專利名稱：氣體循環(huán)培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物細(xì)胞工程范疇，涉及一種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中用反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)植物細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物合成的一種方法。
植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用于生產(chǎn)植物細(xì)胞的初生產(chǎn)物(包括細(xì)胞本身)和次生代謝產(chǎn)物，可廣泛用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、香料等的生產(chǎn)，且有生產(chǎn)周期短、不受地理環(huán)境、氣候、病蟲害影響等優(yōu)點(diǎn)，目前正受到人們的重視。
由于人們對(duì)于植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究，特別是植物細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)技術(shù)的研究尚不充分，各種植物細(xì)胞由于自身特性的不同，所需培養(yǎng)條件也有差異，使植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)變得更為復(fù)雜，應(yīng)用進(jìn)展較慢。目前，阻礙植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的關(guān)鍵問題是隨著反應(yīng)器培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯下降。盡管人們嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，使擴(kuò)大培養(yǎng)中的溫度、PH值、營(yíng)養(yǎng)成份、激素濃度等與小規(guī)模懸浮培養(yǎng)中保持不變，供氣等條件盡量按比例擴(kuò)大，但仍不能解決這個(gè)問題。
本申請(qǐng)人通過實(shí)踐，認(rèn)為出現(xiàn)上述問題與植物細(xì)胞培養(yǎng)中的氣相成份有密切的關(guān)系。植物細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝過程中需不斷吸收氧氣、放出二氧化碳以及一些極微量的氣相成份如乙烯等，甚至還可能有一些人們尚不了解的、可能參與胞間信息傳遞的成份，這些植物細(xì)胞培養(yǎng)中釋放的氣體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，人們還了解得很少。
現(xiàn)有培養(yǎng)植物細(xì)胞反應(yīng)器的氣相運(yùn)行圖(見

圖1)，罐體2上的出氣口3通過管道接有冷凝器4，罐體上的進(jìn)氣口1通過膠管接有滅菌過濾器7和氣體流量計(jì)6，氣體流量計(jì)6上有供氣入口?，F(xiàn)有的反應(yīng)器培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法都是在反應(yīng)器進(jìn)氣口1加入新鮮氣體，另一方面又在出氣口3將尾氣排出。這種氣體運(yùn)行方式主要考慮了植物細(xì)胞對(duì)氧的需求，而忽略了排出氣體中帶走的植物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的各種氣相成份對(duì)培養(yǎng)的影響。
應(yīng)用氣體循環(huán)方式進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，氣相中氧氣的濃度有所下降，而二氧化碳的濃度有所上升，相信同二氧化碳一塊釋放的氣體如乙烯，以及那些可能傳遞信息的氣相的濃度也在積累上升，由此產(chǎn)生氣體成份的組成與比例的變化，可對(duì)培養(yǎng)植物細(xì)胞次生產(chǎn)物的產(chǎn)量及細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生有利的影響。經(jīng)改進(jìn)的反應(yīng)器中，氧濃度和二氧化碳濃度可按要求進(jìn)行調(diào)控。
本發(fā)明的目的就是提供一種將反應(yīng)器的出氣口排出的氣體重新循環(huán)利用，從而促進(jìn)植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物合成的方法。
本發(fā)明可由如下方式來實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器的出氣口排出的氣體通過導(dǎo)管導(dǎo)入反應(yīng)器中，形成氣體循環(huán)。反應(yīng)器上的冷凝器與氣體流量計(jì)之間通過導(dǎo)管接有氣泵。氣泵之前接有氣體混合室和排空口。
本發(fā)明可根據(jù)培養(yǎng)植物細(xì)胞的需要，再通過導(dǎo)管串接氣壓平衡室及氣體混合室，氣壓平衡室與氣體混合室之間可加接單向閥，實(shí)現(xiàn)適時(shí)、適量地補(bǔ)充所需的氣體。
本發(fā)明考慮了排出氣體中帶走的氣體成份的作用，通過改進(jìn)反應(yīng)器的氣相運(yùn)作方式，克服了原培養(yǎng)方法中由于供給的補(bǔ)充氣體在培養(yǎng)液中的溶解交換不充分，供給的氣體絕大部分經(jīng)排氣口排入大氣而未得充分利用，并帶走了細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的氣相成份的缺點(diǎn)。本發(fā)明將植物細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)反應(yīng)器的出氣口排放到空氣中的氣體全部或部分再次導(dǎo)入反應(yīng)器中，并適時(shí)、適量地補(bǔ)充所需氣體，可根據(jù)需要維持或調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的氣相環(huán)境，改善、優(yōu)化細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物生產(chǎn)的條件。
下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述圖1為現(xiàn)有培養(yǎng)植物細(xì)胞反應(yīng)器的氣相運(yùn)行示意圖。
圖2為本發(fā)明培養(yǎng)植物細(xì)胞反應(yīng)器氣相運(yùn)行示意圖。
圖3為用兩種反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖4為用兩種反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)紫杉醇累積的影響。
請(qǐng)閱圖2，在現(xiàn)有培養(yǎng)植物細(xì)胞的反應(yīng)器(罐體2的出氣口3通過膠管接有冷凝器4，罐體2的進(jìn)氣口1通過膠管接有滅菌過濾器7和氣體流量計(jì)6，氣體流量計(jì)6上有供氣入口)的基礎(chǔ)上，冷凝器4與氣體流量計(jì)6的供氣口之間通過膠管接有循環(huán)氣泵5。
另外，在冷凝器4之后可依次接入帶有一定阻力的通大氣的排空口和補(bǔ)入其它補(bǔ)充氣體的氣體混合室，在氣體混合室的補(bǔ)氣口可按需適時(shí)、適量地補(bǔ)入各種氣體(氧氣等)，而帶阻力的排空口讓與補(bǔ)充氣體等量的循環(huán)氣體自動(dòng)排出，并讓反應(yīng)器保持一定的壓力，從而，可控制反應(yīng)器的出氣口3排出的氣體全部或部分通過膠管重新導(dǎo)入反應(yīng)器中，形成氣體循環(huán)，用于培養(yǎng)植物細(xì)胞。
下面介紹應(yīng)用兩種反應(yīng)器培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)材料供試材料是經(jīng)20次繼代培養(yǎng)的中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，采用B5基本培養(yǎng)基，添加5mg/L NAA、0.1mg/L 6-BA及4％蔗糖，培養(yǎng)基PH值調(diào)至5.8。
2、實(shí)驗(yàn)方法在氣相運(yùn)行方式為本發(fā)明的循環(huán)式的反應(yīng)器(自制，工作體積1升)中接種新鮮中國紅豆杉細(xì)胞，接種量為8g/L(干重，25℃黑暗中培養(yǎng)，每隔3天取樣一次，測(cè)定各種指標(biāo)。以同類型的氣升式反應(yīng)器(現(xiàn)有反應(yīng)器，工作體積1升，通氣方式為不循環(huán)，通氣量0.3VVm，其它條件一樣)中的培養(yǎng)結(jié)果作對(duì)照。
(1)、細(xì)胞干重的測(cè)定取樣后，將懸浮培養(yǎng)物用120目篩過濾，濾液用三角瓶盛好，待用；細(xì)胞用蒸餾水洗干凈，滴干后置60℃烘干，稱重。
(2)、紫杉醇的提取與檢測(cè)量取培養(yǎng)液，用二氯甲烷(體積比為1∶1)萃取三次，合并后回收二氯甲烷，殘?jiān)蒙倭考状既芙?、定容。另外，稱取0.25克干細(xì)胞樣品(研細(xì)，過80目篩)，用30ml甲醇浸提過夜，并超聲15分鐘，靜置后收集上層清液，重復(fù)3次。合并甲醇后回收，殘?jiān)谜麴s水洗三次，洗液用相同體積的二氯甲烷萃取，其它操作同培養(yǎng)液的萃取。定容后的樣品由本所化學(xué)室檢測(cè)。樣品檢測(cè)采用Waters HPLC系統(tǒng)流動(dòng)相為甲醇—乙腈—水(29∶27∶44)；流速1.0ml/分鐘檢測(cè)波長(zhǎng)227nm。標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)、兩種反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
從圖3中可以看出對(duì)照組細(xì)胞的最終收獲量為18g/L(干重)，試驗(yàn)組細(xì)胞的最終收獲量為33g/L(干重)，說明反應(yīng)器氣相運(yùn)行方式為循環(huán)式的更有利于紅豆杉細(xì)胞的生長(zhǎng)。
(2)、兩種反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)紫杉醇累積的影響。
從圖4中可以看出紅豆杉細(xì)胞在用反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，對(duì)照組的紫杉醇最高含量為8.68mg/L(其中培養(yǎng)液中4.9mg/L，干細(xì)胞內(nèi)為0.021％)。試驗(yàn)組的紫杉醇最高含量為63.8mg/L(其中培養(yǎng)液中52.6mg/L，干細(xì)胞內(nèi)為0.034％)。說明反應(yīng)器氣相運(yùn)行方式為循環(huán)式的更有利于紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇的累積。
以上結(jié)果說明反應(yīng)器氣相運(yùn)行方式為循環(huán)式的，有利于紅豆杉細(xì)胞的生長(zhǎng)和紫杉醇的累積，與現(xiàn)有反應(yīng)器(氣相運(yùn)行方式為不循環(huán))相比，細(xì)胞的收獲量增加到1.8倍，目標(biāo)產(chǎn)物紫杉醇的產(chǎn)量提高到7.4倍。
權(quán)利要求
1.一種氣體循環(huán)培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法，其特征在于反應(yīng)器的出氣口(3)排出的氣體通過導(dǎo)管導(dǎo)入反應(yīng)器中，形成氣體循環(huán)。
2.依權(quán)利要求1所述的氣體循環(huán)培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法，其特征在于反應(yīng)器上的冷凝器(4)與氣體流量計(jì)(6)之間通過導(dǎo)管接有氣泵(5)。
3.依權(quán)利要求2所述的氣體循環(huán)培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法，其特征在于在氣泵(5)之前接有氣體混合室和排空口。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氣體循環(huán)培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法,其技術(shù)要點(diǎn)是反應(yīng)器的出氣口排出的氣體通過導(dǎo)管導(dǎo)入反應(yīng)器中,形成氣體循環(huán)。本發(fā)明將植物細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)反應(yīng)器的出氣口排放到空氣中的氣體全部或部分再次引入反應(yīng)器中,并可適時(shí)、適量地補(bǔ)充所需氣體,可根據(jù)需要維持或調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的氣相環(huán)境,改善、優(yōu)化細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物的生產(chǎn)條件,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的合成。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1330141SQ0112770
公開日2002年1月9日 申請(qǐng)日期2001年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月4日
發(fā)明者陳黎明, 巫秀萍, 李志良, 黃巧明, 袁涌娜, 張慶云, 侯嵩生 申請(qǐng)人:梅縣梅雁生物工程研究所