìn)一步細(xì)化。一系列的前體 和底物可以順序地施用以實(shí)現(xiàn)完整轉(zhuǎn)化，并闡明代謝途徑。進(jìn)而，所積累的分泌產(chǎn)物可以通 過用合適的緩沖溶液簡單地清洗細(xì)胞堆疊而收獲。有趣的是，這能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品的重復(fù)移除 ("榨取")，以避免產(chǎn)物降解和/或反饋抑制。這種策略也可用以避免和/或減少對宿主細(xì) 胞的不利影響，從而將工作效率最大化。
[0043] 向細(xì)胞堆疊提供揮發(fā)性物質(zhì)、包括營養(yǎng)物（例如氨、羧酸、二氧化硫、硫化氫、膦類 和有機(jī)胺）與現(xiàn)有系統(tǒng)相比也有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。以氣態(tài)形式向懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物傳遞這類物質(zhì) 是難以實(shí)現(xiàn)的。首先需要將該氣體溶解在溶液中，工藝受到溶解度和運(yùn)輸?shù)南拗?。?dāng)使用 完整的植物和植物組織時(shí)，運(yùn)輸再次構(gòu)成問題，但更重要的是，需要使用和控制更大的培育 量。雖然已經(jīng)為了研究目的而小規(guī)模地進(jìn)行了實(shí)施，但是大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用通常過于昂貴。 此外，如果產(chǎn)品本身是揮發(fā)性化合物，可以利用控制氣壓來積累和/或收獲產(chǎn)品。在此，t匕 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物更高的細(xì)胞密度（即每單位體積的細(xì)胞）和使用者定義形狀的可行性和幾 何形狀提供了唯一的工藝設(shè)計(jì)可能性，例如低壓培養(yǎng)，這在任何現(xiàn)有生產(chǎn)系統(tǒng)中都是不可 能的。因此，本發(fā)明為這些類型的應(yīng)用提供了經(jīng)濟(jì)且可擴(kuò)展的方法。
[0044] 或者，溶解的化合物可以被傳遞到氣溶膠和/或霧和/或蒸汽形式的多孔細(xì)胞堆 疊中。這種傳遞模式對懸浮細(xì)胞來說是不可能的。該模式被用于完整植物，但是，大部分被 施加的化合物并沒有到達(dá)其目標(biāo)，需要更高的劑量、體積和處理次數(shù)?；衔锿高^角質(zhì)層的 吸收非常有限，要通過氣孔傳遞。因此，這種應(yīng)用被限制為高效的化合物。在此，本發(fā)明提 供了將顯著數(shù)量的幾乎任何化合物有效率地傳遞給細(xì)胞堆疊的途徑。
[0045] 擴(kuò)大規(guī)?？梢酝ㄟ^并行化容易地實(shí)現(xiàn)，S卩，通過簡單地生成所需數(shù)量的細(xì)胞堆疊。 或者，擴(kuò)大規(guī)模也可以通過使用適當(dāng)尺寸的大細(xì)胞堆疊或片材、細(xì)胞柱（columns)或類似 的三維結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)。
[0046] 細(xì)胞堆疊的垂直尺寸僅受到在堆疊的底部作用于細(xì)胞的力和所獲得的孔隙的壓 實(shí)程度的限制。但是，這個(gè)問題可以通過使用中間支撐體得到解決。因此，本發(fā)明細(xì)胞堆疊 的典型垂直尺寸范圍為幾毫米（即3?5_)到幾厘米（即3?15cm)或更大。橫向尺寸 沒有限制。尺寸可為1〇_ 3?10m3。必須確保充分的通氣/氣體交換，以便例如維持適當(dāng) 的氧氣和二氧化碳的含量。揮發(fā)性的初級和次級代謝物的積累也必須被控制，因?yàn)槔绺?含量的乙烯可能對細(xì)胞是有害的。對于厚度小的細(xì)胞堆疊（約3?5cm)，通過擴(kuò)散進(jìn)行氣 體交換通常是足夠的。較厚的細(xì)胞堆疊可能需要積極的通氣和/或整合額外的空氣通道。 在這方面，本發(fā)明提供了獨(dú)特的解決方案，因?yàn)樵搼腋∥锛?xì)胞可以被鑄型成幾乎任何使用 者定義的形狀。
[0047] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所期望的產(chǎn)物選自內(nèi)源性（即天然）和異源蛋白質(zhì)或多肽、 次生代謝物、標(biāo)記物和分析/診斷結(jié)果。
[0048] 感興趣的基因包括編碼本身是天然藥物（例如藥品或獸藥產(chǎn)品）的蛋白質(zhì)的基 因。
[0049] 異源核酸可以編碼細(xì)菌、真菌、植物、非植物或動(dòng)物來源的基因及其他。可以在本 發(fā)明的工藝中制備的蛋白質(zhì)包括異二聚體（例如FSH)、免疫球蛋白、融合抗體、單鏈抗體和 其他抗體形式或衍生物。
[0050] 這樣的蛋白質(zhì)包括但不限于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白、p53、血管抑素和瘦蛋白。同樣 地，本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)蛋白。其它感興趣的序列包括蛋白質(zhì)、激素（例 如促卵泡激素）、生長因子、細(xì)胞因子、血清白蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白、索馬甜、索馬甜樣 蛋白、表皮生長因子（例如VEGF)、胰島素、單體或二聚體或分泌型免疫球蛋白A、轉(zhuǎn)鐵蛋白 或轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，以及受體（例如⑶16、⑶32、⑶64、⑶89、新生兒Fc受體）。
[0051] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明能夠生產(chǎn)多種所期望的產(chǎn)品，例如蛋白質(zhì)和多 肽，包括藥物相關(guān)的（重組）蛋白（例如疫苗、抗體、治療性酶、變應(yīng)原和低變應(yīng)原、抗菌 肽、結(jié)構(gòu)蛋白（例如用作生物相容性涂層材料的彈性蛋白和膠原蛋白）、病毒樣顆粒、蛋白 體等），有營養(yǎng)價(jià)值的（重組）蛋白（食品和飼料添加劑），用于診斷用途的（重組）蛋白 (例如酶、抗體和工程抗體、其他酶或熒光融合蛋白、被用作陽性對照的抗原、蛋白質(zhì)陣列的 結(jié)合配體），以及技術(shù)相關(guān)性（重組）蛋白（例如親和吸附劑的結(jié)合配體、高值酶、生物催化 劑）。
[0052] 因此，本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)優(yōu)選選自天然或異源蛋白質(zhì)或多肽、次生代謝物、標(biāo) 記物和分析/診斷結(jié)果的至少一種所期望的產(chǎn)品的方法。該方法包括：從植物細(xì)胞懸浮培 養(yǎng)物中生成培養(yǎng)基被去除的多孔結(jié)構(gòu)非組織多層細(xì)胞堆疊，其密度為〇. 1?〇. 9g濕細(xì)胞重 量/cm3,優(yōu)選為0. 2?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3,最優(yōu)選為0. 4?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3,向細(xì) 胞堆疊施加適合于誘導(dǎo)或調(diào)整所期望產(chǎn)物的生成的溶液、懸浮物和/或氣體，將細(xì)胞堆疊 密度調(diào)整到上述范圍內(nèi)，根據(jù)需要，將該細(xì)胞堆疊在50?100%的相對濕度下培養(yǎng)，使細(xì)胞 堆疊產(chǎn)生并積累所期望的產(chǎn)物。任選地，該方法還包括從細(xì)胞堆疊所包含的生成細(xì)胞中收 獲或隔離積累的所期望產(chǎn)物。
[0053] 本發(fā)明的基于細(xì)胞堆疊的系統(tǒng)也適合作為用于分子進(jìn)化、蛋白質(zhì)工程、代謝工程 和合成生物學(xué)應(yīng)用的篩選平臺，其中包括將使用或?qū)⒁褂玫幕虮磉_(dá)盒、質(zhì)粒等優(yōu)化。進(jìn) 而，通過使用本文所述的細(xì)胞堆疊，本發(fā)明提供用于以高通量、高重現(xiàn)性和自動(dòng)化的方式評 價(jià)基因表達(dá)構(gòu)建體和工程化靶蛋白的分析方法。根據(jù)本發(fā)明和前面提到的內(nèi)容，這些應(yīng)用 的目標(biāo)是收集代表例如在第二培養(yǎng)期"收獲"的所期望的產(chǎn)品的信息和結(jié)果。
[0054] 另一方面，本發(fā)明提供通過所涉及的酶的瞬時(shí)表達(dá)操控蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方 法，可以實(shí)現(xiàn)例如糖蛋白的糖基化模式的修飾。進(jìn)而，可以通過沉默（例如糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋 白酶、泛素連接酶）使內(nèi)源酶發(fā)生基因沉默，以影響產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量。
[0055] 此外，本發(fā)明提供一種通過所涉及的途徑酶和/或它們的轉(zhuǎn)錄因子的瞬時(shí)表達(dá)生 產(chǎn)次級代謝物作為所期望的產(chǎn)物的方法。生化途徑也可以通過經(jīng)由相應(yīng)的酶的沉默而阻斷 競爭途徑和/或分解代謝以實(shí)現(xiàn)操控。同樣地，本發(fā)明的系統(tǒng)非常適于通過如本文所述地 生成及培養(yǎng)細(xì)胞堆疊對由未做基因性修飾的（天然）細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)代謝物加以改進(jìn)。最 后，本發(fā)明也可用于在相應(yīng)誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)由內(nèi)含組成型啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 的轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞株產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊。
[0056] -般來說，異源核酸可以通過本領(lǐng)域中使用的任何合適的工藝表達(dá)，或者它們也 可以被如下地轉(zhuǎn)錄或表達(dá)：
[0057] ⑴例如含有被可操作地連接到感興趣的異源序列的啟動(dòng)子的"裸"DNA的瞬時(shí)表 達(dá)；
[0058] (ii)由表達(dá)載體、例如復(fù)制載體表達(dá)。一般來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠 構(gòu)建重組基因瞬時(shí)表達(dá)的載體和設(shè)計(jì)方案?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的載體，該載體含有 合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記 物基因和其它合適的序列。更多詳情請參見例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. , John ffiley&Sons, 1992 ；
[0059] (iii)由非整合載體表達(dá)；
[0060] (iv)由被傳遞的T-DNA表達(dá)。
[0061] 應(yīng)當(dāng)理解這些分類并不相互排斥，例如，非整合載體也可以是表達(dá)載體等。
[0062] 用于實(shí)現(xiàn)這樣的表達(dá)的方法在本文的其他部分討論。
[0063] 構(gòu)建體可以被引入相對高拷貝數(shù)的強(qiáng)啟動(dòng)子，并不發(fā)生在選擇構(gòu)建體被整合進(jìn)基 因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體時(shí)可能發(fā)生的固有的慢化效應(yīng)（moderating effect)。結(jié)果，生成的蛋白 質(zhì)的含量和濃度遠(yuǎn)超過通過使用現(xiàn)有技術(shù)（轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物或懸浮物中的瞬時(shí)表達(dá)）中 的基于植物細(xì)胞的系統(tǒng)的蛋白生產(chǎn)方法能夠獲得的蛋白質(zhì)的含量和濃度。
[0064] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中公開了能夠產(chǎn)生編碼靶蛋白的mRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞，該靶蛋白由所引入的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄得到，該核酸構(gòu)建體包含被可操作地連接 到啟動(dòng)子的靶核苷酸序列。
[0065] 因此，"被引入的核酸"作為DNA序列包括以構(gòu)建體形式提供的異源核酸序列，其能 夠相對于通常與所述DNA序列的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)生廣水平，以提商了的 水平，增加胞外蛋白的生產(chǎn)。
[0066] 因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，公開了一種在植物細(xì)胞堆疊中實(shí)現(xiàn)異源核苷 酸序列的表達(dá)的方法，該方法包括至少將包含異源核苷酸序列的第一核酸序列引入靶細(xì)胞 的步驟。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施例中，提供了產(chǎn)生至少胞外異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步 驟：
[0068] (i)將包含編碼異源蛋白質(zhì)的核苷酸序列的第一核酸瞬時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞堆疊所包含的 靶細(xì)胞，
[0069] (ii)通過提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使得或允許核酸在一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)異源蛋白質(zhì)，
[0070] (iii)從產(chǎn)生的細(xì)胞中收獲積累的異源蛋白質(zhì)。
[0071] 可以通過完全傳統(tǒng)的方法隔離，并且進(jìn)行或不進(jìn)行部分或完全純化。
[0072] 細(xì)胞堆疊的培養(yǎng)時(shí)間可以是達(dá)到甚至超過細(xì)胞材料保持活力的任何期間，或直至 產(chǎn)物飽和；一般優(yōu)選為約1?10天，更優(yōu)選為約1?6天。
[0073] 本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然能夠認(rèn)識到可以將一個(gè)以上的基因用在該構(gòu)建體或每個(gè)構(gòu) 建體中。多個(gè)載體（每個(gè)都包括編碼所選擇的異源蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列）可以 被引入到此處或本文其他部分描述的靶細(xì)胞中。這會(huì)有助于生產(chǎn)例如酶的例如多個(gè)亞基、 或例如生化途徑的多種酶。這也會(huì)有助于例如同時(shí)敲除內(nèi)源基因，例如通過siRNA介導(dǎo)的 基因沉默和/或敲入異源酶對產(chǎn)品進(jìn)行翻譯后修飾和/或標(biāo)記物的表達(dá)和/或相同或不同 類型的多種產(chǎn)物的生產(chǎn)。
[0074] 如下面的例子所示，以這種方式引入的異源序列的瞬時(shí)表達(dá)可在第二次培養(yǎng)期的 整個(gè)過程中提供高水平的靶多肽，第二次培養(yǎng)期通常是幾天，取決于所使用的精確的方法 和材料。通過使用如本文中所述的本發(fā)明方法，獲得異源多肽的積累。
[0075] 因此，在細(xì)胞堆疊所包含的細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)代表在很多情況下都有用的工具， 它在以前可能被認(rèn)為是不合適的，例如不穩(wěn)定的可靠表達(dá)，也就是細(xì)胞內(nèi)積累的瞬時(shí)表達(dá) 的異源蛋白質(zhì)或多肽序列。
[0076] 該方法在需要高水平的表達(dá)、但不希望有病毒構(gòu)建體（對植物而言是"感染"）或 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用中是特別優(yōu)選的，例如快速檢測是非常重要的或者有問題的序列 意味著致命的或不希望的表型的應(yīng)用。
[0077] 報(bào)告子可以是任何可檢測的蛋白，例如本領(lǐng)域中常用的標(biāo)記物基因（例如GUS)、 熒光蛋白（例如GFP或DsRed(紅色熒光蛋白）、熒光素酶）等等。優(yōu)選報(bào)告子是非侵入性 標(biāo)記物，例如DsRed或熒光素酶。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，由本文所述的本發(fā)明方法得 到的或能夠得到的、培養(yǎng)基被去除的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料被用于分析 目的。例如，可以將細(xì)胞堆疊所包含的細(xì)胞在待分析物質(zhì)的存在下培養(yǎng)。例如，由含有篩選 標(biāo)記物基因（GFP(綠色熒光蛋白）、DsRed、熒光素酶、GUS、分泌型堿性磷酸酶或能夠在細(xì)胞 內(nèi)產(chǎn)生可檢測的化合物的酶）被可操作地連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞株生成 的細(xì)胞堆疊可用于檢測試樣中的誘導(dǎo)劑?？蛇x地，可誘導(dǎo)報(bào)道基因表達(dá)構(gòu)建體也可以換成 由野生型（非轉(zhuǎn)基因）懸浮細(xì)胞株在第一步驟中生成的細(xì)胞堆疊和然后在第二步驟中分析 的測試樣品。優(yōu)選在兩個(gè)步驟之間有1?5天的培養(yǎng)時(shí)間。然后，將合適體積的液體試樣 或非液體檢驗(yàn)樣品的液體提取物施加于細(xì)胞堆疊。重要的是確保在該步驟中細(xì)胞堆疊的多 孔結(jié)構(gòu)通過使用適當(dāng)?shù)臏y試樣品體積比和適當(dāng)?shù)募?xì)胞堆疊重量，或通過在適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間 后移除測試樣品的多余液體而得以維持。適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間為1分鐘?2小時(shí)，優(yōu)選為5分 鐘?1小時(shí)，更優(yōu)選為10?30分鐘。液體試樣的合適的體積最多為0. 75ml/g細(xì)胞堆疊， 優(yōu)選為0. 5ml/g細(xì)胞堆疊，更優(yōu)選為0. 4ml/g細(xì)胞堆疊。
[0078] 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于雌激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、糖 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員也理解使用阻遏物和抑制物的基因電路同樣可以使用。例 如，將四環(huán)素結(jié)合于tet-阻遏物導(dǎo)致四環(huán)素啟動(dòng)子去阻遏。
[0079] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，因?yàn)椴僮鞣奖恪⑥D(zhuǎn)化效率高和將核酸和/或化合物傳遞進(jìn) 入細(xì)胞堆疊的細(xì)胞的眾多可能性，所以本發(fā)明提供非常有助于研究和優(yōu)化重組活動(dòng)的方 法。
[0080] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的細(xì)胞堆疊優(yōu)于基于葉片的瞬時(shí)系統(tǒng)、液體培 養(yǎng)物中的瞬時(shí)系統(tǒng)、野生型和/或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物和野生型和/或轉(zhuǎn)基因的整株 植物或部分植物的應(yīng)用。
[0081] 與本發(fā)明相比，基于葉片的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)采用分化的植物組織，該分化的植物組 織包含不同的細(xì)胞類型（異源），而已知懸浮細(xì)胞是去分化的。相比基于葉片的系統(tǒng)，本發(fā) 明提供以下優(yōu)點(diǎn)：
[0082] ?生物質(zhì)生產(chǎn)所需的生長設(shè)備不占空間；
[0083] ?不依賴于外部氣候條件；
[0084] ?沒有感染植物病原體的危險(xiǎn)；
[0085] ?快速提供大量高度均勻的生物質(zhì)，這對醫(yī)藥產(chǎn)品尤其重要（降低調(diào)整方面的擔(dān) 憂）；
[0086] ?生物質(zhì)的收獲更容易（無需專用收獲機(jī)具）；
[0087] ?因更低的生物質(zhì)比例而更容易通過冷凍和/或干燥加以保存；
[0088] ?生物質(zhì)更容易處理，產(chǎn)物更容易純化（木質(zhì)素少，纖維少，宿主蛋白質(zhì)少，顏料 少）；
[0089] ?生物質(zhì)是在高度控制的無菌條件下生產(chǎn)的（降低調(diào)整方面的擔(dān)憂）；
[0090] ?與整株植物相比有速度優(yōu)勢，容易擴(kuò)大生物質(zhì)的規(guī)模（0. 1升初始培養(yǎng)物可以 在15天內(nèi)按比例擴(kuò)大在1000升懸浮培養(yǎng)物中獲得100kg生物質(zhì)；5d2. 5升一5d50升 -5dl000 升）；
[0091] ?更好的時(shí)空收率/空間利用率（每平方米生物質(zhì)；生產(chǎn)和培育通常無需照明，使 得細(xì)胞堆疊致密堆積）；
[0092] ?感染相同量的生物質(zhì)需要更少體積的生物載體懸浮物（與罐浸潤相比更少"浪 費(fèi)；
[0093] ?全面密封比基于葉片和植物的方法容易實(shí)施；
[0094] ?用"細(xì)胞堆疊"方法更容易施用細(xì)菌或病毒；
[0095] ?在單個(gè)細(xì)胞中觸發(fā)的意外的轉(zhuǎn)錄后基因沉默僅限于通過胞間連絲連接的少數(shù)相 鄰細(xì)胞，不會(huì)影響全身；
[0096] ?能夠更容易且更經(jīng)濟(jì)地施用其他化學(xué)化合物（例如用于代謝物生產(chǎn)的誘導(dǎo)子、 誘導(dǎo)物、激素或前體）；
[0097] ?可以從堆疊的細(xì)胞（宿主蛋白少，只能進(jìn)入完全處理的分泌蛋白）中只洗脫分泌 蛋白；
[0098] ?因封閉也能夠生產(chǎn)危險(xiǎn)產(chǎn)品（高生物安全水平）；
[0099] ?能夠高通量篩選（多孔過濾板）；
[0100] ?可實(shí)現(xiàn)更靈活的使用者自定義的大小和形狀；
[0101] ?更易控制自動(dòng)化；
[0102] ?可用于植物病原體或其他微生物的標(biāo)準(zhǔn)化生長試驗(yàn)的高度均質(zhì)的植物細(xì)胞材料 使高通量篩選和實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)成為可能；
[0103] ?能同時(shí)和/或順序地以單一格式容易地對不同的方法、技術(shù)和操控步驟進(jìn)行組 合。
[0104] 與液體培養(yǎng)物中的瞬時(shí)系統(tǒng)相比，優(yōu)點(diǎn)可以總結(jié)如下：
[0105] ?與在生物反應(yīng)器（搖瓶或發(fā)酵罐）中的懸浮培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)基上的愈傷組織 生長相比，瞬時(shí)傳遞的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)增加；
[0106] ?無需控制或抑制細(xì)菌生長以避免植物細(xì)胞（抗生素、營養(yǎng)缺陷型菌株）的過度生 長；
[0107] ?與生物反應(yīng)器懸浮物相比，使用"細(xì)胞堆疊"得到較高的農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的比 例；
[0108] ?由于細(xì)胞堆疊中的細(xì)胞沒有被攪動(dòng)，所以得到更親密的載體細(xì)胞接觸，無切斷；
[0109] ?由于在第二培養(yǎng)階段或時(shí)期的高濃縮生物質(zhì)，所以只需較少量的昂貴化合物 (例如用于代謝物生產(chǎn)的誘導(dǎo)劑（乙酰丁香酮）、激素、前體等）；
[0110] ?第二培養(yǎng)階段在用于生產(chǎn)植物細(xì)胞的生物反應(yīng)器外發(fā)生。使得能夠例如在第一 培養(yǎng)階段應(yīng)用連續(xù)的發(fā)酵策略，以確保懸浮物細(xì)胞的持續(xù)供給。結(jié)果實(shí)現(xiàn)對相對昂貴的生 物反應(yīng)器的更理想且更經(jīng)濟(jì)的使用，并能夠?qū)崿F(xiàn)更高的生產(chǎn)能力；
[0111] ?由于細(xì)胞堆疊的多孔結(jié)構(gòu)，氧供應(yīng)的限制并不太重要。
[0112] 與使用轉(zhuǎn)基因植物相比，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)能夠更迅速地恢復(fù)所期望的產(chǎn)物，并 提供沒有環(huán)境問題或風(fēng)險(xiǎn)的完全封閉體系，確保不與食物鏈混雜。
[0113] 與使用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞相比，本發(fā)明能夠更快速地從基因得到產(chǎn)品，具有 更高的生產(chǎn)率，并能生產(chǎn)可能妨礙穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株的再生的有毒產(chǎn)品。
[0114] 將進(jìn)一步參照以下非限制性的附圖和實(shí)施例說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可據(jù)此 實(shí)施本發(fā)明的其它實(shí)施方式。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0115] 圖1不出由基于pTRA、pUTA和含有帶有不同的革巴信號的不同突光蛋白的序列的 TRB0系列的表達(dá)載體得到的T-DNAs。（A)用于分泌型DsRed的表達(dá)的pTRAc rfp-AH，（B) 用于ER-保留的DsRed的表達(dá)的pTRAc rfp_ERH，（C)用于胞楽DsRed表達(dá)的pTRAc rfp-H, (D)用于質(zhì)體革巴向DsRed表達(dá)的pTRAc rTPrfp-H，（E)用于蛋白體革巴向DsRed表達(dá)的pTRAkc glyDS-zenH，（F)用于質(zhì)體祀向GFP表達(dá)的pTRAc rTPgfp，（G)用于質(zhì)體祀向DsRed表達(dá)的 pUTA TPrfp，（H)使用煙草花葉病毒復(fù)制子使胞漿GFP表達(dá)的TRBO-GopTRA的載體骨架基于 pPAM(GenBankAY027531)。pUTA的載體骨架包含來自RK2ori的宿主菌株獨(dú)立質(zhì)粒復(fù)制用的 復(fù)制起始蛋白trfA。TRBO的骨架來源于pCB301 (GenBank AF139061)。LB和RB表示T-DNA 的左右邊界；SAR表示核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（scaffold attachment region) ;P和PA表示帶有重 復(fù)的增強(qiáng)子和花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S基因的終止子的35S-啟動(dòng)子；CHS表示來自查 爾酮合成酶基因（P.hortense)的5'-UTR;TL表示煙草蝕紋病毒（TEV)的5'-UTR;SP表示 小鼠mAb24的密碼子優(yōu)化信號肽；TP表示來自H. vulgare的GBSSI的轉(zhuǎn)運(yùn)肽；rTP表示來自 S. tuberosum的GBSSI的轉(zhuǎn)運(yùn)肽；DsRed表示來自Discosoma sp.的紅色突光蛋白；glyDs 表示帶N-糖基化位點(diǎn)的DsRed變異體；zen表示來自玉米的γ -玉米蛋白的N-末端；GFP 表示來自Aequorea victoria的綠色突光蛋白（S65C突變體，cycle3突變體）；RK2ori表 示復(fù)制的廣宿主范圍ori ;bla表示β -內(nèi)酰胺酶基因；ColElori表示復(fù)制的ori (E. coli); His6表示組氨酸標(biāo)簽；KDEL表示ER-保留標(biāo)簽；RBS表示核糖體結(jié)合位點(diǎn)；Pnos和pAnos表 示胭脂堿合成酶的啟動(dòng)子和終止子；npt II表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Replicase表示 煙草花葉病毒（TMV) 126K/183K蛋白；MP表示TMV運(yùn)動(dòng)蛋白；Rib表示核酶。
[0116] 圖2示出含有不同抗體的序列的pTRA系列的表達(dá)載體的T-DNA區(qū)域。⑷共表 達(dá)2G12抗體重鏈、2G12抗體輕鏈和質(zhì)體靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds ; (B)共表達(dá)ER-保 留2G12抗體重鏈、ER-保留2G12抗體輕鏈和質(zhì)體靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds ; (C)共表 達(dá)M12抗體重鏈、M12抗體輕鏈和ER-保留DsRed的pTRAk MTAD。SPg表示Ig γ -鏈的信號 肽；2G12HC表示人抗-HIV-lgpl20Ig2G12 γ -重鏈；SPk表示人Ig κ -鏈的信號肽；2G12LCF 表示人抗-HIV-lgpl20Ig2G12 κ -輕鏈；pat表示草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltranferase) ;M12HC 表示人 Ig M12 γ -重鏈；M12LC 表示人 Ig M12 λ -輕鏈。（參見 圖1)
[0117] 圖3示出基于含有帶不同靶信號的色氨酸脫羧酶序列的pSS系列的表 達(dá)載體 的 T-DNA (S. Di Fiore et al.，''Targeting tryptophan decarboxylase to selected subcellular compartments of tobacco plants affects enzyme stability and in vivo function and leads to a lesion-mimic phenotype"，Plant Physiol 129:1160 - 1169, 2002)。載體骨架來源于pPCV002。（A)用于表達(dá)胞漿色氨酸脫羧 酶（TDC)的ρΤ-ΡΥΤ ; (B)用于表達(dá)質(zhì)體靶向TDC的pT-CHL。Ω表示煙草花葉病毒的5'-UTR ; tags表示c-myc/His6標(biāo)簽；pAocs表示章魚堿合成酶的終止子。（參見圖1、圖2)
[0118] 圖4給出表達(dá)含有惡性痕原蟲（plasmodium falciparum)3D7裂殖子表面蛋白 1 (GenBank XM_0013 52134)的片段的 pTRAkc Mspl (383319) ERH-Ds 的 T-DNA。
[0119] 圖5示出用農(nóng)桿菌感染5天后的BY-2細(xì)胞的肉眼觀察照片，在白光下（A)和用于 使DsRed的熒光可視化的綠色激發(fā)光下（B)，包括用于人抗體（2G12)的重鏈和輕鏈的表達(dá) 框和用于質(zhì)體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達(dá)框。上：浸潤的"細(xì)胞堆疊"。下：從與農(nóng) 桿菌的共培養(yǎng)物中收獲的細(xì)胞懸浮物，最終0D為0. 05 (左），最終0D為0. 1 (右）。
[0120] 圖6示出用農(nóng)桿菌感染5天后的BY-2細(xì)胞的代表性顯微鏡照片，在白光下（A，B) 和用于使DsRed的熒光可視化的綠色激發(fā)光下（C，D)，包括用于人抗體（2G12)的重鏈和輕 鏈的表達(dá)框和用于質(zhì)體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達(dá)框。得自農(nóng)桿菌感染"細(xì)胞堆疊 "的細(xì)胞（A，C)。與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)得到的懸浮細(xì)胞的最終0D為0. 1 (B，D)。
[0121] 圖7示出用農(nóng)桿菌感染6天后的BY-2細(xì)胞堆疊的照片，在白光下（A)和用于使 DsRed的熒光可視化的綠色激發(fā)光下（B)，包括用于惡性瘧原蟲Mspl片段（p38-p33-pl9) 的表達(dá)框和用于質(zhì)體祀向DsRed的表達(dá)框。在培養(yǎng)皿（A)中顯不不同的光密度（1，0.5， 0. 25,0. 125,0. 0625)。（C)表示通過斑點(diǎn)印跡對來自惡性瘧原蟲的Mspl-P19的免疫檢測。
[0122] 圖8示出在不同的農(nóng)桿菌株被點(diǎn)在細(xì)胞上4天后扁平的BY-2細(xì)胞堆疊的照片，分 別是：在白光下（A)、帶有GFP過濾器組（B)、帶有DsRed過濾器組（C)。（1-3)用pTRB〇-G 轉(zhuǎn)化的EHA105農(nóng)桿菌的3個(gè)克隆，（4-6)用pTRB〇-G轉(zhuǎn)化的GV2260農(nóng)桿菌的3個(gè)克隆，（7) 含 pUTA-TPrfp 的 EHA105，（8)含有 pUTA-TPrfp 的 GV3101::pMP90RK 和（+)陽性對照含有 pTRA-rTPgfp 的 GV3101::pMP90RK。
[0123] 圖9示出在農(nóng)桿菌感染5天后不同靶向的熒光蛋白在細(xì)胞堆疊中的積累。在微 柱中0. 3g鮮重的細(xì)胞堆疊（A)和14ml柱中3克細(xì)胞堆疊（B)被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。（1)質(zhì)體靶向 GFP，（2)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，（3)分泌型DsRed，（4) ER-保留DsRed，（5)胞漿DsRed，（6)質(zhì)體靶 向DsRed，（7)蛋白體靶向DsRed，（8)與ER-保留DsRed共轉(zhuǎn)化且質(zhì)體靶向的GFP。這些照 片是在白光下（左）、設(shè)置有DsRed過濾器（中）和設(shè)置有GFP過濾器（右）的條件下拍攝 的。DsRed的提取量示于（C)。
[0124] 圖10示出在不同尺寸的柱中瞬時(shí)表達(dá)DsRed的BY-2細(xì)胞堆疊的照片。（A)在白 光下，（B)設(shè)置有DsRed過濾器。
[0125] 圖11示出通氣條件對瞬時(shí)表達(dá)的DsRed和2G12的表達(dá)的影響。（A，B)示出在柱 中不同地通氣的細(xì)胞堆疊的照片，（A)在白光下，（B)設(shè)置有DsRed過濾器。（C)示出在農(nóng) 桿菌感染140小時(shí)后DsRed和2G12在柱狀堆疊的BY-2細(xì)胞中的積累。細(xì)胞堆疊的重量減 輕示于下方的圖表。
[0126] 圖12示出在用轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌浸潤5天后柱狀堆疊的細(xì)胞的總提取物和洗脫物的 經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。（A)用分泌M12抗體或蛋白體形成DsRed(對照組）的表 達(dá)構(gòu)建體感染。（B)用分泌或ER-保留的DsRed的表達(dá)構(gòu)建體感染。凝膠上的提取物樣品 相當(dāng)于約l〇mg新鮮細(xì)胞重量（FCW)，凝膠上的洗脫物樣品相當(dāng)于約20mgFCW的洗脫物。
[0127] 圖13示出在用不同靶向的色氨酸脫羧酶或GFP進(jìn)行農(nóng)桿菌感染后的不同時(shí)間點(diǎn) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的堆疊細(xì)胞中的色胺積累。在農(nóng)桿菌感染18小時(shí)后追加額外的色氨酸（trp)。
[0128] 圖14示出在用含有分泌DsRed (rAH)或ER-保留DsRed (rERH)的植物表達(dá)載體的 農(nóng)桿菌浸潤4天后由不同地預(yù)培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的長春花細(xì)胞堆疊的照片。這些照片 是在白光下（A)和設(shè)置DsRed過濾器（B)的條件下拍攝的。懸浮細(xì)胞分別在MS67培養(yǎng)基 或BY-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0129] 圖15示出將不同的曲霉菌點(diǎn)在堆疊上11天后BY-2細(xì)胞堆疊的照片。（A)黑曲 霉，（B)構(gòu)巢曲霉，（C)黃曲霉，（D)寄生曲霉。
[0130] 圖16示出從5日齡BY-2野生型懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的4日齡柱狀堆疊細(xì)胞的洗脫物 (1)和相應(yīng)于9日齡BY-2野生型懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)基（2)的經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝 膠。

【具體實(shí)施方式】
[0131] 實(shí)施例1
[0132] 懸浮物中的瞬時(shí)表達(dá)與細(xì)胞堆疊中的瞬時(shí)表達(dá)的比較
[0133] 為了評價(jià)在本發(fā)明的細(xì)胞堆疊中生產(chǎn)瞬時(shí)重組蛋白，將DsRed和抗體2G12在農(nóng)桿 菌浸潤細(xì)胞堆疊中的瞬時(shí)表達(dá)與在液體培養(yǎng)物中將細(xì)胞懸浮物與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的現(xiàn)有技 術(shù)方法進(jìn)行比較。
[0134] 使用重組農(nóng)桿菌（菌株6￥3101::?1^90服），其攜帶在同一個(gè)1'-0嫩上含有用于人 抗體（2G12)的重鏈和輕鏈的表達(dá)框以及用于質(zhì)體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達(dá)框的 二元載體pTRAp-2G12FER-Ds。兩種2G12基因都包含ER-保留抗體的KDEL序列（圖2B)。 該KDEL序列被刻意用來避免抗體分泌，以便直接比較細(xì)胞堆疊和懸浮細(xì)胞的生產(chǎn)率。
[0135] 用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株如下制備。通過將50 μ 1接種于5ml YEB培養(yǎng)基（5g/ 1牛肉提取物，lg/1酵母提取物，5g/l蛋白胨，0· 5g/l MgS04, ρΗ7· 4,輔以50mg/l羧芐青霉 素和25mg/l卡那霉素）由甘油儲存液引發(fā)培養(yǎng)物。細(xì)菌培養(yǎng)物在26°C生長3天至光密度 (0D)約為5。將細(xì)菌通過離心沉淀而顆粒化，再用浸潤培養(yǎng)基（50g/l蔗糖，2g/l葡萄糖， 〇.5g/l FertyK 2Mega(Planta Diingemittel，德國），ρΗ5·3,輔以 200μΜ 乙酰丁香酮），按 〇D = 1進(jìn)行懸浮。然后，在應(yīng)用前，將該細(xì)菌懸浮物在22°C培育1小時(shí)，。
[0136] 將煙草（Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow，BY-2)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基（3% 鹿糖，4. 3g/L 的 Murashige&Skoog 鹽，100mg/L 肌醇，lmg/L 硫胺素，0· 2mg/L2, 4-二氯苯氧 基乙酸，200mg/L ΚΗ2Ρ04, ρΗ5·6)中，在黑暗中、旋轉(zhuǎn)振蕩儀（180rpm)上于26°C進(jìn)行培養(yǎng)。 將細(xì)胞每周在新鮮培養(yǎng)基中用4%的接種物繼代培養(yǎng)，。
[0137] 植物細(xì)胞和農(nóng)桿菌用消毒設(shè)備在無菌條件下進(jìn)行處理。將50ml分裝的4日齡 400ml BY-2懸浮培養(yǎng)物倒入75ml帶有5. 5cm直徑的纖維素過濾器（MN615)的布氏漏斗， 通過抽真空（約500mbar，lmin)完全移除培養(yǎng)基。將得到的細(xì)胞堆疊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，測 定新鮮細(xì)胞重量（FCW)(重量=4. 5g，直徑=5. 5cm，高度=0· 3cm，密度=0· 63g/cm3)。然 后，將2. 5ml 0D1的農(nóng)桿菌懸浮物（0. 55ml/g細(xì)胞堆疊）均勻地滴到細(xì)胞堆疊上，形成完全 浸潤。調(diào)整施加的液體量，使得細(xì)胞堆疊被均勻地潤濕，但沒有被完全淹沒，以允許氣隙快 速恢復(fù)。將農(nóng)桿菌浸潤的細(xì)胞堆疊在黑暗中于26°C、以95%的相對濕度（RH)培養(yǎng)5天。
[0138] 為了進(jìn)行共培養(yǎng)，將2. 5ml和5ml 0D1的農(nóng)桿菌懸浮物以與在細(xì)胞堆疊中相同和 加倍的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞的比率加入至50ml BY-2懸浮培養(yǎng)物。
[0139] 將共培養(yǎng)培養(yǎng)物在黑暗中于26°C在旋轉(zhuǎn)搖床上以180rpm進(jìn)行培養(yǎng)。在5天后通 過真空過濾從共培養(yǎng)培養(yǎng)物中收獲BY-2細(xì)胞，將所得細(xì)胞堆疊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。在通過用 于DsRed表達(dá)的紅色發(fā)光過濾器的綠色激發(fā)光下對從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到的細(xì)胞進(jìn)行肉眼觀 察（圖5)。在根據(jù)本發(fā)明制備的農(nóng)桿菌感染細(xì)胞堆疊中可清晰地觀察到紅色熒光。引人注 目的是，在懸浮物中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的細(xì)胞中沒有觀察到紅色熒光。細(xì)胞的顯微分析清楚 地表明，相比在懸浮物中共培養(yǎng)的現(xiàn)有技術(shù)方法（圖6)，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞堆疊方法能夠 得到更高的感染率以及每個(gè)細(xì)胞的高DsRed表達(dá)。
[0140] 這兩種方法都提取可溶性蛋白，并且對DsRed和抗體的積累進(jìn)行定量。簡言之，將 細(xì)胞通過超聲處理（Bandelin，Sonopuls，間隔0. 9s，40W，2X30s)在2個(gè)體積（w/v)的提取 緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM氯化鈉，10mM硫酸氫鈉，pH7. 5)中均化。將細(xì)胞碎片通過離心 過濾（15min, 13000g,4°C )顆粒化，將清澈的上清液用于進(jìn)一步分析。通過測量提取的可溶 性蛋白的熒光（激發(fā)530±12. 5nm，發(fā)射590±17. 5nm)對DsRed進(jìn)行定量?？贵w的定量是 使用蛋白A被偶聯(lián)至CM5傳感芯片的BIAC0RE? T200儀器進(jìn)行表面等離子體共振光譜而實(shí) 施的（例如參見 T. Holland et al.，''Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture〃，Biotechnol Bioeng 107:278-289,2010)。
[0141] 在由共培養(yǎng)懸浮細(xì)胞得到的提取物中既沒有檢測到DsRed，也沒有檢測到2G12抗 體。與此相反，從農(nóng)桿菌感染細(xì)胞堆疊得到的提取物每克FCW含有55 μ g DsRed和47 μ g 2G12抗體。
[0142] 這個(gè)例子表明通過使用本發(fā)明的細(xì)胞堆疊，與懸浮培養(yǎng)物相比，在細(xì)胞堆疊中與 重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后可以通過瞬時(shí)表達(dá)得到實(shí)質(zhì)上更高收率的重組蛋白質(zhì)。此外，這個(gè)例 子清楚地表明，細(xì)胞堆疊的高生產(chǎn)率是由于相當(dāng)高的轉(zhuǎn)化效率（通常為50%?80%)以及 在細(xì)胞內(nèi)的更多的產(chǎn)物積累。
[0143] 實(shí)施例2
[0144] 惡性瘧原蟲抗原在細(xì)胞堆疊中的瞬時(shí)表達(dá)
[0145] 為了測試細(xì)胞堆疊是否可用于生產(chǎn)瘧疾抗原，瞬時(shí)生產(chǎn)惡性瘧原蟲的不同蛋白 質(zhì)。
[0146] 含二元載體的重組農(nóng)桿菌菌株，該二元載體帶有用于來自惡性瘧原蟲的 Mspl (p38，p33和pl9)的ER-保留羧基末端片段的表達(dá)框和用于質(zhì)體靶向DsRed的第二表 達(dá)框（圖4)。如實(shí)施例1所述地生長并準(zhǔn)備細(xì)菌。在感染植物細(xì)胞前，將農(nóng)桿菌浸潤懸浮 物從0D1連續(xù)稀釋至0D0. 0625。
[0147] 如實(shí)施例1所述地將3日齡的BY-2懸浮培養(yǎng)物用于生長細(xì)胞堆疊。將該細(xì)胞堆疊 切成大約5mmX5mmX10mm的片（圖7A)。將六片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，并以不同光密度的農(nóng)桿 菌懸浮物滴加浸潤至飽和（約150 μ 1/細(xì)胞堆疊）。陰性對照僅用浸潤培養(yǎng)基浸潤（圖7)。 在20°C、95% RH的條件下培育6天后，對堆疊片進(jìn)行DsRed熒光和抗原表達(dá)分析。DsRed 是在通過紅色發(fā)光過濾器的綠色激發(fā)光下進(jìn)行肉眼觀察（圖7B)。為了檢測瘧原蟲蛋白，如 實(shí)施例1所述地提取可溶性蛋白，將每個(gè)提取物的等分試樣點(diǎn)到硝酸纖維素膜上。瘧原蟲 蛋白的存在通過在用NBT/BCIP (硝基藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3' -吲哚基磷酸酯）培養(yǎng)后對 P19域和AP偶聯(lián)第二抗體使用單克隆抗體5. 2進(jìn)行免疫檢測而可視化。
[0148] 所有受感染的細(xì)胞堆疊都檢測到強(qiáng)烈的DsRed熒光（圖7B)。在以0D1的農(nóng)桿菌 濃度浸潤的細(xì)胞堆疊和以超過10倍稀釋的0D0. 0625的農(nóng)桿菌懸浮物浸潤的細(xì)胞堆疊之間 僅檢測到熒光強(qiáng)度的微弱差異。所有浸潤的細(xì)胞堆疊中共轉(zhuǎn)化的瘧原蟲蛋白的清澈的免疫 檢測物也都沒反映出農(nóng)桿菌的10倍稀釋物（圖7C)。用0D1的農(nóng)桿菌懸浮物浸潤得到最高 的積累水平。
[0149] 在另外的實(shí)驗(yàn)中，來自惡性瘧原蟲的其他蛋白質(zhì)（Pfsp25單獨(dú)和與DsRed融合；和 由來自幾種不同的瘧疾蛋白的域構(gòu)成的另一融合蛋白）被成功地表達(dá)于不同的BY-2細(xì)胞 堆疊形式（數(shù)據(jù)未顯示）。本例顯示，重組蛋白積累甚至在細(xì)胞堆疊被較低量的農(nóng)桿菌浸潤 時(shí)也高。因此，本發(fā)明提供一種更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法，該方法對大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用特別重要。 也表明不同的瘧疾蛋白可以有效地表達(dá)和生產(chǎn)，并且所公開的方法通常適合于瘧疾疫苗和 針對其他感染性疾病的疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)。
[0150] 實(shí)施例3
[0151] 為篩選應(yīng)用而使用細(xì)胞堆疊
[0152] 由于細(xì)胞堆疊是高度均質(zhì)化的，所以它們用于篩分目的也很理想。因此，在本例中 通過評價(jià)所采用的農(nóng)桿菌菌株和不同的表達(dá)載體對瞬時(shí)產(chǎn)物積累的影響而表明。使用兩種 不同的表達(dá)載體：含有35S-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的質(zhì)體靶向DsRed的二元載體pUTA-TPrfp (圖1G); 包含外殼蛋白序列被GFP替換的煙草花葉病毒（TMV)的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的cDNA序列的二 兀載體 pTRB〇-G(圖 lH)(J.A.Lindbo，"TRB0:a high-efficiency tobaco mosaic virus RNA-based overexpression vector"，Plant Physl45:1232-1240, 2007)。每個(gè)載體被引入 到兩個(gè)不同的農(nóng)桿菌菌株中。標(biāo)準(zhǔn)載體pUTA-TPrfp被引入到GV3101: : pMP90RK和EHA105 中；病毒載體 pTRBO-G 被引入到 GV2260 和 EHA105 中（R.Helens et al·，"A guide to Agrobacterium binary Ti vectors"，TIBS5:446-451, 2000)。
[0153] 在 GV3101: : pMP90RK 中的 pTRA-rTPgfp 被用作陽性對照（圖 IF)。GV-pUTA-TPrfp、 EHA-pUTA-TPrfp 和 GV-pTRA-rTPgfp 的液體培養(yǎng)物被甘油儲存液（glycerol stock) 引發(fā)。對于GV-pTRB〇-G和EHA-pTRBO-G培養(yǎng)物，每一個(gè)菌株接種由新制備的帶質(zhì)粒 DNA的電轉(zhuǎn)化物獲得的三個(gè)未檢查菌落。在標(biāo)準(zhǔn)條件（GV-pUTA-TPrfp、GV-pTRB〇-G和 GV-pTRA-rTPgfp :50mg/l 羧芐青霉素和 25mg/l 卡那霉素，EHA-pUTA-TPrfp :50mg/l 羧芐青 霉素，EHA-pTRBO-G :25mg/l卡那霉素）下，生長農(nóng)桿菌菌株（實(shí)施例1)。3天后，將細(xì)菌通 過離心沉淀顆?；⒂媒櫯囵B(yǎng)基重新懸浮成0D1。在應(yīng)用前，將細(xì)菌懸浮物在22°C培育 3小時(shí)。用25ml在標(biāo)準(zhǔn)條件下成長的5日齡BY-2培養(yǎng)物使細(xì)胞堆疊（重量=4g，直徑= 5. 5cm，高度=0· 3cm，密度=0· 56g/cm3)生長（實(shí)施例1)。將細(xì)胞堆疊倒置于培養(yǎng)皿中， 然后將40 μ 1的各農(nóng)桿菌懸浮物點(diǎn)于光滑的表面。將浸潤的細(xì)胞堆疊在26°C、95% RH的條 件下培育。4天后，在通過用于GFP表達(dá)的綠色濾光片的藍(lán)色激發(fā)光下（圖8B)和通過用于 DsRed表達(dá)的紅色濾光片的綠色激發(fā)光下（圖8C)對細(xì)胞堆疊進(jìn)行觀察。在使用EHA105將 表達(dá)構(gòu)建體傳遞進(jìn)入植物細(xì)胞時(shí)，病毒載體以及標(biāo)準(zhǔn)二元載體的熒光蛋白表達(dá)明顯效率較 低。這個(gè)結(jié)果通過以相同的農(nóng)桿菌懸浮物感染3g柱狀細(xì)胞堆疊和使本氏煙草（Nicotiana benthamiana)葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化得到證實(shí)（數(shù)據(jù)未顯示）。這種容易處理小規(guī)模"農(nóng)業(yè)試點(diǎn)"的 方法也可以用來評價(jià)能夠影響目標(biāo)蛋白表達(dá)的其他參數(shù)（例如，農(nóng)桿菌的生長條件和預(yù)處 理，浸潤細(xì)胞堆疊的浸潤培養(yǎng)基組合物或培養(yǎng)條件）。無需使用高技術(shù)設(shè)備就可以并行分析 數(shù)百個(gè)樣品，裝有400mlBY-2培養(yǎng)物的1L搖瓶將在5天內(nèi)提供16次4g細(xì)胞堆疊的材料， 由400mlll日齡的培養(yǎng)物，能夠生產(chǎn)30個(gè)細(xì)胞堆疊。
[0154] 實(shí)施例4
[0155] 在柱狀細(xì)胞堆疊中的瞬時(shí)表達(dá)
[0156] 為了測試是否能夠生產(chǎn)、浸潤和保持柱狀細(xì)胞堆疊，進(jìn)行幾個(gè)實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)例子 中，不同靶向版本的紅色熒光蛋白DsRed和綠色熒光蛋白GFP被瞬時(shí)表達(dá)在柱狀形式的堆 疊細(xì)胞中。
[0157] 使用攜帶用于分泌型DsRed(圖1A)、ER_保留DsRed(圖1B)、胞漿DsRed(圖1C)、 質(zhì)體靶向DsRed(圖1D)、蛋白體靶向DsRed(圖1E)和質(zhì)體靶向GFP(圖1F)的二元表達(dá)載 體的不同農(nóng)桿菌菌株。如實(shí)施例1所述地制備用于農(nóng)桿菌感染的農(nóng)桿菌懸浮物。在應(yīng)用前， 將細(xì)菌懸浮物在22°C下培育5小時(shí)。為了共感染實(shí)驗(yàn)，混合2個(gè)0D1的農(nóng)桿菌菌株（分別 含有ER-保留DsRed和質(zhì)體靶向GFP)，使各菌株的0D為0. 5。
[0158] 將在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長的11日齡BY-2懸浮細(xì)胞（實(shí)施例1)用于在兩種不同類型 的無菌聚丙烯柱中生產(chǎn)細(xì)胞堆疊。使用體積0. 7ml的微型旋轉(zhuǎn)柱（Receiver Column20ym， MACHEREY-NAGEL，德國，圖 8A)和體積 14ml 的中長柱（QIAGEN-tiplOOcolumn，QIAGEN，德國， 圖9B)，二者都配備有20 μ m聚乙烯玻璃過濾器（filter frit)。通過將懸浮培養(yǎng)物注入連 接到真空的柱內(nèi)而生成細(xì)胞堆疊。將培養(yǎng)基通過真空過濾完全移除之后，對所得細(xì)胞堆疊 的尺寸進(jìn)行測定。將lml懸浮培養(yǎng)物用于微柱，得到直徑為0. 68cm、高度為1. 5cm、密度為 0. 54g/cm3的重量0. 3g的細(xì)胞堆疊。由10ml懸浮物在中長柱中生成的細(xì)胞堆疊的重量為 3g，直徑為1. 4cm，高度為3. 6cm，密度為0· 54g/cm3。
[0159] 通過將農(nóng)桿菌懸浮物移液到細(xì)胞堆疊（lml/g細(xì)胞堆疊）上而將該細(xì)胞堆疊浸潤 在柱中。為了實(shí)現(xiàn)完全浸潤，施加短暫真空直到第一滴液滴離開柱，但細(xì)胞堆疊的頂部仍被 懸浮物覆蓋。在22°C培育該浸潤的細(xì)胞堆疊30分鐘后，通過對柱施加真空將剩余的液體完 全移除以恢復(fù)氣隙。所施加液體的移除通過測定處理過的柱狀堆積細(xì)胞的重量進(jìn)行控制。 為確保在后續(xù)培育期細(xì)胞的高存活能力，因細(xì)胞堆疊或細(xì)胞吸收液體而導(dǎo)致的重量增加優(yōu) 選不超過例如堆疊的原始新鮮細(xì)胞重量（FCW)的15%。該細(xì)胞堆疊均在26°C和92%相對 濕度下于柱中進(jìn)行培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染5天后，如實(shí)施例1所述地從細(xì)胞堆疊中提取全部可 溶性蛋白。
[0160] 在所有浸潤的細(xì)胞堆疊中均可肉眼觀察到熒光蛋白的表達(dá)（圖9)，這表明細(xì)胞堆 疊中不同的細(xì)胞隔室可用于生產(chǎn)重組蛋白。該細(xì)胞堆疊表現(xiàn)出均勻的熒光，意味著農(nóng)桿菌 被有效地傳遞到細(xì)胞堆疊的各個(gè)區(qū)域。根據(jù)目標(biāo)隔室，積累水平方面觀察到明顯的差異，范 圍為約40 μ g/gFCW(質(zhì)體靶向DsRed)?約160 μ g/g FCW(胞漿DsRed)(圖9C)。靶向到蛋 白體的DsRed在體內(nèi)顯示出高熒光，但由于蛋白體的不溶性而無法提取。DsRed和GFP (圖 9A8和圖9B8)的同時(shí)表達(dá)表明能夠用兩個(gè)分開的農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行共感染。細(xì)胞堆疊的大 小（微柱：〇. 3g或14ml柱：3g)對表達(dá)水平?jīng)]有影響。因此，可以設(shè)想微細(xì)胞堆疊對篩選和 分析目的非常有用，例如，確定大規(guī)模生產(chǎn)（例如預(yù)培養(yǎng)、感染和共培養(yǎng)條件）的最優(yōu)參數(shù)， 評價(jià)不同的表達(dá)構(gòu)建體或者開發(fā)和研究代謝途徑。由于細(xì)胞堆疊的高均勻性，所以對統(tǒng)計(jì) 設(shè)計(jì)和多元實(shí)驗(yàn)特別有用。為了高通量分析，可使用與自動(dòng)系統(tǒng)兼容的96孔過濾板（例如 Receiver plate20 μ m，ChlOmaborid.A.MULTigGfilter plate，均為 MACHEREY-NAGEL，德 國）。這些過濾板的孔類似于本實(shí)施例中用于生成和浸潤細(xì)胞堆疊的微柱。與96孔板中懸 浮培養(yǎng)物內(nèi)的高通量分析相比，微細(xì)胞堆疊具有瞬時(shí)表達(dá)更有效的優(yōu)點(diǎn)（見實(shí)施例1)，并 且能夠?qū)⒏嗟纳镔|(zhì)用于分析。除了上面所用的柱，也對更大的柱進(jìn)行了測試（圖10)。 在 70ml 柱（GenElute? HP Plasmid Midiprep Kit filter syringe，US Sigma 公司）中 12g 細(xì)胞堆疊（2. 8cm直徑，3. 5cm高度）內(nèi)、和在150ml柱（Chromabond?聚丙烯柱150ml， MACHEREY-NAGEL，德國）中87g細(xì)胞堆疊（3·7cm直徑，llcm高度）內(nèi)，農(nóng)桿菌感染4天后 觀察DsRed的表達(dá)。該12g細(xì)胞堆疊由4日齡的BY-2懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生并用攜帶質(zhì)體靶向 DsRed的表達(dá)構(gòu)建體的農(nóng)桿菌浸潤（圖2B)。87g細(xì)胞堆疊由11日齡的培養(yǎng)物產(chǎn)生并用攜 帶ER-保留DsRed的表達(dá)構(gòu)建體的農(nóng)桿菌浸潤（圖1B)。與上述標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一差別是87g 細(xì)胞堆疊用0D0. 25的農(nóng)桿菌懸浮物浸潤。通過稱重確定細(xì)胞堆疊的密度，并確認(rèn)移除了足 夠的液體以還原氣隙。不同的實(shí)驗(yàn)還表明不同年齡（即繼代培養(yǎng)后幾天）的細(xì)胞適合于產(chǎn) 生本發(fā)明的細(xì)胞堆疊。而且，不同形狀和尺寸的細(xì)胞堆疊也是可以的。這個(gè)例子表明在無 菌可控條件下改變和培育較大的細(xì)胞堆疊也是可行的。區(qū)別于通常不是無菌的基于葉片的 體系。
[0161] 實(shí)施例5
[0162] 增加通氣對瞬時(shí)蛋白生產(chǎn)的影響
[0163] 為調(diào)查通氣對轉(zhuǎn)化的堆疊細(xì)胞性能的影響，對不同設(shè)置進(jìn)行了測試：（1)主動(dòng)通 氣的細(xì)胞堆疊，（2)被動(dòng)通氣的細(xì)胞堆疊，（3)帶中央通風(fēng)道的細(xì)胞堆疊，（4)在穿孔柱中的 細(xì)胞堆疊（圖11A)。
[0164] 如實(shí)施例1所述，在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長并準(zhǔn)備攜帶二元載體pTRAp-2G12FER_Ds的農(nóng) 桿菌菌株（圖2B)。
[0165] 在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長的4. 5日齡的BY-2懸浮細(xì)胞被用于在14ml的細(xì)長柱中生成 細(xì)胞堆疊（實(shí)施例4)。在實(shí)驗(yàn)1、2、4中，生成固體細(xì)胞堆疊，穿孔柱用parafilm?密封。 在實(shí)驗(yàn)3中，直徑2. 5mm的塑料棒被放置在柱的中心。該細(xì)胞堆疊的直徑為1. 4cm，重量為 2. 1?2. 5g，高度為2. 5?2. 7cm，密度約為0. 57g/cm3。在用農(nóng)桿菌懸浮物浸潤并移除液 體（實(shí)施例4)后，從柱3移除棒，從柱4移除parafilm?，以提供帶中央空氣通道的細(xì)胞 堆疊和從側(cè)方額外供給空氣的細(xì)胞堆疊。這些柱在恒溫箱中于26°C、92%RH進(jìn)行培養(yǎng)。柱 1被連接于抽氣泵，該抽氣泵被放置在培養(yǎng)箱內(nèi)以供給26°C、92% RH的空氣。泵的容量為 501/小時(shí)，并設(shè)定為周期性抽吸（開啟15分鐘，關(guān)閉45分鐘）。農(nóng)桿菌感染6天后，測定 該細(xì)胞堆疊的重量，并從細(xì)胞堆疊中提取可溶性蛋白，對DsRed和2G12抗體的表達(dá)進(jìn)行分 析（如實(shí)施例1所述）。因?yàn)榧?xì)胞堆疊的不同重量損失，基于在培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)的FCW 計(jì)算DsRed和抗體2G12的量（圖11C)。結(jié)果表明，由強(qiáng)制通氣（圖11C1)或增加的表面 (圖11C4)引起的蒸發(fā)所致水分損失，對堆疊細(xì)胞的生產(chǎn)率產(chǎn)生不利影響。在重量損失超過 20 %的細(xì)胞中，質(zhì)體靶向DsRed的積累以及ER-保留抗體的積累都降低。因此，應(yīng)當(dāng)使用最 大限度地減少了細(xì)胞堆疊的干燥（例如通過增加相對濕度或?qū)?xì)胞堆疊進(jìn)行加濕）的培養(yǎng) 條件。另一方面，結(jié)果顯示，在該范圍內(nèi)，通氣是充足的，且不需要用于改善氧氣供應(yīng)和氣體 交換的措施。
[0166] 實(shí)施例6
[0167] 從堆疊的細(xì)胞中無損地收獲分泌的產(chǎn)品
[0168] 為確定是否可以不破壞細(xì)胞地洗脫重組分泌蛋白，將BY-2懸浮細(xì)胞堆疊在柱中， 并通過農(nóng)桿菌感染瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。包含用于分泌型單克隆抗體M12的表達(dá)構(gòu)建體以及ER-保留 DsRed(圖2C)、分泌型DsRed(圖1A)、ER-保留DsRed(圖1B)和蛋白體形成DsRed(圖IE) 的不同農(nóng)桿菌菌株被分別用于實(shí)驗(yàn)。M12抗體（150kDa)和DsRed(108kDa)是大分泌蛋白的 例子。因?yàn)镋R-保留DsRed是細(xì)胞內(nèi)的，所以適合控制以檢查是否植物細(xì)胞在培育或洗脫 時(shí)被破壞。不溶性蛋白體形成DsRed用作全細(xì)胞提取物的對照。
[0169] 在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長的11日齡的BY-2懸浮細(xì)胞（實(shí)施例1)被用于在柱中產(chǎn)生細(xì) 胞堆疊。將10ml懸浮培養(yǎng)物倒入裝備有20μπι聚乙烯玻璃過濾器的14ml聚丙烯柱（直徑 1. 4cm，高度9cm)中。將培養(yǎng)基通過真空過濾完全移除，通過將農(nóng)桿菌懸浮物移液到細(xì)胞堆 疊上（lml/g細(xì)胞堆疊）在柱內(nèi)將得到的細(xì)胞堆疊（重量=3g,直徑=1. 4cm,高度=3. 6cm, 密度=0.54g/cm3)浸潤。為了實(shí)現(xiàn)完全浸潤，施加短時(shí)真空直到第一滴液滴離開柱，但細(xì) 胞堆疊的頂部仍然覆蓋著懸浮物。在22°C培育該浸潤的細(xì)胞堆疊30分鐘，然后通過對柱施 加真空將剩余的液體完全移除以恢復(fù)氣隙。該細(xì)胞堆疊在柱中以26°C、92%相對濕度進(jìn)行 培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染5天后，用2倍體積的提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM亞硫 酸氫鈉，pH7. 5)從堆疊的細(xì)胞的200mg FCW樣品中提取總可溶性蛋白。為了只回收分泌的 蛋白質(zhì)，如下所述地對剩余的柱堆積細(xì)胞進(jìn)行清洗。對柱施加3ml緩沖液，并通過短時(shí)真空 將其吸入細(xì)胞堆疊。培養(yǎng)30分鐘后，通過真空收集緩沖液，并再次施加到細(xì)胞上。在連續(xù) 的三次清洗步驟后，回收到2. 7ml洗脫液，隨后實(shí)施離心澄清。對總提取蛋白制劑和可洗提 的蛋白質(zhì)在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的含量分析（圖12)。凝膠上 承載的蛋白量對應(yīng)于來自l〇mg細(xì)胞堆疊的總提取蛋白和來自20mg細(xì)胞堆疊的可洗提蛋白 質(zhì)?？贵w（圖12A)和DsRed(圖12B)的提取物和洗脫物中，該重組蛋白條帶的強(qiáng)度幾乎相 同。這意味著，在這兩種情況下，總共生產(chǎn)的重組蛋白的約50%可以被洗脫。但是在洗脫樣 品中，污染的宿主蛋白的量較低。
[0170] M12抗體的量通過表面等離子共振譜、用偶聯(lián)至傳感器芯片的蛋白A進(jìn)行定量，通 過熒光測定DsRed的量。約55% (96yg/g FCW)的總共生產(chǎn)的分泌型M12(175yg/g FCW) 和40 % (28 μ g/g FCW)分泌型DsRed (70 μ g/g FCW)被洗脫。洗脫樣品中總共生成的ER-保 留DSRed(120l·! g/g FCW)的只一小部分（小于1% )的存在表明該細(xì)胞在分泌蛋白的培養(yǎng) 過程中或洗脫過程中沒有損壞（也見圖12B)。
[0171] 當(dāng)使用植物葉片或整株植物瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)有技術(shù)方法時(shí)，分泌產(chǎn)物的選擇性制備 通過收集細(xì)胞間的清洗液在分析規(guī)模是可行的，但更大規(guī)模是不切實(shí)際的。因此，在大規(guī)模 下，必須從整個(gè)生物質(zhì)提取物中回收分泌的產(chǎn)品。因而，所期望的產(chǎn)物必須從宿主化合物 (例如蛋白質(zhì)、代謝物、木質(zhì)素、纖維素）的復(fù)雜混合物中進(jìn)行純化。特別是酚類化合物在 下游加工和純化方面是有問題的。就這方面而言，本發(fā)明克服了這些問題，因?yàn)榉置诘漠a(chǎn)品 可直接從細(xì)胞堆疊洗脫而不會(huì)破壞植物細(xì)胞，并且宿主化合物的污染最小。此外，由于可擴(kuò) 展性，細(xì)胞堆疊方法可以在大的產(chǎn)業(yè)規(guī)模下實(shí)施。可以想象的是，在優(yōu)化的洗脫和培養(yǎng)條件 下，從堆疊的細(xì)胞重復(fù)洗脫分泌的產(chǎn)物將獲得所期望產(chǎn)物的更高產(chǎn)率。
[0172] 實(shí)施例7
[0173] 通過代謝工程生產(chǎn)新的次級代謝物
[0174] 為了在細(xì)胞堆疊中建立一個(gè)新的生物合成途徑，普通煙草（N. tabacum)中不存在 的酶、即色氨酸脫羧酶（TDC ;EC 4. 1. 1. 28)在BY-2細(xì)胞堆疊中被瞬時(shí)表達(dá)。
[0175] TDC是催化通過1-色氨酸脫羧而生產(chǎn)原生物堿色胺的萜類吲哚生物堿生物合成 途徑中的早期步驟的胞質(zhì)酶。色胺是一組與治療相關(guān)的次生代謝物（例如來自長春花的抗 癌藥物長春堿和長春新堿）的共同前體。為了進(jìn)一步提高所希望的代謝物的產(chǎn)率，前體色 氨酸在第二步驟中轉(zhuǎn)化后提供給細(xì)胞堆疊。
[0176] 例如實(shí)施例4所述，4日齡的BY-2懸浮細(xì)胞被裝填在14ml柱中，提供2g FCW細(xì)胞 堆疊，密度為〇.58g/cm3。該細(xì)胞堆疊通過農(nóng)桿菌感染而瞬時(shí)轉(zhuǎn)化成兩份（in duplicate)。 與用于質(zhì)體靶向綠色熒光蛋白（GFP)(圖IF)、質(zhì)體靶向TDC (圖3A)或用于胞漿TDC (圖3B) 的植物表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101: :pMP90RK在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長（實(shí)施例 1)。
[0177] 將農(nóng)桿菌菌株離心沉淀而顆?；匦聭腋〔⒂山櫯囵B(yǎng)基調(diào)整至0D1。在應(yīng)用到 植物細(xì)胞堆疊之前，將該細(xì)菌懸浮物在22°C培育4小時(shí)。
[0178] 每個(gè)細(xì)胞堆疊用2ml農(nóng)桿菌懸浮物浸潤，在22°C培育30分鐘，抽真空干燥，再在 26°C、92%相對濕度條件下培養(yǎng)。在農(nóng)桿菌感染18小時(shí)后，將細(xì)胞堆疊再次用2ml色氨酸 溶液（50mM半濃縮浸潤培養(yǎng)基）或用2ml半濃縮浸潤培養(yǎng)基浸潤。在26°C將浸潤的細(xì)胞 堆疊培育30分鐘后，將溶液再次通過抽真空而完全移除，將柱狀填充的細(xì)胞放回培養(yǎng)倉。 在農(nóng)桿菌感染后69小時(shí)、91小時(shí)和112小時(shí)取樣約250mg FCW，并在-80°C儲存。根據(jù) RS Sangwan 等人的方法（''Direct f luorometry of phase-extracted tryptamine-based fast quantitative assay of 1-tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus leaf〃，Anal Biochem255:39 - 46,（1998))，稍作修改，提取和檢測色胺。
[0179] 簡言之，通過在2體積（v/w)提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM硫酸氫 鈉，pH7. 5)(參見實(shí)施例1)中實(shí)施超聲處理，從細(xì)胞樣品中提取水溶性化合物。將0. 9ml蒸 餾水加入到0. lml清澈提取物中后，加入2ml5M NaOH和3. 5ml乙酸乙酯。將該乳液通過渦 旋10秒進(jìn)行混合，并于4°C放置16小時(shí)使其相分離。通過使用Aminco Bowman AB2突光光 譜儀（Spectronic Instruments,羅徹斯特，紐約）對上層有機(jī)相進(jìn)行突光分析。在激發(fā)波 長為280nm和發(fā)射波長為350nm、激發(fā)光和發(fā)射光用狹縫寬度為4納米及光電倍增管電壓設(shè) 定為575V的條件下，對色胺熒光進(jìn)行測定。
[0180] 檢測到的色胺水平表明活性TDC被分別表達(dá)在質(zhì)體和胞液中（圖13)。所引入的 酶將內(nèi)源性色氨酸轉(zhuǎn)化成新的色胺物質(zhì)。將額外的色氨酸添加到瞬時(shí)TDC表達(dá)細(xì)胞使得色 胺的生產(chǎn)明顯增加（5倍于質(zhì)體靶向TDC，接近10倍于胞漿TDC)。
[0181] 這個(gè)例子還顯示本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)代謝物。此外，表明細(xì)胞堆疊不僅可以 被變化成例如產(chǎn)生酶（TDC)，而且在后續(xù)步驟中底物和/或前體可以很容易地供給到細(xì)胞 中以提高產(chǎn)物產(chǎn)率。因此，本發(fā)明還包括通過例如反復(fù)轉(zhuǎn)化、浸潤和培養(yǎng)步驟，將任何感興 趣的物質(zhì)傳遞到細(xì)胞內(nèi)以優(yōu)化產(chǎn)物形成（例如，額外的植物營養(yǎng)素、誘導(dǎo)劑、抑制劑）的可 能性。細(xì)胞代謝的操控可以在通過施加合適的化合物和基因的任意組合來傳遞遺傳信息的 期間、之前和/或之后進(jìn)行。
[0182] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到由野生型、突變的和/或轉(zhuǎn)基因的懸浮培養(yǎng)物制備的 細(xì)胞堆疊，也可以不進(jìn)行轉(zhuǎn)化就實(shí)施操控，即通過應(yīng)用不同的化合物。尤其是，這意味著指 天然存在的化合物的產(chǎn)率可通過使用本發(fā)明的細(xì)胞堆疊，并加入合適的底物、激素、抑制劑 和/或前體而提高。
[0183] 實(shí)施例8
[0184] 來自不同植物物種的懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞堆疊
[0185] 除了普通煙草BY-2懸浮細(xì)胞，還使用了其他幾種植物細(xì)胞懸浮物生產(chǎn)細(xì)胞堆疊。
[0186] 長春花
[0187] 將長春花細(xì)胞在 MS67 培養(yǎng)基（3%鹿糖，4. 4g/L Murashige&Skoog 鹽，0· 6mg/l 硫 胺素，0· 2mg/l激動(dòng)素，lmg/L2, 4-二氯苯氧乙酸，ρΗ5· 8)或在BY-2培養(yǎng)基（實(shí)施例1)中、 旋轉(zhuǎn)搖床（180rpm)上、于26°C在暗處進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞每周在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng) (20:100)。
[0188] 擬南芥
[0189] 將擬南芥細(xì)胞在ARA培養(yǎng)基（3%蔗糖，4. 4g/L Murashige&Skoog鹽，0· 5mg/L萘乙 酸，0· lmg/1激動(dòng)素，ρΗ5· 7)中、旋轉(zhuǎn)搖床（180rpm)上按16小時(shí)亮/8小時(shí)暗于26°C進(jìn)行 培養(yǎng)。將細(xì)胞每周在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（15:100)。
[0190] 本氏煙
[0191] 將本氏煙草的細(xì)胞在BY-2培養(yǎng)基（實(shí)施例1)中于26°C、在黑暗中、旋轉(zhuǎn)搖床 (180rpm)上進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞每周在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（20:100)。
[0192] 由各懸浮培養(yǎng)物制備不同形狀的細(xì)胞堆疊。實(shí)驗(yàn)使用4?5日齡的培養(yǎng)物。如實(shí) 施例1所述，生成不同厚度（〇. 2?0. 5cm)的餅干樣細(xì)胞堆疊。如實(shí)施例4所述，在14ml 的細(xì)長柱中制備高度約2?4cm的細(xì)胞堆疊。根據(jù)不同的植物物種，得到不同密度的細(xì)胞 堆疊。長春花細(xì)胞堆疊的密度通常為〇. 65?0. 75g/cm3,擬南芥細(xì)胞堆疊具有約0. 55? 0. 67g/cm3的密度，本氏煙草堆疊具有約0. 6?0. 7g/cm3的密度。
[0193] 浸潤了攜帶二元載體pTRAp-2G12FER-Ds的農(nóng)桿菌的長春花、擬南芥和本氏煙草 的細(xì)胞堆疊（圖2B)呈現(xiàn)出肉眼可見的DsRed表達(dá)。對于每個(gè)被測試的植物物種，也如實(shí) 施例1所述地通過表面等離子體共振譜證實(shí)了抗體2G12的產(chǎn)生。
[0194] 有趣的是，根據(jù)用于長春花懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，表達(dá)水平被觀察到有明顯的差 異。通過將由在MS67培養(yǎng)基中或BY-2培養(yǎng)基中與兩種不同的DsRed表達(dá)構(gòu)建體、即pTRAc rfp-AH和pTRAc rfp-ERH(圖ΙΑ、B)生長的細(xì)胞產(chǎn)生的長春花細(xì)胞堆疊轉(zhuǎn)化，進(jìn)行進(jìn)一步 的分析。分泌的DsRed和ER-保留DsRed在細(xì)胞中的積累都高得多，細(xì)胞是生長在BY-2培 養(yǎng)基中的細(xì)胞（圖14)。這表示預(yù)培養(yǎng)條件優(yōu)化對實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化和/或高產(chǎn)物合成的重要性。 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明可以應(yīng)用于來自不同物種的植物細(xì)胞。
[0195] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知培養(yǎng)條件（例如溫度、通氣、攪拌速度、光組成等）和/或培 養(yǎng)基組成（例如營養(yǎng)物質(zhì)、激素、pH、電導(dǎo)率、浸潤壓等）是植物懸浮培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)和生理 特征的決定因素。各因素的變化對后續(xù)步驟中植物細(xì)胞的性能有影響。這意味著培養(yǎng)條件 和/或培養(yǎng)基組成必須為任何生產(chǎn)而優(yōu)化。除了初始原料生產(chǎn)的優(yōu)化，浸潤參數(shù)（例如農(nóng) 桿菌濃度、接觸時(shí)間、浸潤培養(yǎng)基組成）和細(xì)胞堆疊的培養(yǎng)條件（例如時(shí)間、溫度、通氣、送 料、添加劑的應(yīng)用）必須為任何植物細(xì)胞株和任何產(chǎn)品而優(yōu)化。
[0196] 實(shí)施例9
[0197] 使用堆疊細(xì)胞作為病原體培養(yǎng)的底物
[0198] 使用在標(biāo)準(zhǔn)條件（實(shí)施例1)下成長的50ml4日齡BY-2培養(yǎng)物生成3. 64ml細(xì)胞 堆疊（重量=28，直徑=5.5〇11，高度=0.15〇11，密度=0.558/〇11 3)。將細(xì)胞堆疊放置在 空培養(yǎng)皿中，并用lml浸潤培養(yǎng)基（50g/l鹿糖，2g/l葡萄糖，0· 5g/l Ferty2Mega(Planta DUngemittel，德國），pH5. 3)浸潤，該浸潤培養(yǎng)基完全被細(xì)胞堆疊（細(xì)胞堆疊的重量=3g ; 密度= 0.825g/cm3)吸收。發(fā)現(xiàn)該體積量（即，小于或等于lml/2g細(xì)胞堆疊）有利于在培 養(yǎng)皿中開始細(xì)胞堆疊的培育，因?yàn)闅庀赌軌蛟趲仔r(shí)內(nèi)再生。通過控制測量因蒸發(fā)而減少 至小于〇. 6g/cm3的細(xì)胞堆疊的密度得到證實(shí)。重要的是，更大量的液體（即超過lml/2g細(xì) 胞堆疊）是高度不利的，因?yàn)檫^量的液體使得氣隙不能被重新構(gòu)建，結(jié)果使得細(xì)胞堆疊的 密度太高以至無法適當(dāng)?shù)鼐S持細(xì)胞的生存能力或防止細(xì)胞死亡。
[0199] 下一個(gè)處理步驟包括將小體積的四種不同的曲霉種的孢子懸浮物20 μ 1點(diǎn)在細(xì) 胞堆疊的表面（圖15, A-D)。將細(xì)胞堆疊培養(yǎng)11天，然后拍攝照片（圖15)。
[0200] 這個(gè)例子顯示植物細(xì)胞堆疊可以被用作不同曲霉種的成長底物。曲霉被選擇作為 植物病原體的代表，也可作為人類和動(dòng)物病原體的代表。
[0201] 在這個(gè)例子中，由野生型BY2懸浮細(xì)胞制備細(xì)胞堆疊，以便隨后培養(yǎng)真菌。本領(lǐng)域 技術(shù)人員理解也可使用轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞。特別是，可以使用生產(chǎn)抗真菌肽、蛋白質(zhì)或化合物 的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞堆疊，研究它們對真菌的生長和發(fā)育的影響。同樣，由野生型細(xì)胞生成的細(xì)胞 堆疊可以先經(jīng)轉(zhuǎn)化處理，然后用于研究產(chǎn)品對真菌病原體成長的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員還 可接受本方法也可用于研究抗細(xì)菌化合物的影響。在下述實(shí)施例11中描述了細(xì)胞堆疊在 高通量篩選應(yīng)用中的多滴定板中的使用，顯而易見的是這些實(shí)施例也可以進(jìn)行組合。
[0202] 實(shí)施例10
[0203] 從由轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞株生成的細(xì)胞堆疊中非破壞性地收獲分泌產(chǎn)物
[0204] 在用分泌型單克隆抗體M12與ER-保留DsRed的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化后，生成轉(zhuǎn)基因 BY2懸浮培養(yǎng)物（圖2C)。在含有卡那霉素的板上選擇后，轉(zhuǎn)基因愈傷組織被轉(zhuǎn)移到液體培 養(yǎng)基中，以建立高度均勻的懸浮培養(yǎng)物。懸浮培養(yǎng)物通過每周將4 %的懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新 鮮液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（實(shí)施例1)。
[0205] 將5日齡的懸浮培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞收集用于生成本發(fā)明公開的細(xì)胞堆疊或者將 細(xì)胞進(jìn)一步在懸浮培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞堆疊和懸浮培養(yǎng)物再培養(yǎng)4天。如實(shí)施例6 所述，例如使用14ml聚丙烯柱制備2g FCW(新鮮細(xì)胞重量）的細(xì)胞堆疊。再次，仔細(xì)地監(jiān) 視氣隙的構(gòu)建，并通過測量移除了液體培養(yǎng)基的鑄型細(xì)胞堆疊的密度，在整個(gè)培育/培養(yǎng) 中進(jìn)行控制。最終，在26°C培育細(xì)胞堆疊的過程中始終確保90%的相對濕度，以防止細(xì)胞 堆疊內(nèi)的細(xì)胞干燥。
[0206] 細(xì)胞堆疊或得自（通過真空過濾從培養(yǎng)基中分離出來的）懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞的 400mg FCW樣品的總可溶性蛋白用2倍體積的提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM 亞硫酸氫鈉，pH7. 5)提取。
[0207] 從柱狀堆疊細(xì)胞中分泌的抗體通過用提取緩沖液（實(shí)施例6)清洗該柱狀堆疊細(xì) 胞而回收。簡言之，2ml緩沖液施加到2g柱中，通過短時(shí)真空被細(xì)胞堆疊吸收。培育30分 鐘后，通過抽真空收集緩沖液,并再次施加到細(xì)胞上。在連續(xù)三次清洗后，回收到1. 6ml洗 脫液。從原始懸浮培養(yǎng)基中收集到的樣品被用于比較。
[0208] 在（通過胺耦合固定的）蛋白A表面，通過SPR測定抗體濃度，采用在CH0細(xì)胞中 產(chǎn)生的純化人抗體H10作為標(biāo)準(zhǔn)。所有樣品均在劑量-反應(yīng)曲線的線性范圍內(nèi)進(jìn)行分析。 DsRed通過使用DsRed標(biāo)準(zhǔn)由突光進(jìn)行確定。
[0209] 盡管懸浮培養(yǎng)物已達(dá)到高細(xì)胞生物質(zhì)，但是在懸浮培養(yǎng)物的上清液中沒有檢測到 抗體。因此，分泌的重組產(chǎn)物的部分為0%。M12抗體的細(xì)胞內(nèi)積累為4.02 μ g/g FCW轉(zhuǎn)基 因BY2懸浮細(xì)胞。因此，總收率（細(xì)胞上清液中的抗體加上細(xì)胞內(nèi)的抗體）也是4. 02g/g。
[0210] 相比之下，M12的總收率達(dá)到11.4yg/g細(xì)胞堆疊，這相當(dāng)于總收率大幅提高了 284%。重要的是，可以從細(xì)胞堆疊中洗脫分泌的抗體。分泌產(chǎn)物的收率是1.4yg M12抗 體/g細(xì)胞堆疊，對當(dāng)于總收率的12%。
[0211] 該實(shí)施例表明可以從轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物生成的細(xì)胞堆疊中得到重組蛋白產(chǎn)物，并 且與對照的懸浮細(xì)胞相比，收率顯著提高284%。
[0212] 與在懸浮物（分別為5. 2 μ g/g FCW和3. 0 μ g/g FCW)中的細(xì)胞相比，在細(xì)胞堆疊 的細(xì)胞中ER-保留DsRed的產(chǎn)率提高70%。
[0213] 這個(gè)例子還清楚地表明，以細(xì)胞堆疊的形式培育轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞不僅允許產(chǎn)品以 濃縮的形式被收集（相對于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物上清液），該形式對下游加工（包括加工時(shí)間和 成本均降低）非常有利。
[0214] 重要的是，細(xì)胞堆疊也提供了使用與細(xì)胞培養(yǎng)基不同的緩沖液來最大限度洗脫產(chǎn) 品（此處為自細(xì)胞分泌的重組靶蛋白）的極好切入點(diǎn)，因此細(xì)胞堆疊給懸浮細(xì)胞提供了額 外的好處。懸浮培養(yǎng)物的上清液含有比柱狀堆疊細(xì)胞洗脫液更大量的多糖。優(yōu)選多糖量低， 因?yàn)槟z狀多糖阻礙像過濾和超濾這種下游流程。
[0215] 此外，對于根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊，所收獲的被分泌的重組蛋白的百分比 從〇% (懸浮細(xì)胞）顯著增加至12% (。
[0216] 最后，本實(shí)施例表明在細(xì)胞堆疊中的總收率與作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的相同細(xì)胞相比 也顯著增加。
[0217] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還將容易地理解，這種方法不限定于由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)和/或分 離重組蛋白質(zhì)，也同樣適用于在非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或其他感興趣的產(chǎn)品中產(chǎn)生次級代 謝物，包括（但不限于）初級代謝物、纖維、寡糖和多糖（纖維素、淀粉、半纖維素、木聚糖、 果聚糖等）、天然肽和蛋白質(zhì)、色素、維生素、香料、水果酸或植物細(xì)胞的任何其他產(chǎn)品。
[0218] 實(shí)施例11
[0219] 使用在多滴定板中產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊
[0220] 使用在板的底部含有液體可滲透性過濾器的多滴定板（Receiver plate20 μ m(No. 740686. 4)，MACHEREY-NAGEL，德國），如上所述地生成細(xì)胞堆疊。
[0221] 在接收板（Receiver plate)的每個(gè)孔中鑄型1ml野生型（非轉(zhuǎn)基因）煙草BY2 懸浮培養(yǎng)物，生成96個(gè)微小細(xì)胞堆疊。使用NucleoVac96真空歧管（MACHEREY-NAGEL，德 國），通過抽真空將液體培養(yǎng)基完全移除。用顯微鏡分析0. 2g所得細(xì)胞堆疊是否存在氣隙， 使用獨(dú)立的對照實(shí)驗(yàn)，確定所得細(xì)胞堆疊的密度小于〇. 7g/cm3。
[0222] 對每個(gè)細(xì)胞堆疊施加0.8ml攜帶編碼抗體M12(圖2C)或抗體2G12(圖2A)的pTRA 質(zhì)粒的重組根癌農(nóng)桿菌懸浮物（0D600nm = 0. 1)。對每個(gè)抗體表達(dá)構(gòu)建體，浸潤32微小細(xì) 胞堆疊。30分鐘后，移除任何液體，重新構(gòu)建氣隙并重新建立密度小于0. 7g/cm3的細(xì)胞堆 疊。在多滴定板中的細(xì)胞堆疊然后在25°C、90%相對濕度下培養(yǎng)4天。然后，收獲細(xì)胞堆 疊，并提取重組抗體（實(shí)施例1)。在蛋白-A表面，使用Biac 〇reT200儀器（T = 25°C，電泳 緩沖液=HBS-EP)，通過表面等離子體共振測量對32個(gè)樣品針對每個(gè)抗體測定抗體濃度， 以確定平均抗體濃度和變異系數(shù)（CV)。
[0223] 抗體M12的平均收率為117. 8± 14. 4 μ g/g細(xì)胞堆疊，變異系數(shù)是12. 2%。抗體 2G12的平均收率為32. 3 ±3. 6 μ g/g細(xì)胞堆疊，變異系數(shù)是11. 1%。
[0224] 這些對生物測定來說都是優(yōu)良值，并清楚地說明了基于根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)胞堆 疊的分析的優(yōu)異的再現(xiàn)性和魯棒性。
[0225] 這也說明了細(xì)胞堆疊的不同的尺寸和幾何形狀可用于不同的應(yīng)用，該實(shí)驗(yàn)表明細(xì) 胞堆疊可以以多滴定板形式生成，這有利于高分辨率的高通量應(yīng)用。
[0226] 此外，同樣清楚的是多滴定板形式的細(xì)胞堆疊可以以與在柱中鑄型的情況相同或 類似的方式操作或處理，包括分泌的或細(xì)胞外的產(chǎn)物的洗脫，以用于后續(xù)的定量或分析。
[0227] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)細(xì)胞堆疊還可以用于分析目的。例如，可以使由轉(zhuǎn)基因懸 浮培養(yǎng)物生成的細(xì)胞堆疊或與用于重組抗體、包括（但不限于）例如抗體融合蛋白對纖維 素結(jié)合蛋白、或連接到或集成到細(xì)胞膜（質(zhì)膜）的重組抗體的基因一同轉(zhuǎn)化的細(xì)胞堆疊與 包含連接到抗體上的物質(zhì)的溶液（樣品）接觸。此處，細(xì)胞堆疊的多孔性又是一個(gè)明顯的 優(yōu)勢，因?yàn)榇篌w積可以很容易地使細(xì)胞堆疊通過以提高靈敏度。此外，顯而易見的是清洗步 驟、緩沖液交換和酶標(biāo)抗體的應(yīng)用或其它檢測試劑可以很容易地應(yīng)用，并從細(xì)胞堆疊中移 除。在最后的步驟中，底物可應(yīng)用于，然后酶促轉(zhuǎn)化為可測量的產(chǎn)物，以揭示該物質(zhì)的存在 和濃度。
[0228] 實(shí)施例12
[0229] 從野生型細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞堆疊中回收內(nèi)源蛋白
[0230] 將5日齡的BY-2野生型懸浮培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞收集用于生成細(xì)胞堆疊或?qū)⒓?xì)胞 進(jìn)一步在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)。細(xì)胞堆疊和懸浮培養(yǎng)物都再培養(yǎng)4天。如實(shí)施例6所述，使 用14ml聚丙烯柱制備2. 5g FCW(新鮮細(xì)胞重量）的細(xì)胞堆疊。移除液體后，將細(xì)胞堆疊 在26°C以90%相對濕度進(jìn)行培育。5日齡的BY-2懸浮培養(yǎng)物進(jìn)一步在26°C于旋轉(zhuǎn)搖床上 以180rpm進(jìn)行培養(yǎng)。4天后，收獲分泌的蛋白。如實(shí)施例6所述，通過用2.5ml緩沖液清 洗堆疊而從細(xì)胞堆疊中收獲分泌的蛋白質(zhì)。通過使用真空過濾從培養(yǎng)基中移除細(xì)胞，從9 日齡的懸浮培養(yǎng)物中收獲分泌的蛋白。洗脫的或分泌的蛋白的25μ 1樣品在考馬斯染色的 SDS-PAGE凝膠上分析（圖16)。這個(gè)例子表明，分泌的天然蛋白質(zhì)可以從根據(jù)本發(fā)明生成 和培育的細(xì)胞堆疊中回收。凝膠上的各條帶代表不同的天然蛋白質(zhì)。凝膠分析也顯示，細(xì) 胞堆疊中的細(xì)胞和懸浮物中的細(xì)胞之間，分泌的天然蛋白的數(shù)量和種類是不同的。在細(xì)胞 堆疊的細(xì)胞（圖16,由箭頭表示）中，某些天然蛋白的分泌顯著增加。
[0231] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也將很容易地理解，該方法不限定于從植物細(xì)胞中回收天然蛋白 質(zhì)，也同樣適用于其它感興趣的內(nèi)源性產(chǎn)品，包括次級代謝物、初級代謝物、纖維、寡糖和多 糖（纖維素、淀粉、半纖維素、木聚糖、果聚糖等）、天然肽和蛋白質(zhì)、色素、維生素、香料、水 果酸或植物細(xì)胞的任何其它產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可由選自廣泛的植物物種的懸 浮細(xì)胞生成該細(xì)胞堆疊，包括但不限于長春花、紅豆杉、甜菊和青蒿。
【權(quán)利要求】
1. 一種去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的、非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料的產(chǎn)生 和所述細(xì)胞堆疊的后續(xù)維持的方法，該方法包括下述步驟：（i)通過從植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 物中分離細(xì)胞而提供具有多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞堆疊，其中，使細(xì)胞堆疊所包含的液體的含量降 低并調(diào)整為相當(dāng)于0. lg?0. 9g濕細(xì)胞重量/cm3的細(xì)胞堆疊密度，從而建立所述細(xì)胞堆疊 的去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，以及（ii)將去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的所述細(xì)胞堆 疊在非液體環(huán)境中以50?100%的相對濕度進(jìn)行培育。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，使細(xì)胞堆疊所包含的液體的含量降低并調(diào)整為 相當(dāng)于在0. 2g?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3之間的細(xì)胞堆疊密度，優(yōu)選在0. 4g?0. 8g濕細(xì) 胞重量/cm3之間的細(xì)胞堆疊密度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，培養(yǎng)步驟（ii)是在沒有將去除了培養(yǎng)基且 多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞堆疊放置在維持培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基上或者沒有接觸維持培養(yǎng)基或生長 培養(yǎng)基的情況下實(shí)施的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，從所述植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中分 離的細(xì)胞是天然的或轉(zhuǎn)基因的，并且能夠積累所期望的產(chǎn)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以積累 所述所期望的產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在進(jìn)入步驟（ii)前，將步驟（i)所提供的細(xì)胞 堆疊所包含的細(xì)胞與至少一個(gè)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體包含至少一種異源核酸序 列，所述至少一種異源核酸序列編碼所期望的產(chǎn)物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（ii)包括積累和收獲所期 望的產(chǎn)物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，所期望的產(chǎn)物選自天然和異源蛋 白質(zhì)或多肽、次生代謝物、標(biāo)記物和分析/診斷結(jié)果。
9. 一種去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料，密度在 0. lg?0. 9g濕細(xì)胞重量/cm3之間、優(yōu)選在0. 2g?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3之間、最優(yōu)選在 0. 4g?0. 8g濕細(xì)胞重量/cm3之間，是由權(quán)利要求1?8中的任一項(xiàng)所述的方法獲得的或 可由權(quán)利要求1?8中的任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
10. -種去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料，密度 在0. lg?0. 9g濕細(xì)胞重量/cm3之間、優(yōu)選在0. 2g?0. 85g濕細(xì)胞重量/cm3之間、最優(yōu)選 0· 4g?0· 8g濕細(xì)胞重量/cm3之間。
11. 由權(quán)利要求1?8中的任一項(xiàng)所述的方法獲得的或可由權(quán)利要求1?8中的任一 項(xiàng)所述的方法獲得的、去除了培養(yǎng)基且多孔結(jié)構(gòu)的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材 料或權(quán)利要求9或10所述的植物細(xì)胞材料在分析或診斷方面的應(yīng)用。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中，細(xì)胞堆疊所包含的細(xì)胞在待分析或診斷的生 物或者待分析或診斷的物質(zhì)的存在下進(jìn)行。
13. -種診斷工具，包括由權(quán)利要求1?8中的任一項(xiàng)所述的方法獲得的或可由權(quán)利要 求1?8中的任一項(xiàng)所述的方法獲得的、或權(quán)利要求9或10所述的、去除了培養(yǎng)基且多孔 結(jié)構(gòu)的非組織多層細(xì)胞堆疊形式的植物細(xì)胞材料。
【文檔編號】C12P21/02GK104093845SQ201380007428
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】托馬斯·拉德馬赫爾 申請人:弗勞恩霍夫應(yīng)用研究促進(jìn)協(xié)會(huì)