專利名稱：含有細胞和組織培養(yǎng)的納米纖絲結構和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于細胞培養(yǎng)和組織工程的納米纖絲(nanofibrillar)結構，和用于增殖和/或分化細胞以及制備組織的方法。本發(fā)明另一方面涉及用于細胞培養(yǎng)的、包含納米纖維(nanofiber)基質的培養(yǎng)基。本發(fā)明另一方面涉及改良的納米纖維，其包含脂質、親脂性分子或化學修飾的表面。改良的納米纖維可用于各種應用。在一個應用中，使用改良的納米纖維可制備用于細胞培養(yǎng)和組織工程的納米纖絲結構。在另一應用中，使用改良的納米纖維可制備用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
背景技術：
體內細胞增殖和分化受細胞間獨特的空間相互作用調控。結合特定粘附分子拓撲區(qū)別位置的空間插入，和特定體液因子的釋放(例如生長和分化因子)，作為細胞增殖，分化，遷移，保持靜止狀態(tài)，或引發(fā)細胞凋亡的信號。細胞對這些信號激發(fā)(signaling trigger)的應答能力依賴于特定分子表面和細胞內受體的有效性。由這些分子刺激的信號轉導途徑依賴細胞骨架的組織結構，其中該骨架的結構具有多點細胞表面與這些信號分子、周邊細胞(surrounding cell)以及細胞外基質進行相互作用的功能。
設計細胞和組織培養(yǎng)環(huán)境時，重要的是考慮生長環(huán)境應包括細胞的相互作用。細胞類型、空間插入物(spatial cue)，和化學激發(fā)物以及調節(jié)物在調控相關細胞內的基因表達中發(fā)揮重要作用(Li等，2002，FASEB J.，1797-99；Botarro等，2002，Ann.N.Y.Acad.Sci.，961143-153；Kunz-Schughart等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，284C209-C219；Cukierman等，2001，Science，2941708-1712)。過去在細胞和組織培養(yǎng)實踐中進展目的在于提供接近組織中體內微環(huán)境復雜度的生物化學和物理條件(Cukierman等，2001，Science，231708-1712；Li等，2002，FASEB J.，1797-99；Chiu等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，972408-2413)。這些努力一直受到包括細胞系用途的因素限制，其中細胞系被持續(xù)培養(yǎng)，并根據它們在缺乏空間插入物和化學激發(fā)物以及存在于體內組織中的調節(jié)物的平面培養(yǎng)表面上的增殖能力進行挑選。
近來的研究證實由三維納米纖絲的空間組織(例如膠原質和胞外基質的其它纖絲元件)產生的獨特微環(huán)境和納米環(huán)境，對細胞粘附、信號轉導和分化功能的類組織模式是必不可少的。細胞在固體平面培養(yǎng)表面上粘附和生長，引起細胞組織模式不同于從體內組織中觀察的細胞組織模式(Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3137-141；Cukierman等，2001，Science，231708-1712；Mueller-Klieser，1997，Am.J.Physiol.，C1109-C1123)。當在通常的平面細胞培養(yǎng)表面上生長時，纖維原細胞，例如，呈現高度伸展和粘附形態(tài)，其中位于細胞質中的肌動蛋白網絡被組織成厚應力纖維陣列。相反，當纖維原細胞在膠原質凝膠中生長或在組織中被觀察時，其呈紡錘體形狀，帶有被組織成皮質環(huán)的肌動蛋白(Tamariz和Grinnell，2002，Mol.Biol.Cell，133915-3929；Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3137-141；Grinnell等，2003，Mol.Biol.Cell，14384-395)。此外，相對于在三維細胞培養(yǎng)中生長的癌細胞，在二維細胞培養(yǎng)中生長的癌細胞的藥物敏感度表現出顯著的差異；對包含化學療法的癌治療的設計具有顯著影響的結果(Mueller-Klieser，1997，Am.J.Physiol.，273C1109-C1123；Padron等，2000，Crit.Rev.Oncol./Hematol.，36141-157；Jacks和Weinberg，2002，Cell，111923-925；Weaver等，2002，Cancer Cell，2205-216)。
細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的重大進展，是引入了由非毒性和生物相容的材料組成的基質，被設計成作為支架(scaffold)和用于劃分體外和體內細胞的三維空間組織體(美國專利申請?zhí)?0020133229；美國專利申請?zhí)?0020042128；美國專利申請?zhí)?0020094514；美國專利申請?zhí)?0020090725)。這些方案的目的在于提供生長面，具有類體內組織幾何學和微米和納米環(huán)境，以用于細胞增殖和分化為功能性組織或再生受損結構。這些支撐功能細胞的結構可用于各種用途，包括修復或替換體內的受損組織，以及促進新組織和器官的生長。
然而，三維細胞和組織培養(yǎng)技術的成功制備，主要是依靠單獨實驗室和尖端儀器起的專門作用。明顯需要從單或復合材料制備培養(yǎng)基，提供與標準組織培養(yǎng)平板相關的使用方便、均一、質量控制以及適應性。另外，培養(yǎng)基材料和配方應考慮到所確定組合物的分層裝配結構，更準確地反映組織中細胞層的組織。包含通過粗纖維載體分離的多層細纖維的介質，例如美國專利5,672,399中公開的過濾介質，不能提供用于活細胞生長的環(huán)境。
發(fā)明概述納米纖絲結構可從納米纖維材料制備，提供可重復的纖維和基質尺寸，使用方便，均一，細胞反應，質量控制和適應性。納米形貌，納米纖絲結構的納米纖維網絡形貌以及納米纖維空間網絡的納米纖維排列，被設計成提供體外仿生底層，該底層對于在單層或多層細胞培養(yǎng)中促進同型或異型細胞生長和/或細胞分化更加組織相容。
本發(fā)明的一個方面提供包含脂質的改良納米纖維。納米纖維直徑小于約1000nm。改良納米纖維可用于各種用途，包括細胞培養(yǎng)和組織工程。
本發(fā)明的優(yōu)選方式包括結合了附加組合物的聚合物材料，影響聚合物的填充，使得聚合物電紡絲(electrospinning)導致生成大量多分散的納米纖維，該納米纖維與來自不含添加劑組分的聚合物溶液中大量多分散的納米纖維電紡(electrospun)相比，具有更多數量或百分率的細纖維。在一個實施方案中，聚合物溶液包含約0.25％到約15％w/w的添加劑組分。在另一個實施方案中，聚合物溶液包含約1％到約10％w/w的添加劑組分。在優(yōu)選的實施方案中，添加劑組分是脂質。在另一個優(yōu)選實施方案中，脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、神經鞘磷脂、膽固醇，或其組合。添加劑組分也可作為信號分子誘導細胞對纖維補充和粘附。
細纖維優(yōu)選具有約5nm到約600nm的直徑。在一個實施方案中，細纖維直徑約50nm到約400nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約300nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm到約200nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm到100nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm到約50nm。
具有更小直徑的納米纖維提供促進納米纖維和細胞之間多點粘附的表面，細胞粘附至體內細胞外基質的特征。優(yōu)選至少約25％的大量多分散的納米纖維是細纖維。在一個實施方案中，至少約30％的大量多分散的含有納米纖維的脂質是細纖維。在另一個實施方案中，至少約40％的大量多分散的含有納米纖維的脂質是細纖維。在另一個實施方案中，至少約50％的大量多分散的含有納米纖維的脂質是細纖維。在另一個實施方案中，至少約60％的大量多分散的含有納米纖維的脂質是細纖維。在另一個實施方案中，至少約70％的大量多分散的含有納米纖維的脂質是細纖維。
在一個實施方案中，從聚酰胺、聚酯或其它適于體內、動物或人類應用的聚合物制備改良的納米纖維。在另一個實施方案中，聚酯可以是聚(ε-乙內酯)、聚(乳酸酯)或聚(羥乙酸酯)。在另一個實施方案中，從包含至少約10％聚(ε-乙內酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制備納米纖維。在另一個實施方案中，從包含至少約15％聚(ε-乙內酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制備納米纖維。
本發(fā)明另一個優(yōu)選方式涉及納米纖維，包含一種或多種生物活性分子，包括但不限于，肽、多肽、脂質、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其雜交混合物。多肽包括纖維蛋白、粘附蛋白、生長因子以及分化因子。一些優(yōu)選的生長因子包括VEGF，NGFs，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGF-AB，FGFb，FGFa以及BGF。一些優(yōu)選的分化因子包括神經營養(yǎng)物質、集落刺激因子和轉化生長因子。
在一個實施方案中，將生物活性分子摻入制備納米纖維的聚合物溶液。在另一個實施方案中，官能團可粘附于納米纖維的外表面并且納米纖維的功能性表面起反應以結合一個或多個生物活性分子。在一個實施方案中，使用等離子沉積法(plasmadeposition)將官能團粘附于納米纖維的外表面。在另一個實施方案中，將官能團摻入制備納米纖維的聚合物溶液中。
本發(fā)明另一個優(yōu)選方式涉及包含熒光標記物的納米纖維。熒光標記物允許，例如，納米纖維可視化，在納米纖維混合物中識別特定納米纖維、識別納米纖維或納米纖維周圍的納米環(huán)境的化學或物理特性，以及評價可植入的納米纖維和/或包含納米纖維(含有用于設計組織的三維結構)的結構的降解和/或再分布。
熒光標記物可包括有機染料熒光團。在一個實施方案中，在納米纖維電紡之前將熒光團加入聚合物。在另一個實施方案中，熒光團通過摻入納米纖維表面的官能團結合納米纖維。在另一個實施方案中，熒光團結合粘附納米纖維的生物活性分子。熒光標記物可包括無機膠質半導體納米晶體。在一個實施方案中，納米晶體包括CdSe核和ZnS帽。在另一個實施方案中，納米晶體包括量子點(quantum dot)。
熒光標記物可作為離子敏感元件。在一個實施方案中，納米纖維可包含熒光標記物，其中標記物的熒光或熒光強度依賴離子濃度。所述的離子敏感元件可用于檢測包括pH和鈣，鈉或磷酸鹽流動的離子濃度變化。在另一個實施方案中，熒光標記物用作報告元件，以證明在納米纖維表面和配體之間絡合物生成，配體包括但不限于DNA/RNA核苷酸序列、碳水化合物、或肽/氨基酸序列。這種絡合物生成可通過熒光發(fā)射波長的變化和/或在吸收器和發(fā)射器之間的能量傳遞進行說明。
本發(fā)明還包括識別納米纖維的化學和/或物理特性的方法。在一個實施方案中，熒光標記物被賦予納米纖維化學或物理特性，并且納米纖維用給定的熒光標記物進行標記。所述化學和物理特性包括，但不限于纖維直徑、生物活性分子、官能團、纖維的分解或降解速率、包含納米纖維的聚合物組分、纖維的疏水性和親水性、包含納米纖維的聚合物溶解性、聚合物毒性、生物活性分子毒性，或其組合。用特定熒光標記物標記納米纖維，例如，以便識別納米纖維混合物或細胞陣列中各種纖維。納米纖維可用多于一種熒光標記物進行標記，以便識別納米纖維的多種化學和/或物理特性。
本發(fā)明另一個方面是包含一種或多種納米纖維的納米纖絲結構物，其中納米纖絲結構物由一種或多種納米纖維網絡限定。在一個實施方案中，納米纖維網絡沉積于基層表面?？赏ㄟ^各種聚合物或聚合物系統制備納米纖維。聚合物或聚合物系統優(yōu)選是無細胞毒性的。在一個實施方案中，納米纖維包括本發(fā)明改良的納米纖維。在另一個實施方案中，可通過聚酰胺或聚酯制備納米纖維。在另一實施方案中，聚酰胺或聚酯適于體內人體應用。在另一實施方案中，聚酯是聚(ε-己內酯)、聚(乳酸酯)或聚(羥乙酸酯)。在另一實施方案中，聚酰胺是尼龍6、尼龍66、尼龍610或其它生物相容的聚酰胺。在一個實施方案中，薄膜是光學透明聚酯薄膜。
在一個實施方案中，基層包括玻璃或塑料。在另一實施方案中，基層是培養(yǎng)容器的表面。在另一個實施方案中，基層包括薄膜。薄膜可以是水溶性的或水不溶性的。薄膜是生物可降解的和/或生物可分解的。薄膜優(yōu)選是無細胞毒性的。在優(yōu)選的實施方案中，薄膜是聚乙烯醇薄膜。
可單獨使用或分層納米纖絲結構物，以形成用于細胞或組織培養(yǎng)的納米纖絲結構物的多層集合。在一個實施方案中，納米纖絲結構物包括隔片。隔片起載體結構的作用。隔片提供充分的開口以允許細胞滲透和粘附于納米纖維網絡。隔片是水溶性的或水不溶性的。隔片可以是多孔滲水的或非多孔滲水的。隔片可以是生物可降解和/或生物可分解的。隔片優(yōu)選是生物相容的。
在一個實施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接觸沉積于基層上的納米纖維網絡表面，隔片的第二表面接觸基層表面致使納米纖維網絡和基層被隔片的直徑或厚度隔開。在另一個實施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接觸第一納米纖絲結構物的表面，隔片的第二表面接觸第二納米纖絲結構物的表面，致使兩個納米纖絲結構物被隔片的直徑或厚度隔開。
本發(fā)明的納米纖絲結構物具有許多體內和體外用途，包括修復傷口，培育人造皮膚、靜脈、動脈、腱、韌帶、軟骨、心臟瓣膜，器官培養(yǎng)，燒傷治療，以及骨移植。在一個實施方案中，通過將特定化學和物理特性工程設計入納米纖維網絡，基層和/或隔片，以構建適于細胞或組織生長環(huán)境的不同陣列，其中納米纖維網絡、基層/隔片包含單個納米纖絲結構物元件和/或連續(xù)分層排列的單獨納米纖絲結構物。在某些實施方案中，從纖維直徑和組合物的多相特性(heterogeneous nature)可獲得唯一特性環(huán)境。單個納米纖維，納米纖絲結構以及納米纖絲網絡的物理特性和/或特征，包括但不限于，質地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、彈性、幾何性、相互連接性、面積體積比、纖維直徑、纖維可溶性/不可溶性、親水性/疏水性，以及纖維密度，可以不同和/或更改，以構建可促進包括增殖和/或分化的預期細胞活力的納米和/或微米環(huán)境。在單個納米纖絲結構物中或包含兩種或多種納米纖絲結構物的單元陣列中工程設計特定納米和/或微米環(huán)境。
特定化學特性和識別基元(motif)，例如多肽、脂質、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于，生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能團、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程設計入納米纖絲網絡、基層和/或單個納米纖絲結構物的隔片中，或以各向同性或以梯度性地提高包括生長和/或分化的一種或多種選定的細胞活性。一些優(yōu)選的生長因子包括VEGF、NGFs、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、FGFb、FGFa以及BGF。一些優(yōu)選的分化因子包括神經營養(yǎng)物質、集落刺激因子和轉化生長因子。氨基酸、肽、多肽以及蛋白質可包括具有任意大小和復雜性的任意類型的所述分子以及所述分子的組合，包括但不限于結構蛋白、酶和肽激素。
本發(fā)明還包括制備組織的方法。在一個實施方案中，將兩種或多種納米纖絲結構物分層，以形成多層納米纖絲的集合?；罴毎练e于纖維，且該結構在促進沉積細胞生長、遷移和/或分化的條件下進行培養(yǎng)。在另一實施方案中，通過改變和/或更改生長基質的選定的物理和/或化學特性，可在單個基質中工程設計促進細胞活性的納米和/或微米環(huán)境。
在另一個實施方案中，在不同培養(yǎng)條件下將多種細胞類型在單個納米纖絲結構物上培養(yǎng)。然后將兩種或多種單個納米纖絲結構物進行分層，以形成多層納米纖絲的集合，并且該集合在促進預期的細胞活性(包括細胞生長和/或分化)的條件下培養(yǎng)。在另一個實施方案中，通過改變和/或更改納米纖絲結構的選定的物理和/或化學特性，可在單個納米纖絲結構物中，或者通過選擇性分層單個納米纖絲結構，可在納米纖維的集合中，工程設計促進細胞活性的納米和/或微米環(huán)境，從而獲得預期的納米或微米環(huán)境。選擇同種或異種纖維的直徑和組合物以優(yōu)化增殖和/或分化。
本發(fā)明另一個方面是細胞培養(yǎng)基。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包括納米纖維基質，其中網絡具有約50nm至約1000nm的纖維直徑，至少約2微米的平均纖維間距，約30％的基質硬度，以及連同外壁的頂部和底部，其中外壁高約10微米至約100mm，其中頂部和底部面積分別為約5mm2到約4×105mm2。在另一個實施方案中，外壁高度與頂部和底部面積適合于可用的培養(yǎng)血管或容器的尺寸。
細胞培養(yǎng)基包含基質、網絡、墊片(mat)、片(sheet)或卷(roll)。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含納米纖維網絡。在另一個實施方案中，使納米纖維網絡適于插入培養(yǎng)容器。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基沉積于培養(yǎng)容器的內表面。


圖1A-C是納米纖絲結構的電子顯微鏡掃描圖。圖1A和B示出由隨機沉積的聚酰胺納米纖維組成的納米纖絲墊片可組裝為分層的表面。圖1C示出納米纖維可被電紡帶有特定取向。
圖2A-E是顯微照片，示出了對來自含有脂質增加量的聚合物溶液的微纖維電紡絲進行比較。
圖3A和B是顯微照片，示出了對生長于組織培養(yǎng)平板上的正常大鼠腎纖維原細胞進行比較，該平板包有含有脂質的納米纖維或不含有脂質的納米纖維。
圖4A-C是顯微照片，示出了對生長于聚酰胺納米纖維網絡，玻璃和包有聚賴氨酸的玻璃上的正常大鼠腎纖維原細胞進行比較。
圖5A和B是顯微照片，示出了氨基官能團摻入納米纖維表面。
圖6是顯微照片，示出了帶有量子點的納米纖維的熒光標記。
具體實施例方式
I.定義本文所用的術語“納米纖絲結構”指包含適于活細胞生長的環(huán)境的結構，包括一種或多種納米纖維，其中該結構由一種或多種納米纖維網絡限定。在一些實施方案中，納米纖絲結構物包含基層，其中納米纖絲結構由一種或多種沉積于基層表面的網絡限定。工程設計納米纖絲結構的納米形貌、納米纖維網絡形貌以及納米纖維網絡在空間的納米纖維排列，以提供體外仿生底層，該底層對于在單層或多層細胞培養(yǎng)中促進同型或異型細胞生長和/或細胞分化更加組織相容。將納米纖絲結構分層，以形成多層納米纖絲的集合，單元陣列或組織結構。
本文所用的術語“納米纖維”指包括直徑為約1000納米或更少的聚合物細纖維。聚合物優(yōu)選是無細胞毒性的聚合物。聚合物可以是水溶性的或水不溶性的。聚合物是生物可降解的和/或生物可分解的。聚合物可以是聚酯或聚酰胺。聚酯可以是脂肪族聚酯，包括但不限于聚乳酸、聚(羥乙酸酯)、聚(ε-己內酯)及其共聚物。聚酰胺可以是聚已內酯、尼龍6、尼龍66、尼龍612或其它尼龍材料。
納米纖維可包含脂質或親脂性分子，包括但不限于，溶血卵磷脂、卵磷脂、神經鞘磷脂、膽固醇，或其混合物。納米纖維可包含一種或多種生物活性分子。優(yōu)選一種生物活性分子是肽、多肽、脂質、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其雜交混合物。納米纖維可包含一種或多種醇基、醛基、氨基、羧基、巰基或感光官能團。感光官能團優(yōu)選是卡賓(carbine)或氮賓(nitrene)。
納米纖維可包含一種或多種生長因子和/或分化因子。納米纖維可釋放一種或多種生長因子和/或分化因子。通過納米纖維的降解和/或分解速率確定釋放速率。
本文所用的術語“網絡”指控制納米纖維在空間隨機或定向的分布，以在選定的纖維之間形成可提高生長和培養(yǎng)穩(wěn)定性的具有間隔的互相連接的網狀物。網絡在纖維之間具有小間隙，包括在網絡中形成孔或通道的網絡?？谆蛲ǖ劳ㄟ^厚度有約0.01微米至約25微米的直徑，優(yōu)選約2微米至約10微米。網絡可以包含納米纖維單層，由連續(xù)納米纖維形成的單層，納米纖維多層，由連續(xù)納米纖維形成的多層，或墊片。網絡可以是解開的或網狀的。網絡具有單個納米纖維直徑至約2000nm的厚度。可將網絡的物理特性，包括但不限于，質地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、彈性、幾何性、相互連接性、面積體積比、纖維直徑、纖維可溶性/不可溶性、親水性/疏水性、纖維密度，以及纖維取向設計為預期的參數。
本文所用的術語“基層”指納米纖維或納米纖維網絡沉積其上的任何表面。基層可以是為納米纖維的沉積網絡提供支撐結構的任何表面。基層可包含玻璃或塑料。塑料優(yōu)選是無細胞毒性的。基層可以是薄膜或培養(yǎng)容器。
基層可以是水溶性的或非水溶性的。水溶性的基層優(yōu)選是聚乙烯醇膜?；鶎涌梢允嵌嗫椎幕蚍嵌嗫椎?。通過細胞滲透確定基層的多孔性。細胞能滲過多孔基層但不能滲過非多孔基層。多孔基層的孔優(yōu)選直徑約2μm至10μm?；鶎涌梢允巧锟山到獾暮?或生物可分解的?；鶎觾?yōu)選是生物相容的。
基層包含一種或多種生物活性分子。優(yōu)選一種生物活性分子是肽、多肽、脂質、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其雜交分子?；鶎涌砂环N或多種醇基、醛基、氨基、羧基、巰基或感光官能團。感光官能團優(yōu)選是卡賓或氮賓?；鶎涌砂环N或多種生長因子和/或分化因子?；鶎涌舍尫乓环N或多種生長因子和/或分化因子。通過基層的降解和/或分解速率確定釋放速率。
本文所用的術語“隔片”指從基層表面隔開納米纖維或納米纖維網絡的層，或從第二納米纖絲結構表面隔開第一納米纖絲結構表面的層，使得結構被隔片的直徑或厚度隔開。隔片可包括聚合物細纖維或薄膜。薄膜優(yōu)選厚度為約10微米至約50微米。隔片可包括聚合物，包括纖維素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。細纖維可以包括微纖維。微纖維是含有約1.0μm至約10μm直徑的聚合物細纖維。微纖維可以是解開的或網狀的。
隔片可以是水溶性的或非水溶性的。隔片可以是多孔的或非多孔的。通過細胞滲透確定隔片的多孔性。細胞能滲過多孔隔片但不能滲過非多孔隔片。隔片可以是生物可降解的和/或生物可分解的。隔片優(yōu)選是生物相容的。
隔片包含一種或多種生物活性分子。優(yōu)選一種生物活性分子是肽、多肽、脂質、碳水化合物、核苷酸、核酸、多核苷酸、多糖、氨基酸，或其雜交分子。隔片可包含一種或多種醇基、醛基、氨基、羧基、巰基或感光官能團。感光官能團優(yōu)選是卡賓或氮賓。隔片可包含一種或多種生長因子和/或分化因子。隔片可釋放一種或多種生長因子和/或分化因子。通過隔片的分解或降解速率確定釋放速率。
本文所用的術語“生物活性分子”指影響細胞或組織的分子。術語包括人體或獸醫(yī)治療法、營養(yǎng)保健品、維生素、鹽、電解液、氨基酸、肽、多肽、蛋白質、碳水化合物、脂質、多醣、核酸、核苷酸、多核苷酸、糖蛋白、脂蛋白、糖酯、粘多糖、蛋白多糖、生長因子、分化因子、激素、神經傳遞素、信息素、抑素、前列腺素、免疫球蛋白、單核因子和其它細胞因子、濕潤劑、礦物質、電子和磁性反應物質、光敏感物質、抗氧劑、可代謝為細胞能量源的分子、抗原，以及可引起細胞或生理反應的任何分子。可使用分子的任意組合以及這些分子的激動劑或對抗劑。甘油氨基多糖(glycoaminoglycans)包括糖蛋白、蛋白多糖和透明質酸。多醣包括纖維素、淀粉、褐藻酸、殼聚糖(chytosan)或透明質酸。細胞因子包括，但不限于心臟營養(yǎng)素、基質細胞衍生因子、巨噬細胞衍生趨化因子(MDC)、黑素瘤生長刺激活性(MGSA)、巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)，2，3α、3β、4和5、白細胞介素(IL)1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、L-13、TNF-α和TNF-β。本發(fā)明所用的免疫球蛋白包括，但不限IgG、IgA、IgM、IgD、IgE及其混合物。氨基酸、肽、多肽和蛋白質可以包括具有任意大小和復雜性所述分子的任意類型，以及所述分子的組合。示例包括，但不限于結構蛋白質、酶和肽激素。
術語生物活性分子還包括纖維蛋白、粘附蛋白、粘合化合物、解粘化合物以及靶向化合物。纖維蛋白包括膠原質和彈性蛋白。粘合化合物/解粘化合物包括纖連蛋白、層粘連蛋白、凝血栓蛋白和肌腱蛋白C。粘附蛋白包括肌動蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、鈣粘著蛋白、選擇素、胞內粘附分子1、2和3，細胞基質粘著受體包括但不限于粘合素，例如α5β1、α6β1、α7β1、α1β2、α2β3和α6β4。
術語生物活性分子還包括瘦蛋白、白血病抑制因子(LIF)、RGD肽、腫瘤壞死因子α和β、血管內皮抑素、血管抑制素、凝血栓蛋白、骨形成蛋白-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和7、骨粘連蛋白、生長調節(jié)素樣肽、骨鈣素、干擾素α、干擾素aA、干擾素β、干擾素β、干擾素γ、干擾素1α、以及白細胞介素2，3，4，5 6，7，8，9，10，11，12，13，15，16，17和18。
本文所用的術語“生長因子”指促進細胞或組織增殖的生物活性分子。本發(fā)明使用的生長因子包括，但不限于，轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(包括AA、AB和BB同型(PDGF))、纖維原細胞生長因子(FGF)(包括FGF酸性同型1和2，FGF堿性2以及FGF4，8，9和10)、神經生長因子(NGF)(包括NGF2.5s、NGF7.0s、βNGF和神經營養(yǎng)物質)、腦衍生神經營養(yǎng)因子、軟骨衍生因子、骨生長因子(BGF)、堿性纖維原細胞生長因子、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、EG-VEGF、VEGF相關蛋白、Bv8、VEGF-E、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、胰島素樣生長因子(IGF)I和II、肝細胞生長因子、膠質細胞神經營養(yǎng)生長因子(GDNF)、干細胞因子(SCF)、角化細胞生長因子(KGF)、轉化生長因子(TGF)(包括TGFsα、β、β1、β2和β3)、骨骼生長因子、骨基質衍生生長因子，和骨衍生生長因子，及其混合物。一些生長因子也可促進細胞或組織的分化。TGF，例如，可促進細胞或組織的生長和/或分化。一些優(yōu)選的生長因子包括VEGF、NGFs、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、FGFb、FGFa以及BGF。
本文所用的術語“分化因子”指促進細胞分化的生物活性分子。術語包括，但不限于，神經營養(yǎng)蛋白、集落刺激因子(CSF)或轉化生長因子。CSF包括粒細胞-CSF、巨噬細胞-CSF、粒細胞-巨噬細胞-CSF、促紅細胞生成素以及IL-3。一些分化因子也可促進細胞或組織的生長。TGF和IL-3，例如，可促進細胞的分化和/或生長。
本文所用的術語“粘合化合物”指促進細胞粘附纖維表面的生物活性分子，包括粘合化合物。粘合化合物示例包括，但不限于，纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白。
本文所用的術語“解粘化合物”指促進細胞脫離纖維的生物活性分子，包括解粘化合物。解粘化合物示施包括，但不限于，凝血栓蛋白和肌腱蛋白C。
本文所用的術語“靶向化合物”指作為誘導細胞補充和/或粘附纖維的信號分子的生物活性分子，包括靶向化合物。靶向化合物及其同源物受體的示例包括粘附肽(包括衍生于纖連蛋白和粘合素的RGD肽)、生長因子(包括EGF和EGF受體)以及激素(包括胰島素和胰島素受體)。
本文所用的術語“脂質”指不溶于水但易溶于無極有機溶劑的有機分子。術語包括親脂性分子(包括但不限于植物和動物甘油三酸酯)、固醇、卵磷脂物質，包括溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂，以及膽固醇。
本文所用的短語“使適于插入”指為用于或適合培養(yǎng)容器尺寸進行制造或制備，或為用于或適合培養(yǎng)容器尺寸調整大小，包括，例如，從片、卷或墊片削減尺寸或切片直至適于插入培養(yǎng)容器的尺寸。
本文所用的術語“培養(yǎng)容器”指容納用于培養(yǎng)細胞或組織的培養(yǎng)基的容器。培養(yǎng)容器可以是玻璃或塑料的。優(yōu)選塑料是非生物毒素的。術語培養(yǎng)容器包括，但不限于，單槽和多槽培養(yǎng)板、小室和多小室培養(yǎng)載玻片、蓋玻片、吸杯、燒瓶、試管、瓶、滾瓶(roller bottle)、旋轉瓶(spinner bottle)、灌注室(perfusion chamber)、生物反應器以及發(fā)酵罐。
本文所用的術語“墊片”指大量密集交叉、纏繞或粘附的納米纖維。墊片中納米纖維的分布可以是隨機或定向的。墊片可以是解開或網狀的。墊片沉積于或不沉積于基層上。墊片厚度約100至約1000nm。
II.發(fā)明實施方式A.改良的納米纖維本發(fā)明一個方面提供包含脂質的改良納米纖維。優(yōu)選納米纖維直徑小于約1000nm。在一個實施方案中，納米纖維直徑約50至約1000納米。改良的納米纖維用于各種應用，包括細胞培養(yǎng)和組織工程。
i.聚合物和聚合物系統改良的納米纖維優(yōu)選包含無細胞毒性的聚合物。聚合物可以是水溶性的或非水溶性的。聚合物是生物可降解的和/或生物可分解的。聚合物包括第一聚合物和第二聚合物，但第二聚合物是在升高的溫度下經過調節(jié)或處理過的不同聚合物(在聚合物類型、分子量或物理性質上有差異)。
將共混聚合物反應并形成單個的化學物種，或通過退火過程物理組合成混合組合物。退火意味著類似結晶、應力松弛或取向的物理變化。將優(yōu)選的材料以化學方法反應到單個聚合物種中，以至于微分掃描量熱儀分析揭示單個的聚合材料。所述材料，當與優(yōu)選的添加劑材料結合時，可在納米纖維上形成添加劑包被的表面，當接觸高溫、高濕度和艱難的運行條件時，提供疏油性、疏水性或其它有關的改良穩(wěn)定性。該材料種類的細纖維直徑約1000nm至約小于5納米。所述纖維具有光滑表面，包含不連續(xù)層的添加劑材料或包被添加劑材料的外層或者兩者，該外層在聚合物表面是部分溶解的或熔合的。用于混合的聚合系統的優(yōu)選材料包括尼龍6、尼龍66、尼龍6-10；尼龍(6-66-610)共聚物或其它線性常規(guī)的脂肪族尼龍組合物。優(yōu)選的尼龍共聚物樹脂(SVP-651)通過端基滴定來分析分子量(J.E.Walz和G.B.Taylor，determination of themolecular weight of nylon，Anal.Chem.Vol.19，Number 7，pp 448-450(1947))。數量平均分子量(Wn)介于21,500和24,800。通過三組分尼龍(約45％的尼龍6、約20％的尼龍66和約25％的尼龍610)的熔解溫度相圖評價組合物(第286頁，Nylon PlasticsHandbook，Melvin Kohan ed.Hanser Publisher，New York(1995))。
報告的SVP 651樹脂的物理性質是性質ASTM方法單位標準值比重D-792 -- 1.08吸水率 D-570 ％ 2.5(24小時浸液)
硬度 D-240 支柱D65熔點 DSC ℃() 154(309)抗張強度 D-638 MPa(kpsi)50(7.3)@產量斷裂伸長率D-638 ％ 350彎曲模量 D-790 MPa(kpsi)180(26)體積電阻系數 D-257 ohm-cm 1012具有87至99.9+％水解率的聚乙烯醇可用于該聚合物系統。優(yōu)選這些進行交聯，更優(yōu)選它們進行交聯并結合相當數量的疏油性和疏水性添加劑材料。
聚合物可以是單個聚合材料，可選與添加劑組合物結合以提高纖維壽命或操作特性。本發(fā)明這個方面所用的優(yōu)選聚合物包括尼龍聚合物、聚偏二氯乙烯聚合物、聚偏二氟乙烯聚合物、聚乙烯醇聚合物，以及更具體地是，當結合強疏油性和疏水性添加劑所列出的那些材料，能導致微纖維或納米纖維帶有添加劑材料形成在細纖維表面的涂層中。此外，本發(fā)明可使用相似聚合物的混合物，例如相似尼龍、相似聚氯乙烯聚合物，聚偏二氯乙烯聚合物的混合物。另外，聚合混合物或差異聚合物熔體(alloy)也在本發(fā)明預期之內。在這方面，聚合物的相容性混合物對形成本發(fā)明的納米纖維或微纖維材料是有用的。
添加劑組合物可以是有機或無機的，金屬或非金屬的。在一個實施方案中，聚合物溶液包含約0.25％至約70％w/w的添加劑組合物。在另外的實施方案中，添加劑組合物是生物活性分子。在另一個實施方案中，添加劑組合物是陶瓷。添加劑組合物可以是光學添加劑，提高或減少顯微鏡使用的固有纖維熒光性。在一個實施方案中，光學添加劑是量子點。在另一個實施方案中，光學添加劑通過提高信號噪聲比使纖維的熒光背景最小化。光學添加劑的示例包括，但不限于量子點或FluoroblokTM(BectinDickinson，Franklin Lakes，NJ)。
本發(fā)明聚合組合物所用的聚合物材料包括加聚物和縮聚物材料，例如聚烯烴、聚縮醛、聚酰胺、聚酯、纖維素醚和酯、聚亞烷基硫化物、聚芳基氧化物、聚砜、改良的聚砜聚合物及其混合物。屬于這些種類的優(yōu)選材料包括以交聯和非交聯形式的聚乙烯、聚(ε-己內酯)、聚(乳酸酯)、聚(羥乙酸酯)、聚丙烯、聚(氯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯(和其它丙烯酸樹脂)、聚苯乙烯、及其共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚(偏二氟乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、各種水解度數的聚乙烯醇(87％至99.5％)。優(yōu)選的加聚物傾向于玻璃質的材料(高于室溫的Tg)。這是適于聚氯乙稀和聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯聚合物組合物或熔體，或對聚偏二氟乙烯和聚乙烯醇材料用低結晶度。
例如聚(ε-己內酯)、聚(乳酸酯)、聚(羥乙酸酯)及其共聚物的脂肪族聚酯，是生物可降解的和生物相容的，并屬于食品藥品管理局(FDA)批準的、用于某些人體臨床應用的幾個合成聚合物，例如外科縫合線和一些可植入裝置。在一個實施方案中，從適于體內人體應用的脂肪族聚酯制備納米纖維。優(yōu)選聚酯是聚(ε-己內酯)、聚(乳酸酯)或聚(羥乙酸酯)。在一個實施方案中，從包含至少約10％聚(ε-己內酯)w/w在氯仿的的聚合物溶液制備納米纖維。在另一個實施方案中，從包含至少約15％聚(ε-己內酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制備納米纖維。
聚酰胺縮聚物的一類是尼龍材料。術語“尼龍”是所有長鏈合成聚酰胺的屬名。通常，尼龍名稱包含一系列數字，例如在尼龍-6，6中，其表示起始材料是C6二胺和C6二酸(第一個數字表示C6二胺，第二個數字表示C6二羧酸化合物)。在有少量水的情況下，通過ε-己內酰胺的縮聚作用制備別的尼龍。該反應形成線性聚酰胺的尼龍-6(由也稱為ε-氨基己酸的環(huán)內酰胺制備)。另外，尼龍共聚物也是可預期的。通過在反應混合物中結合各種二胺化合物、各種二酸化合物以及各種環(huán)內酰胺結構物，然后在聚酰胺結構物中形成具有隨機分布的單體材料的尼龍，以制備共聚物。例如，尼龍6，6-6，10材料是從己二胺與C6和C10二酸混合物所制備的尼龍。尼龍6-6，6-6，10是通過ε-氨基己酸、己二胺以及C6和C10二酸材料的混合物的共聚合作用制備的尼龍。
本發(fā)明的方法中也可使用嵌段共聚物。對于所述共聚物重要的是選擇溶劑膨脹劑。選定的溶劑是使得嵌段都可溶于溶劑的。一個實例是二氯甲烷溶劑中的ABA(苯乙烯-EP-苯乙烯)或AB(苯乙烯-EP)聚合物。如果一種組分不可溶于該溶劑，它會形成凝膠。所述嵌段共聚物的示例是AB的Kraton類型和ABA嵌段共聚物，包括苯乙烯/丁二烯和苯乙烯/氫合丁二烯(乙烯丙烯)、ε-己內酰胺/乙撐氧的Pebax類型、Sympatex聚酯/乙撐氧，以及乙撐氧和異氰酸酯的聚氨酯。
加聚物，像聚偏二氟乙烯、間同立構聚苯乙烯、偏二氟乙烯和六氟乙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、無定形的加聚物，例如聚(丙烯腈)及其具有丙烯酸和甲基丙烯酯的共聚物，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)及其各種共聚物，聚(甲基丙烯酸甲酯)及其各種聚合物，可比較容易地進行溶液紡絲，因為它們在低壓和低溫下是可溶的。然而，如果進行溶液紡絲，類似聚乙烯和聚丙烯的高度結晶聚合物需要高溫、高壓溶劑。因此，聚乙烯和聚丙烯的溶液紡絲是很困難的。靜電溶液紡絲是一種制備納米纖維和微纖維的方法。
我們還發(fā)現形成聚合組合物的基本優(yōu)點，該組合物包含在聚合物混合物、熔體形式和在化學交聯的連接結構中兩種和多種聚合材料。我們相信這種聚合物組合物通過改變聚合物屬性提高物理性質，例如促進聚合物鏈彈性或鏈流動性、增加總分子量以及通過聚合材料的網絡形成提供強化。
在該原理的一個實施方案中，為獲得有益性質，混合兩種相關的聚合物材料。例如，高分子量的聚氯乙烯可混合低分子量的聚氯乙稀。相似地，高分子量的尼龍材料可混合低分子量的尼龍材料。另外，可混合普通聚合物屬的不同種類。例如，高分子量的苯乙烯材料可混合低分子量、耐沖擊的聚苯乙烯。尼龍-6材料可混合尼龍共聚物，例如尼龍-6；6，6；6，10共聚物。另外，具有低度水解的聚乙烯醇，例如87％水解的聚乙烯醇，可混合具有98和99.9％以及更高水解度的完全或超水解的聚乙烯醇?；旌衔镏兴羞@些材料用合適的交聯機理進行交聯。尼龍可用與酰胺鍵中氮原子反應的交聯劑進行交聯。聚乙烯醇材料可用羥基反應材料如單醛，如甲醛、尿素、蜜胺甲醛樹脂及其類似物、硼酸和其它無機化合物、二醛、二酸、氨基甲酸乙酯、環(huán)氧樹脂類以及其它已知的交聯劑，進行交聯。交聯技術是公知的和理解的現象，其中交聯劑在聚合物鏈之間反應并形成共價鍵，以充分地提高分子量、耐化學性、整體強度以及機械降解抗性。
電紡產生直徑不同的納米纖維(一般約5nm至約1000nm)群體。本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及聚合材料與添加劑組合物結合，影響聚合物填充，使得聚合物電紡生成納米纖維群體，與來自不含添加劑組分的聚合物溶液的納米纖維電紡絲群體比較，具有更多數量或百分率的細纖維。在一個實施方案中，聚合物溶液包含約0.25％至約15％w/w的添加劑組分。在另一個實施方案中，聚合物溶液包含約1％至約10％w/w的添加劑組分。
優(yōu)選細纖維直徑約5nm至約600nm。在一個實施方案中，細纖維直徑約50nm至約400nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約300nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm至約200nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm至約100nm。在另一個實施方案中，細纖維直徑約5nm至約50nm。
更小直徑的納米纖維提供在納米纖維和細胞之間促進多點粘附的表面，細胞體內粘附于胞外基質的特性。優(yōu)選地，含有納米纖維的脂質群體至少約25％是細纖維。在一個實施方案中，含有納米纖維的脂質群體至少約30％是細纖維。在另一個實施方案中，含有納米纖維的多分散多個脂質群體至少約40％是細纖維。在另一個實施方案中，含有納米纖維的多分散多個脂質群體至少約50％是細纖維。在另一個實施方案中，含有納米纖維的多分散多個脂質群體至少約60％是細纖維。在另一個實施方案中，含有納米纖維的多分散多個脂質群體至少約70％是細纖維。
優(yōu)選添加劑組分是無細胞毒性的。在一個實施方案中，影響聚合物填充的添加劑組分是生物活性分子。生物活性分子可以是脂質。優(yōu)選脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、膽固醇及其混合物。
添加劑組分能或不能影響細胞活性，包括遷移或細胞粘附納米纖維。在一個實施方案中，包含添加劑組分的納米纖維不影響細胞活性。優(yōu)選地，添加劑組分包括一種或多種生物活性分子。生物活性分子的一種或多種是脂質。優(yōu)選脂質是膽固醇。在另一個實施方案中，包含添加劑組分的納米纖維可影響細胞活性。所述納米纖維誘導細胞遷移或促進細胞粘附納米纖維。優(yōu)選添加劑組分包括一種或多種生物活性分子。一種或多種生物活性分子是脂質。在一個實施方案中，脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂及其混合。在另一個實施方案中，添加劑組分包括膽固醇和一種或多種生物活性分子，影響細胞活性，包括生長因子，分化因子，和/或粘附蛋白。
聚合物或聚合物系統包含一種或多種生物活性分子，包括但不限于脂質或親脂性分子、纖維蛋白、粘附蛋白、生長因子以及分化因子。優(yōu)選至少一種生物活性分子包含脂質。在一個實施方案中，脂質分子作為信號分子誘導細胞對纖維復原和粘附。脂質分子還可引起細胞增殖或分化。納米纖維包括生物活性分子，例如脂質，促進細胞定向遷移和緊密粘附，可用于體內或體外應用，包括修復傷口，培育人造皮膚、靜脈、動脈、腱、韌帶、軟骨、心臟瓣膜器官培養(yǎng)，治療燒傷，以及骨移植。優(yōu)選脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂或其混合。
優(yōu)選一種或多種生物活性分子是生長因子、分化因子、纖維蛋白和/或粘附蛋白。優(yōu)選生長因子是VEGF、骨形成蛋白因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。優(yōu)選分化因子是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。優(yōu)選分化生長因子是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。
本發(fā)明聚合物系統具有粘附特性，致使當接觸纖維素、聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯或聚酰胺基層時，以足夠強度粘附于基層，使其牢固地結合基層并能經受與機械應力有關的脫離作用。本發(fā)明的納米纖維可用于構建三維功能組織，包括肌肉和腱。在該模式中，當經受與例如肌肉或腱收縮有關的機械應力時，聚合物材料應堅持粘附基層。納米纖維對基層的粘附起因于當纖維接觸基層或纖維通過熱或壓力在基層上進行后處理時形成纖維的溶劑作用。然而，聚合物特性在決定粘附中起重要作用，例如特定化學相互作用(類似氫鍵結合、在高于或低于Tg的聚合物和基層之間出現的接觸，以及包含添加劑的聚合物形成)。在粘附過程中通過溶劑或蒸氣增塑的聚合物具有增強的粘附性。
ii.功能化表面將官能團摻入納米纖維外表面。這些功能化表面可起反應，將肽、多肽、脂質、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子結合到納米纖維表面。在一個實施方案中，納米纖維的功能化表面起反應，以結合一種或多種生物活性分子。優(yōu)選一種或多種生物化活性分子是生長因子、分化因子、粘附蛋白或衍生于粘附蛋白的生物活性肽。優(yōu)選生長因子是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。優(yōu)選分化因子是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。優(yōu)選分化因子是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。優(yōu)選生物活性肽是RGD肽。
在一個實施方案中，官能團通過等離子沉積沉積于納米纖維外表面。等離子沉積在納米纖維表面構建本地等離子體。然后將處理的表面與氣態(tài)分子(例如丙烯胺和/或烯丙醇)在反應室里反應。在另一個實施方案中，在電紡絲過程中將官能團引入納米纖維表面。十二烷胺、十二醛、十二烷硫醇或十二烷醇也可加入聚合物溶液。然后將聚合物溶液電紡成納米纖維，其中部分添加的胺、醛、巰基或醇半體分別暴露于納米纖維外表面。
iii.熒光標記物納米纖維可包含熒光標記物。熒光標記物允許，例如，納米纖維可視化，在納米纖維混合物中識別特定納米纖維，識別納米纖維的化學或物理性質，以及評價可植入的納米纖維和/或包含納米纖維的結構物的降解和/或再分布，其中該納米纖維包括用于工程設計組織的多層集合，可降解并可運送到遠離移植原始位置的其它區(qū)域。熒光標記物是可光漂白的或不可光漂白的。熒光標記物是pH敏感的或pH不敏感的。熒光標記物優(yōu)選是無細胞毒性的。
熒光標記物包含有機染料熒光團，包括但不限于，Texas Red、BIODIPY、Oregon Green、Alexa Fluor、熒光素、Cascade Blue、Dapoxyl、香豆素、玫瑰精、N-甲基-4-肼-7-硝基、丹酰乙二胺、丹酰尸胺、丹酰肼或其混合?？稍趙ww-probes-com(Molecular Probes，Eugene，OR)中獲得關于這些或其它適宜的有機染料熒光團的更多信息。在一個實施方案中，在電紡納米纖維前將熒光團加入聚合物。在另一個實施方案中，熒光團通過摻入納米纖維表面的官能團偶合納米纖維。在另一個實施方案中，熒光團偶合粘附于納米纖維的生物活性分子。
熒光標記物包括無機膠質半導體納米晶體。在一個實施方案中，納米晶體包括CdSe核和ZnS帽。在另一個實施方案中，納米晶體包括量子點。可在www-evidenttech-com和www-quantumdots-com獲得關于納米晶體和量子點的更多信息。納米晶體的吸收光譜廣，從紫外線延伸到可見光譜界限。發(fā)射光譜窄，優(yōu)選20-40nm的半幅值全寬，中心波長是選定的納米晶體粒子大小的特征。納米晶體優(yōu)選是光化學穩(wěn)定的和/或無細胞毒性的。
熒光標記物可用于識別納米纖維的化學和/或物理性質。在一個實施方案中，熒光標記物被賦予納米纖維化學或物理性質，并且納米纖維標記有賦予的熒光標記物。所述化學和物理性質包括，但不限于纖維直徑、生物活性分子、官能團、纖維溶解率或降解率、包含納米纖維的聚合物組分、纖維的疏水性或親水性、包含納米纖維的聚合物溶解性、聚合物毒性、生物活性分子毒性或其組合。在一個實施方案中，生物活性分子是生長因子、分化因子、粘附分子或其混合。帶特定熒光標記物標記的納米纖維，例如，允許在納米纖維混合物或單元陣列中識別各種類型的纖維。納米纖維可用多于一種的熒光標記物進行標記，以便于識別納米纖維的多種化學和/或物理性質。
熒光標記物可包括生物活性熒光探針，以確定生物化學環(huán)境中的變化。在一個實施方案中，納米纖維可包含熒光標記物，其中標記物的熒光性或熒光強度依賴于離子濃度。所述的離子敏感元件可用于檢測包括pH和鈣、鈉或磷酸鹽流動的離子濃度變化。在一個實施方案中，熒光標記物包括SNARF、SNAFL、鈣綠(calcium green)或其混合。在另一個實施方案中，由于和其它分子絡合，納米纖維含有能改變它們的熒光性質的染料的能力。
iv.應用改良的納米纖維可用于應用納米纖維的許多已知用途，包括但不限于，過濾器應用，計算機硬盤驅動應用，和藥物應用。改良的納米纖維可用于各種生物學用途，包括細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和組織工程應用。在一個應用中，使用改良的納米纖維，可制備用于細胞培養(yǎng)和組織工程的納米纖絲結構物。在一個實施方案中，納米纖絲結構包含一種或多種改良的納米纖維，其中納米纖絲結構由一種或多種改良的納米纖維網絡限定。在另一個實施方案中，納米纖絲結構包含一種或多種改良的納米纖維和基層，其中納米纖絲結構由沉積于基層表面的一種或多種改良的納米纖維網絡限定。
在另一個應用中，使用改良的納米纖維制備用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，培養(yǎng)基包括以適于插入培養(yǎng)容器的墊片、卷或片的形式的納米纖維基質。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基包括沉積于培養(yǎng)容器表面或作為纖維網孔加入培養(yǎng)容器的納米纖維基質。
在另一個應用中，改良的納米纖維在適于細胞或組織培養(yǎng)的三維結構中進行噴涂或紡絲。將得到的三維結構放回細胞培養(yǎng)裝置用于連續(xù)培養(yǎng)，其中電紡絲結構作為細胞生長的平臺。在另外的應用中，將改良的納米纖維電紡成用于三維矩陣分層結構無紡網孔和/或編織層，以作為組織再生的模板。在另外的應用中，改良的納米纖維在高通量藥物分析和藥物敏感分析中作為細胞培養(yǎng)基，以提高每孔細胞的數量，提供用于檢測細胞應答的強信號。在另外一個應用中，改良的納米纖維在高通量藥物分析、藥物敏感分析和其它治療設計中作為細胞培養(yǎng)基，其中納米纖維在體外環(huán)境中提供更接近地模擬細胞體內特性的環(huán)境。
B.納米纖絲結構本發(fā)明另一個方面是納米纖絲結構。納米纖絲結構包括活細胞生長的環(huán)境，包含一種或多種納米纖維，其中納米纖絲結構由一種或多種納米纖維網絡限定。在一些實施方案中，納米纖絲結構包含基層，其中納米纖絲結構由沉積于基層表面的一種或多種納米纖維網絡限定。工程設計納米纖絲結構的納米形貌，以在單層或多層細胞培養(yǎng)中提供用于促進同型或異型細胞生長和/或細胞分化的更類似組織的底層。
i.納米纖維網絡納米纖維包含納米纖絲結構，可包括如上所述用于改良的納米纖維的聚合物或聚合物系統。在一個實施方案中，從適于體內人體應用的聚合物制備納米纖維。通過許多技術制備納米纖維，包括優(yōu)選電紡絲技術。聚合物的選擇和/或工藝，通過其制備納米纖維和/或定向并取向在基層上，允許特定選擇和控制納米纖維網絡的物理性質。生長面的物理性質，包括纖維大小、纖維直徑、纖維間距、基質密度、纖維質地和彈性，被證實是組織細胞中細胞骨架網絡和胞外基質蛋白中細胞信號基序的暴露的重要考慮因素(Meiners，S.和Mercado，M.L.，2003，Mol.Neurobiol.，27(2)，177-196)。納米纖維網絡的物理性質可工程設計為預期參數，包括但不限于，質地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、彈性、幾何性、相互連接性、面積體積比、纖維大小、纖維直徑、纖維可溶性/不可溶性、親水性/疏水性以及纖維密度。
改變和/或更改納米纖絲結構的一種或多種物理性質，以制備用于細胞生長和/或分化的特別定義的環(huán)境。例如，工程設計納米纖絲結構的多孔性，以促進離子、代謝物和/或生物活性分子的擴散，和/或允許細胞滲入和透過納米纖絲結構，以在能促進細胞和納米纖維網絡之間多點粘附的環(huán)境中生長。工程設計納米纖絲結構的納米纖維網絡的互連性，以促進細胞-細胞接觸。通過將生物活性分子加入制備納米纖維的聚合物溶液，可提高或降低納米纖絲結構的納米纖維網絡的彈性。在一個實施方案中，生物活性分子是脂質。在另外的實施方案中脂質是膽固醇。
工程設計納米纖絲結構的質地和粗糙度，以促進細胞粘附。選擇同源或異源納米纖維組合物，以優(yōu)化細胞生長或分化活性。例如，納米纖絲結構由多個具有不同直徑的納米纖維組成，和/或由多個由不同聚合物制備的納米纖維組成。工程設計納米纖維網絡的納米纖維的溶解性或不可溶解性，以控制生物活性分子從納米纖絲結構釋放。在一個實施方案中，生物活性分子的釋放速率由納米纖維網絡的納米纖維的生物可降解或生物可分解速率確定。工程設計納米纖絲結構的納米纖維網絡的疏水性和親水性，以促進特定細胞間隔。工程設計納米纖絲結構的硬度，以促進細胞生長和/或分化。在一個實施方案中，納米纖絲結構具有約3％至約70％的硬度。在另一個實施方案中，納米纖絲結構具有約3％至約50％的硬度。在另一個實施方案中，納米纖絲結構具有約3％至約30％的硬度。在另一個實施方案中，納米纖絲結構具有約3％至約10％的硬度。在另一個實施方案中，納米纖絲結構具有約3％至約5％的硬度。在另一個實施方案中，納米纖絲結構具有約10％至約30％的硬度。
電紡絲工藝使用電場控制聚合物的形成和沉積。通過電壓注入聚合物溶液。電壓引起電荷不平衡，導致聚合物溶液流從例如針的噴射器尖端噴射。在溶劑蒸發(fā)和形成纖維的期間，電場中聚合物噴射至接地的基層。得到的單個連續(xù)細絲作為基層上非紡織纖維收集。
制備具有隨機或指定取向的電紡納米纖維網絡。如圖1A和B所示，隨機纖維可組裝成分層面。在一個實施方案中，本發(fā)明的納米纖維包含隨機分布的細纖維，可結合形成聯鎖網絡。納米纖維聯鎖網絡在纖維之間具有相對小的間隙。纖維之間所述間隙的范圍一般在約0.01至約25微米，優(yōu)選約2至約10微米。該間隙在納米纖維網絡中形成孔或通道，允許離子、代謝物、蛋白質，和/或生物活性分子的擴散，和/或允許細胞滲入和透過網絡，并在細胞和納米纖維之間促進多點粘附的環(huán)境中生長。
如圖1C所示，納米纖維網絡以取向的方式進行電紡。所述取向的電紡允許制備納米纖維網絡，包括納米纖維單層或由連續(xù)納米纖維形成的單層，其中網絡高度為單個納米纖維的直徑。通過在電紡絲過程中控制納米纖維在基層上定向和/或取向，選擇物理性質，包括多孔性，硬度，纖維密度，質地，粗糙度，和單層網絡的纖維取向。優(yōu)選孔的尺寸允許細胞滲透和/或遷移穿過單層納米纖維網絡。在一個實施方案中，纖維之間間隙約0.01至約25微米。在另一個實施方案中，纖維之間間隙是約2至約10微米。
個別單層網絡的成層在納米纖絲結構中形成通道，允許離子、代謝物、蛋白質和/或生物活性分子的擴散，和允許細胞滲透納米纖絲結構，并在細胞和納米纖維網絡之間促進多點粘附的環(huán)境中生長。
也可使用相位分離技術以制備納米纖絲結構。相位分離工藝一般包括聚合物分解，相位分離和形成凝膠，從帶水凝膠中溶劑萃取，冷凍，然后在真空下冷凍干燥。使用如下通常步驟將聚合物加入溶劑中，例如加入THF使溶液約1％(wt/v)到15％(wt/v)。攪拌溶液直至均勻。將聚合物溶液(預熱至50℃)加入Teflon小瓶。然后迅速冷藏含有聚合物溶液的小瓶以形成凝膠。凝膠形成時間依賴于溫度、溶劑和聚合物濃度。凝膠在一溫度下保存至少120分鐘。然后將凝膠浸入蒸餾水以便溶劑交換2天。溶劑交換后，從水中取出凝膠，用濾紙干燥，并冷凍于-18℃。然后在低于0.5mmHg的真空下將冷凍凝膠轉入冷凍干燥的容器直至1周。然后將干燥的骨架保存于干燥器中。
包含納米纖絲結構的納米纖維，可包含如上所述用于改良的納米纖維的一種或多種生物活性分子。生物活性分子可在制備網絡時被摻入納米纖維網絡，或可通過官能團粘附于網絡表面。在一個實施方案中，制備納米纖維的聚合物或聚合物系統可包含一種或多種生物活性分子，包括但不限于脂質、生長因子、分化因子、纖維蛋白以及粘附蛋白。脂質可以是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂或者混合。生長因子優(yōu)選是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。
可將官能團摻入如上所述用于改良的納米纖維的網絡表面。網絡的功能化表面反應，以將肽、多肽、脂質、碳水化合物、多醣、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子結合于網絡表面。在一個實施方案中，網絡的功能化表面反應，以結合一種或多種生物活性分子。一種或多種生物活性分子優(yōu)選是生長因子、分化因子、纖維蛋白，和/或粘附蛋白。生長因子優(yōu)選是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。
ii.基層納米纖絲結構的結構性質，例如強度和彈性，大部分由沉積納米纖維網絡的基層提供。基層可包括纖維素、玻璃或塑料。塑料優(yōu)選是無細胞毒性的。基層是薄膜或培養(yǎng)容器。薄膜厚度優(yōu)選不超過約10至約1000微米。
基層是水溶性的或非水溶性的。水溶性的基層優(yōu)選是聚乙烯醇膜，可與聚乙烯醇纖維基質使用。基層是多孔性或非多孔性的。基層多孔性由細胞滲透率確定。細胞能透過多孔基層但不能透過非多孔基層。多孔基層中孔直徑優(yōu)選是約2μm至約10μm?；鶎邮巧锟山到獾暮?或生物可分解的。基層優(yōu)選是生物相容的。
基層包含一種或多種生物活性分子。生物活性分子在制備基層時被摻入基層，或通過官能團粘附于基層表面。官能團可摻入基層表面，如用于改良的納米纖維所述。基層的功能化表面反應，以將肽、碳水化合物、多醣、脂質、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子結合于基層表面。
在一個實施方案中，基層的功能化表面反應，以結合一種或多種生物活性分子。一種或多種生物活性分子優(yōu)選是生長因子、分化因子、纖維蛋白和/或粘附蛋白。生長因子優(yōu)選是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF?；鶎涌舍尫乓环N或多種生物活性分子。釋放率由基層的分解和/或降解速率確定。
iii.隔片納米纖絲結構的結構性質，例如強度和彈性，還可由隔片提供。隔片還可在納米纖維網絡和基層之間提供充分間隔，或在兩種或多種納米纖絲結構之間提供充分間隔，以允許細胞滲透并粘附于納米纖維。
在一個實施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接觸沉積于基層的納米纖維網絡表面，隔片的第二表面接觸基層表面，致使納米纖維網絡和基層被隔片的直徑或厚度隔開。在另一個實施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接觸第一納米纖絲結構的表面，隔片的第二表面接觸第二納米纖絲結構的表面，致使兩個納米纖絲結構被隔片的直徑或厚度隔開。
隔片包括細纖維或薄膜。薄膜厚度優(yōu)選為不大于約10至約50微米。細纖維包括微纖維。微纖維直徑優(yōu)選為約1微米至約10微米。微纖維是解開的或網狀的?？蓮脑S多聚合物，包括纖維素、聚酰胺、聚酯和聚四氟乙烯，制備微纖維。
隔片是水溶性的或非水溶性的。隔片是多孔的或非多孔的?；鶎拥亩嗫仔杂杉毎麧B透率確定。細胞能透過多孔隔片但不能透過非多孔隔片。多孔隔片的孔直徑優(yōu)選是約2μm至約10μm。隔片是生物可降解的和/或生物可溶解的。隔片優(yōu)選是生物相容的。
隔片包含一種或多種生物活性分子。生物活性分子在制備隔片時被摻入隔片，或通過官能團粘附于隔片表面。官能團可摻入隔片表面，如用于改良的納米纖維所述。隔片的功能化表面反應，以將肽、碳水化合物、多醣、脂質、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子結合于隔片表面。
在一個實施方案中，隔片的功能化表面反應，以結合一種或多種生物活性分子。一種或多種生物活性分子優(yōu)選是生長因子、分化因子、纖維蛋白和/或粘附蛋白。生長因子優(yōu)選是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。分化因子優(yōu)選是神經營養(yǎng)蛋白、CSF或TGF。隔片可釋放一種或多種生物活性分子。釋放率由隔片的分解和/或降解速率確定。
iii.納米纖絲結構的多層組合本發(fā)明的納米纖絲結構可用于多種應用，包括細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)應用，用于藥物發(fā)現的高通量應用和過濾應用。在一個應用中，納米纖絲結構可被單獨使用或分層使用，以形成用于細胞或組織培養(yǎng)的多層納米纖絲的組合。納米纖絲結構具有許多體內和體外用途，包括修復傷口，培育人造皮膚、靜脈、動脈、腱、韌帶、軟骨、心臟瓣膜，器官培養(yǎng)，治療燒傷，以及骨移植。
細胞或組織生長環(huán)境的不同陣列可由將特定化學和物理性質工程設計入納米纖維網絡，基層和/或隔片構建，包括單個納米纖絲結構和/或連續(xù)分層的單個納米纖絲結構。改變和/或更改單個納米纖絲結構的物理性質和/或特征，包括但不限于，質地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、彈性、幾何性、相互連接性、面積體積比、纖維直徑、纖維可溶性/不可溶性、親水性/疏水性，纖維密度，和纖維取向，以構建納米和/或微米環(huán)境，促進一種或多種選定的細胞活性，包括生長和/或分化。在單個納米纖絲結構中或包含兩種或多種分層納米纖絲結構的單元陣列中工程設計特定納米和/或微米環(huán)境。
特定的識別基元，例如肽、多肽、脂質、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能團、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程設計入納米纖絲網絡、基層和/或單個納米纖絲結構的或多層納米纖絲組合的隔片，或以各向同性或以梯度性提高合適的細胞活性，包括細胞生長和/或分化。涉及氨基酸、肽、多肽和蛋白質的實施例可包括具有任意大小和復雜性的所述分子類型，以及所述分子的組合。示例包括但不限于，結構蛋白、酶和肽激素。
許多細胞類型可在納米纖絲結構上生長，包括但不限于，干細胞、定向干細胞、分化細胞和腫瘤細胞。干細胞示例包括但不限于，胚胎干細胞、骨髓干細胞和臍帶干細胞。用于各種實施方案的其它細胞示例包括但不限于，造骨細胞、成肌細胞、成神經細胞、成纖維細胞、成神經膠質細胞、生殖細胞、肝細胞、軟骨細胞、角質化細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、結締組織細胞、神經膠質細胞、上皮細胞、內皮細胞、激素分泌細胞、免疫系統細胞以及神經細胞。在一些實施方案中，不必預篩選所要使用的干細胞類型，因為通過將單個納米纖絲結構或多層組合傳遞至給定的器官，工程設計單個納米纖絲結構或多層納米纖絲組合的物理和/或化學特性，多種干細胞類型可被誘導以在器官特定模式分化。例如，通過將合適的分化和/生長因子工程設計入納米纖絲結構，或將包含干細胞的納米纖絲結構植入肝中，可誘導干細胞成為肝細胞。納米纖絲結構中的細胞可用于提供細胞種植、生產某些化合物或兩者的目的。
本發(fā)明所用的細胞，可在體外培養(yǎng)、從自然來源衍生、遺傳工程設計或通過其它方法生產。可使用任何自然來源的原核或真核細胞。納米纖絲結構被植入機體的實施方案，可使用來自受體的細胞、來自非特定的供體細胞或來自不同種的供體細胞，或者細菌或微生物細胞。包括從來源收獲的和使用前培養(yǎng)的細胞。
一些實施方案使用非典型或異常的細胞，例如腫瘤細胞。可工程設計納米纖絲結構的物理和/或化學性質，包括生長和分化因子，其上生長所述細胞，以模擬腫瘤的自然體內納米或微環(huán)境。在納米纖絲結構上培養(yǎng)的腫瘤細胞可提供用于評價藥物治療的體內自然腫瘤環(huán)境的更準確的說明。腫瘤細胞在本發(fā)明的納米纖絲結構上的生長，便于特征化類體內環(huán)境中腫瘤的生物化學途徑和活性，包括基因表達、受體表達和多肽生成，允許研制特定靶向腫瘤的藥物。
一些實施方案使用經過遺傳工程設計的細胞。工程設計包括設計細胞程序以表達一種或多種基因、抑制一種或多種基因的表達，或兩者。一個用于本發(fā)明的遺傳工程設計細胞的實施例，是遺傳工程設計可產生和分泌一種或多種預期生物活性分子的細胞。當包含遺傳工程設計的細胞的納米纖絲結構被植入機體時，所產生的分子可產生局部效果或系統效果，并包括以上識別的分子作為可能物質。在實施方案中細胞也可以產生抗原性物質，其中納米纖絲結構的目的之一是產生免疫應答。細胞可產生物質以幫助下列非包括性列舉的用途抑制或刺激炎癥；促進愈合；阻止免疫排斥；提供激素代替物；更換神經遞質；抑制或殺死癌細胞；促進細胞生長；抑制或刺激血管形成；增大組織；和補充或更換皮膚、滑液、腱、軟骨、韌帶、骨、肌肉、器官、硬腦膜、血管、骨髓，以及胞外基質。
遺傳工程設計包括，例如，添加遺傳物質至細胞或從細胞除去遺傳物質、改變現有遺傳物質，或兩者。細胞被轉染或被另外工程設計以表達基因的實施方案，可以使用暫時或永久的轉染基因，或兩者?；蛐蛄惺侨L或部分長度的、克隆或天然存在的。
在一個實施方案中，活細胞沉積于納米纖絲結構上。通過改變和/或更改納米纖維網絡選定的物理和/或化學性質，促進特定細胞或組織的細胞活性的納米和/或微環(huán)境可被工程設計入納米纖絲結構中。物理和/或化學性質可被工程設計入單個納米纖絲結構中，如上所述。將包含細胞的納米纖絲結構在促進細胞活性(包括生長和/或分化)的條件下培養(yǎng)。
在另一個實施方案中，將兩種或多種納米纖絲結構分層，以形成多層納米纖絲組合。通過使具有選定的物理和/或化學性質的納米纖絲結構分層，構建促進特定細胞或組織的細胞活性的納米和/或微環(huán)境。物理和/或化學性質可被工程設計入單個納米纖絲結構，如上所述。將活細胞沉積于多層納米纖絲組合，并將組合在促進沉積細胞的生長和/和分化的條件下培養(yǎng)。
在另一個實施方案中，在不同培養(yǎng)條件下將多種細胞類型在單個納米纖絲結構上培養(yǎng)，然后在無菌條件下以手動或機械層層組合入特定多層納米纖絲的組合。在單個納米纖絲結構中通過改變和/或改良選定的納米纖絲結構的物理和/化學性質，或在組合中通過選擇性分層單個納米纖絲結構，可工程設計促進特定細胞類型的細胞活性的納米和/或微環(huán)境，以獲得預期的納米或微環(huán)境。如上所述進行工程設計物理和/或化學特征。然后多層納米纖絲組合在促進細胞活性(包括細胞生長和/或分化)的條件下培養(yǎng)。
在另一個實施方案中，在不同培養(yǎng)條件下將多種細胞類型在單個納米纖絲結構培養(yǎng)。定制單個納米纖絲結構的物理和化學性質以用于特定細胞型。納米纖絲結構的基層和/或隔片是生物可降解的和/或生物可分解的，允許在培養(yǎng)中控制生物活性分子的釋放。選擇促進預期細胞活性(包括生長和/或分化)的生物分子。然后在無菌條件下單個納米纖絲結構以手動或機械層層組合為多層納米纖絲組合。將多層納米纖絲組合分層，以創(chuàng)造促進預期細胞活性(包括生長和/或分化)的納米和/或微環(huán)境。將包含生物活性分子的生物可降解的和/或生物可分解的隔片，插入包含組合的分層納米纖絲結構之間，以在組合中精調納米和/或微環(huán)境。生物活性分子從隔片釋放的速率由包含隔片的聚合物的生物可降解和/或生物可分解的速率確定。然后組合的單元陣列在促進細胞活性(包括細胞增殖和/或分化)的條件下培養(yǎng)。
在另一個實施方案中，單獨包裹納米纖絲結構并進行滅菌。去掉包裝后，納米纖絲結構在培養(yǎng)容器中以手動或機械進行層層組裝，以形成多層納米纖絲組合。
需要評價人體中用于體內應用的新材料(例如本發(fā)明的納米纖絲結構和多層納米纖絲組合)的降解和可能再分布。植入人體特定位置的材料，可以被降解，然后可運送到遠離插入的原始位置的其它區(qū)域。為了檢測體內納米纖維的降解性質，將包含單個納米纖絲結構或多層組合的納米纖維網絡、基層和/或隔片可由熒光標記物進行標記，如上用于改良的納米纖維所述。在一個實施方案中，熒光標記物是量子點。由于量子點對于磁共振成像是熒光的和不透明的，使用多重光子熒光顯微鏡(用于檢測分離組織)和MRI(用于體內分析)以探測和追蹤組織中量子點的分布，其中量子點含有多層納米纖絲組合的片段或分解產物，并確定當插入體內的不同組織或位置時組合的分解產物是否引起顯著的異物應答。
iv.附加用途在另一個應用中，將本發(fā)明的納米纖絲結構用于高通量應用中以分析藥物/細胞相互作用。高通量應用是用于發(fā)現新藥物的重要方法。高通量應用使用密度高達每板約1536孔的多孔組織培養(yǎng)小室。增加每孔的細胞群體可利于增強檢測信號。在一個實施方案中，將納米纖絲結構插入孔中。在另一個實施方案中，孔表面起基層的作用，使得納米纖維網絡直接沉積于孔表面上。將該納米纖絲結構引入孔中，可提供用于細胞、配體和/或酶粘附的額外表面，而不影響實施光學檢測的能力。
在另一個應用中，納米纖絲結構可用于純化和/或分離用途。將單個納米纖絲結構分層以形成層析柱。使用物理和/或化學性質(包括尺寸、電荷、疏水性和對其它分子的親合性)從，例如，溶液中分離蛋白質。在一個實施方案中，將單個納米纖絲結構分層以形成層析柱。將物理和/或化學性質(例如，包括特定官能團、包含特定受體的多肽，或免疫球蛋白)工程設計入或粘附于納米纖絲結構，以從溶液中選擇性結合特定多肽。溶液穿過多層納米纖絲組合，使得多肽結合基質。通過溶劑從組合上釋放結合多肽。在另一個實施方案中，將單個納米纖絲結構分層以形成過濾柱。將物理性質(例如，包括多孔性和纖絲密度)工程設計入多層納米纖絲組合中，使得根據多肽尺寸從溶液分離多肽。在另一個實施方案中，將單個納米纖絲結構分層以形成離子交換柱。將化學性質(例如，包括負電荷和/或正電荷官能團)工程設計入或粘附于納米纖絲結構中。
在另一個應用中，使用本發(fā)明的結構制備生物反應器。
C.細胞培養(yǎng)基本發(fā)明另一個方面是細胞培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)基包含基質、墊片、網絡、片或卷。在一個實施方案中，培養(yǎng)基包含納米纖維基質。納米纖維可由聚合物或聚合物系統制備，如上所述用于改良的納米纖維。細胞培養(yǎng)基沉積于培養(yǎng)容器的表面或內部。
將培養(yǎng)基制成適于培養(yǎng)容器的預期尺寸。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含納米纖維基質，其中網絡具有約50nm至約1000nm的纖維直徑，至少約2微米的平均纖維間隙，約30％或更少的基質硬度，和具有外壁的頂部和底部，其中外壁高度約10微米至約100mm，頂部和底部面積分別為約5mm2至4×105mm2。通過削減含有培養(yǎng)基的片、卷、基質、網絡或墊片的尺寸，或從含有培養(yǎng)基的基質、片、卷、網絡或墊片切下預期尺寸的切片，篩選或調整培養(yǎng)基的大小直至適于培養(yǎng)容器的選定尺寸。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含納米纖維網絡，其中網絡尺寸適于插入培養(yǎng)容器。
細胞培養(yǎng)基可用于各種應用，包括細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)應用。上述任意細胞可在細胞培養(yǎng)基上生長。在一個實施方案中，單獨包裹培養(yǎng)基并進行滅菌。去掉包裝后，將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)容器中以形成細胞生長表面。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基沉積于培養(yǎng)容器內表面上。單獨包裹包含細胞生長基質的培養(yǎng)容器并進行滅菌。去掉包裝后，細胞在培養(yǎng)容器中沉積于細胞培養(yǎng)基上。在細胞培養(yǎng)基中生長的細胞具有許多體內和體外用途，包括修復傷口，培育人造皮膚、靜脈、動脈、腱、韌帶、軟骨、心臟瓣膜，器官培養(yǎng)，治療燒傷，以及骨移植。
改變和/或改良細胞培養(yǎng)基的物理性質和/或特征，包括但不限于質地、粗糙度、粘附性、多孔性、彈性、硬度、幾何性以及纖維密度，以促進包括生長和/或分化的預期細胞活性。在細胞培養(yǎng)基中工程設計特定納米和/或微環(huán)境。例如，改變和/或改良細胞培養(yǎng)基的多孔性和纖維密度，使得細胞滲透細胞培養(yǎng)基并在三維環(huán)境中生長。細胞培養(yǎng)基的物理性質可被工程設計，如上用于改良的納米纖維和/或納米纖絲結構所述。
特定的識別基元，例如肽、脂質、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能團、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程設計入細胞培養(yǎng)基中，或以各向同性或以梯度，以提高預期的細胞活性，包括細胞生長和/或分化。如上述用于改良的納米纖維和/或納米纖絲結構，工程設計細胞培養(yǎng)基的化學性質。
在另一個應用中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可在高通量應用中用于分析藥物/細胞相互作用。高通量應用使用密度高達每板約1536孔的多孔組織培養(yǎng)小室。增加每孔的細胞群體可利于增強檢測信號。在一個實施方案中，將細胞培養(yǎng)基插入用于分析的組織培養(yǎng)小室的孔中。在另一個實施方案中，孔表面作為細胞培養(yǎng)基的基層，允許納米纖維網絡或基質直接沉積于孔表面上。將該細胞培養(yǎng)基引入孔中，可提供用于細胞、配體和/或酶粘附的額外表面，而不影響實施光學檢測的能力。
實施例本發(fā)明通過下列用于舉例說明實施方案的實施例進行解釋。然而，可對所公開的發(fā)明進行許多改變和實施方案。在任何情況下實施例并不用于限制本發(fā)明。
實施例1電紡包含脂質的聚合物溶液，產生增強的細纖維群體為了用光學顯微鏡目測與脂質加入聚合物溶液有關的纖維直徑的變化，電紡纖維以獲得微纖維。從包含分別補充0，0.25，0.5，1.0和1-％膽固醇(w/w)(Sigrma，St.Louis，MO)的15％聚(ε-己內酯)(w/w)(Dow Tone Polymers，Midland，MI)的氯仿中電紡微纖維。用毛細管針系統電紡纖維。Eppendorf微量移液槍吸頭(黃色)適于5cc注射器。將聚合物溶液倒入注射器，并將連接Nanosecond Optical Pulse Radiator Model NR-1(Optitron，Inc.，Torrance，CA)的正電極插入溶液。電紡電壓是18,000伏。將纖維以水平垂直于注射器的方式電紡到平底金屬板靶。靶距離微量移液槍吸頭2英寸。將纖維收集到位于靶上透明片上。在光學顯微鏡(Insight Bilateral Scanning ConfocalFluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI))下以20X物鏡觀察纖維，并通過CCD相機數字化拍攝圖像。
如圖2A-E所示，膽固醇加入聚合物溶液，生成直徑逐漸更小的纖維。增加加入聚合物溶液的膽固醇量，生成直徑逐漸更小的纖維。從不包含膽固醇的聚合物溶液制備的纖維，直徑范圍是10-50微米(圖2A)。從包含0.25％膽固醇(w/w)的聚合物溶液制備的纖維，直徑范圍是5-30微米(圖2B)。從包含0.5％膽固醇(w/w)的聚合物溶液制備的纖維，直徑范圍是2-20微米(圖2C)。從包含1.0％膽固醇(w/w)的聚合物溶液制備的纖維，直徑范圍是1-15微米(圖1D)。從包含10％膽固醇(w/w)的聚合物溶液制備的纖維，直徑范圍是0.8-8微米(圖2E)。
實施例2包含脂質的納米纖維誘導細胞緊密粘附納米纖維包含脂質的納米纖維提供可促進細胞復原和細胞與納米纖維之間緊密結合的表面。將正常大鼠腎(NRK)成纖維細胞在納米纖維電紡絲上于Dulbecco Modified Eagle′sMedium(DME)、37℃以及5％CO2中培養(yǎng)，并在光學顯微鏡(Insight Bilateral ScanningConfocal Fluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI))下以20X物鏡進行觀察，其中所述電紡絲來自包含補充0.25％鞘磷脂的10％聚(ε-己內酯)(w/w)的氯仿溶液。圖像用CCD相機拍攝。
如圖3A和B所示，包含0.25％鞘磷脂的納米纖維誘導細胞快速復原和粘附納米纖維。圖3A顯示在包被了含有0.25％鞘磷脂的納米纖維的組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)兩天后的NRK成纖維細胞。成纖維細胞緊緊粘附納米纖維，并展開和分開以填滿形成單層的纖維之間的間隙。圖3B顯示在包被了不含有鞘磷脂的納米纖維的組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)兩天后的NRK成纖維細胞。幾乎沒有細胞粘附納米纖維。含脂質納米纖維的定向遷移和緊密粘附性質暗示纖維可用于體內或體外應用，包括修復傷口，培育人造皮膚、靜脈、動脈、腱、韌帶、軟骨、心臟瓣膜，器官培養(yǎng)，治療燒傷，以及骨移植。
實施例3在納米纖維網絡上生長的細胞具有類似于組織中細胞的肌動蛋白網絡細胞肌動蛋白網絡可作為標記物用于確定更接近組織中環(huán)境的細胞培養(yǎng)方法(Cukierman等，2001，Science，231708-1712；Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3137-141)。當在二維組織培養(yǎng)中生長時，成纖維細胞呈現高度伸展和粘附形態(tài)，其中位于細胞質中的肌動蛋白網絡被組織成厚張力纖維陣列。相反，組織中觀察的成纖維細胞在外形上是具有被組織成皮質環(huán)的肌動蛋白的類紡錘體(Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3137-141).
我們比較了在二維和三維表面生長的普通大鼠腎(NRK)成纖維細胞的肌動蛋白網絡。成纖維細胞在聚酰胺納米纖維網絡、玻璃以及用聚賴氨酸包被的玻璃上生長。用旋轉噴射器系統或毛細管針系統電紡聚酰胺納米纖維。兩種系統都產生基本上相同的纖維材料。每次噴射流速是1.5mil/min，8英寸的靶間距，88KV的噴射電壓、45％的相對濕度和35rpm的旋轉噴射速率。
通過對由NRK成纖維細胞表達的綠色熒光蛋白(GFP)-肌動蛋白嵌合體的分布進行成像，監(jiān)控肌動蛋白網絡形成。簡要地，將用GFP-肌動蛋白(Dr.Sanford Simon惠贈，Laboratory of Cellular Biophysics，Rockefeller University，New York，NY)轉染的NRK成纖維細胞在聚酰胺納米纖維、玻璃或用聚1-賴氨酸包被的玻璃上，于DulbeccoModified Eagle′s Medium(DME)和37℃、5％CO2中培養(yǎng)，然后用Insight BilateralScanning Confocal Fluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)檢測。
如圖4A-C所示，在納米纖維網絡的三維生長環(huán)境上生長的細胞，組織成類似于體內觀察的那些細胞骨架網絡。在納米纖維網絡上生長的成纖維細胞顯示具有filipodia的類紡錘體形態(tài)，并顯示幾乎沒有張力纖維(圖4A)。相反，在玻璃表面上生長的成纖維細胞通過許多張力纖維進行展開(圖4B)。在聚1-賴氨酸包被的玻璃表面上生長的成纖維細胞更加地展開，并顯示更厚和更明顯的張力纖維(圖4C)。
這些顯微照片也表明共焦顯微鏡提供快速方法來監(jiān)測活細胞或組織中細胞骨架組織中差異，具有包括纖維網絡物理性質(包括但不限于質地、粗糙度、粘附性、多孔性、彈性、幾何性和纖維密度)和纖維網絡化學性質(包括但不限于生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能團、粘合化合物、解粘化合物和靶向分子)的各種纖維操作的功能。比較在納米纖維網絡上培養(yǎng)細胞或組織的細胞骨架網絡與體內觀察，允許納米纖維網絡的物理和/或化學性質的精諧調更加模擬細胞或組織的體內環(huán)境。
實施例4官能團摻入納米纖維將官能團，例如醇基、醛基、氨基、羧基，和巰基官能團，和光敏官能團，例如卡賓或氮賓摻入納米纖維表面。這些基團可用于共價偶合生物活性分子，包括但不限于多肽(例如生長因子或分化因子)、碳水化合物、脂質、多醣或治療藥物。通過將官能團加入聚合物溶液，官能團被摻入納米纖維。如實施例1所述，從補充2％十二烷胺(w/w)(Sigma，St.Louis，MO)的包含10％聚(ε-己內酯)(w/w)(Dow Tone Polymers，Midland，MI)的氯仿溶液中電紡納米纖維。為了證實納米纖維表面的修飾氨基的有效性，將納米纖維與熒光素異硫氰酸鹽(1mg/ml儲存水溶液)(Sigma，St.Louis，MO)的2.0％磷酸鈉緩沖液(pH8.5)反應。使用Insight Bilateral Scanning Confocal FluorescenceMicroscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)顯示熒光素摻入纖維。如圖5A所示，在未改良的纖維表面上觀察到低水平熒光，這是由于纖維表面吸收未反應的熒光素異硫氰酸鹽。相反，與熒光素異硫氰酸鹽反應后，在含有摻入氨基的納米纖維上，沿著全部纖維觀察到顯著的熒光(圖5B)。
這些數據證實納米纖維改良表面含有用于偶合生物活性分子的官能團，允許按設計摻入分子(例如生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能團、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子)，以在納米纖維網絡中創(chuàng)建納米和/或微環(huán)境，在細胞或組織中促進一種或多種選定的活性，包括生長和/或分化。這些數據也暗示包含特定空間和幾何排列中不同官能團的納米纖維，可通過導入具有合適反應團的肽被誘導進行自我組裝成幾何限定的陣列。
實施例5用量子點標記細纖維為了制備具有不同化學和/或物理性質的纖維并將它們摻入納米纖維混合物或特定單元陣列，同時繼續(xù)保留在混合物或單元陣列中識別各種纖維的能力，我們研究了將熒光標記摻入納米纖維。將1％量子點溶液(Dr.Sanford Simon惠贈，Laboratory ofCellular Biophysics，Rockefeller University，New York，NY)加入包含12％聚(ε-己內酯)(w/w)的氯仿的聚合物溶液。溶液然后如實施例1所述被電紡，生成包含量子點的微纖維群體。在488nm激發(fā)纖維，用Insight Bilateral Scanning Confocal FluorescenceMicroscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)收集微纖維中量子點分布的圖像(圖6)。
在水環(huán)境中淬滅量子點熒光。將水加入微纖維并不能淬滅量子點熒光，表明量子點已經植入纖維基質而不是被纖維表面吸收，這是它們用于水系統的重要考慮因素。
以上說明書、實施例和數據用于解釋本發(fā)明。然而，可對所公開的發(fā)明進行許多改變和實施方案。本文附后的權利要求可具體解釋本發(fā)明。
權利要求
1.一種包含在細胞培養(yǎng)中用于細胞增殖和/或分化的環(huán)境的納米纖絲結構，包括一種或多種納米纖維和基層，其中所述納米纖絲結構由一種或多種納米纖維網絡限定。
2.權利要求1所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約50至1000納米的纖維直徑，至少約2微米的平均纖維間間隔以及約70％或更低的硬度。
3.權利要求2所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約50％或更低的硬度。
4.權利要求2所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約30％或更低的硬度。
5.權利要求2所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約10％或更低的硬度。
6.權利要求2所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約5％或更低的硬度。
7.權利要求1所述的納米纖絲結構，還包含基層，其中一種或多種納米纖維網絡沉積于基層表面。
8.權利要求7所述的納米纖絲結構，其中基層是多孔性塑料基層。
9.權利要求7所述的納米纖絲結構，其中基層是無細胞毒性的。
10.權利要求7所述的納米纖絲結構，其中基層是薄膜。
11.權利要求10所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約50至1000納米的纖維直徑，至少約2微米的平均纖維間間隔以及約70％或更低的硬度。
12.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約50％或更低的硬度。
13.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約30％或更低的硬度。
14.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約10％或更低的硬度。
15.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構包含約5％或更低的硬度。
16.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是水溶性的。
17.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是非水溶性的。
18.權利要求16所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是聚乙烯醇膜。
19.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是生物可降解的。
20.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是生物相容的。
21.權利要求7所述的納米纖絲結構，其中所述基層是非多孔的玻璃基層。
22.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜是多孔的。
23.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述結構包含一種或多種生長因子。
24.權利要求23所述的納米纖絲結構，其中至少一種生長因子是血管內皮生長因子、骨形成因子β、表皮生長因子、內皮生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素生長因子，或轉化生長因子。
25.權利要求23所述的納米纖絲結構，其中所述結構釋放生長因子。
26.權利要求25所述的納米纖絲結構，其中釋放速率由薄膜或纖維的分解或降解速率確定。
27.權利要求11所述的納米纖絲結構，其中所述結構包含一種或多種分化因子。
28.權利要求27所述的納米纖絲結構，其中至少一種分化因子是神經營養(yǎng)蛋白，集落刺激因子或轉化生長因子。
29.權利要求27所述的納米纖絲結構，其中所述薄膜或纖維釋放分化因子。
30.權利要求29所述的納米纖絲結構，其中釋放速率由薄膜或纖維分解或降解速率確定。
31.權利要求1所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維包含無細胞毒性的聚合物。
32.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述聚合物是生物可降解的。
33.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述聚合物是水溶性的。
34.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述聚合物是非水溶性的。
35.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述聚合物是聚酯。
36.權利要求35所述的納米纖絲結構，其中所述聚酯是聚ε-己內酯、聚羥乙酸酯或聚乳酸酯。
37.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述聚合物是聚酰胺。
38.權利要求37所述的納米纖絲結構，其中所述聚酰胺是尼龍。
39.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維還包含一種或多種生物活性分子。
40.權利要求39所述的納米纖絲結構，其中至少一種生物活性分子是脂質、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其雜交分子。
41.權利要求40所述的納米纖絲結構，其中所述脂質是溶性卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、膽固醇或其混合。
42.權利要求40所述的納米纖絲結構，其中所述多醣是纖維素、淀粉、褐藻酸、殼聚糖或透明質酸。
43.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維還包含促進細胞粘附納米纖維的生物學化合物。
44.權利要求31所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維還包含一種或多種醇基、醛基、氨基、羧基、巰基或光敏官能團。
45.權利要求44所述的納米纖絲結構，其中所述光敏官能團是卡賓或氮賓。
46.權利要求1所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維包含一種或多種生長因子。
47.權利要求46所述的納米纖絲結構，其中至少一種生長因子是血管內皮生長因子、骨形成因子β、表皮生長因子、內皮生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素生長因子或轉化生長因子。
48.權利要求46所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維釋放一種或多種生長因子。
49.權利要求48所述的納米纖絲結構，其中所述生長因子釋放速率由納米纖絲結構的降解或分解速率確定。
50.權利要求1所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維包含一種或多種分化因子。
51.權利要求50所述的納米纖絲結構，其中至少一種分化因子是神經營養(yǎng)蛋白、集落刺激因子或轉化生長因子。
52.權利要求50所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖維釋放一種或多種分化因子。
53.權利要求50所述的納米纖絲結構，其中所述分化因子的釋放速率由納米纖絲結構的降解或分解速率確定。
54.權利要求1所述的納米纖絲結構，包含適于插入培養(yǎng)容器的寬度和深度。
55.權利要求54所述的納米纖絲結構，其中所述納米纖絲結構的寬度和深度適于插入培養(yǎng)板的孔中。
56.權利要求54所述的納米纖絲結構，其中所述培養(yǎng)容器選自單孔培養(yǎng)板，多孔培養(yǎng)板，小室培養(yǎng)載玻片，多小室培養(yǎng)載玻片，蓋玻片，吸杯，燒瓶，試管，瓶，灌注槽，生物反應器以及發(fā)酵罐。
57.一種包含權利要求1所述的納米纖絲結構的組織培養(yǎng)容器。
58.權利要求57所述的組織培養(yǎng)容器，其中所述培養(yǎng)容器選自單孔培養(yǎng)板，多孔培養(yǎng)板，小室培養(yǎng)載玻片，多小室培養(yǎng)載玻片，蓋玻片，吸杯，燒瓶，試管，瓶，灌注槽，生物反應器以及發(fā)酵罐。
59.一種包含聚合物和生物活性分子的納米纖絲結構，該結構包含細胞培養(yǎng)中適于活細胞生長的環(huán)境，其中所述納米纖絲結構基本上是無膠原質、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、水溶性差的藥物化合物，或其混合。
60.一種制造權利要求1所述的納米纖絲結構的方法，包括電紡一種或多種納米纖維網絡。
61.一種制造權利要求7所述的納米纖絲結構的方法，包括將一種或多種納米纖維網絡電紡到基層表面。
62.一種制備組織的方法，包括a)分層權利要求1所述的兩種或多種納米纖絲結構，以形成多層納米纖絲組合，包含在細胞培養(yǎng)中適于活細胞生長的環(huán)境；b)將活細胞沉積于所述組合；和c)在促進沉積細胞生長和/或分化的條件下培養(yǎng)組合。
63.權利要求62所述的方法，其中所述分層的納米纖絲結構通過隔片分離。
64.權利要求63所述的方法，其中所述隔片包含解開的或網狀的微纖維。
65.權利要求63所述的方法，其中所述隔片包含多孔膜。
66.權利要求64所述的方法，其中所述微纖維包含纖維素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。
67.權利要求62所述的方法，其中單個納米纖絲結構包含一種或多種生長因子、粘合化合物，和/或靶向化合物。
68.一種制備組織的方法，包括a)在權利要求1所述的單個納米纖絲結構上培養(yǎng)多個細胞，其中每個單個納米纖絲結構含有特定細胞類型；b)分層兩個或多個單個納米纖絲結構，以形成細胞的多層陣列；和c)在促進細胞增殖和/或分化的條件下培養(yǎng)陣列。
69.權利要求68所述的方法，其中所述分層的納米纖絲結構通過隔片分離。
70.權利要求69所述的方法，其中所述隔片包含解開的或網狀的微纖維。
71.權利要求69所述的方法，其中所述隔片包含多孔膜。
72.權利要求70所述的方法，其中所述微纖維包含纖維素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。
73.權利要求68所述的方法，其中單個納米纖絲結構包含一種或多種生長因子、粘合化合物、解粘化合物，和/或靶向化合物。
74.權利要求73所述的方法，其中選擇每個單個納米纖絲結構的生長因子、粘合化合物、解粘化合物和/或靶向化合物，以促進特定細胞類型的生長和/或分化。
75.一種包含脂質的電紡絲纖維。
76.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述脂質是親脂性化合物、磷脂化合物、鞘磷脂化合物，或其混合。
77.權利要求76所述的電紡絲纖維，其中所述脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、膽固醇，或其混合。
78.權利要求76所述的電紡絲纖維，還包含無細胞毒性的聚合物。
79.權利要求78所述的電紡絲纖維，其中所述聚合物是生物可降解的。
80.權利要求78所述的電紡絲纖維，其中所述聚合物是水溶性的。
81.權利要求78所述的電紡絲纖維，其中所述聚合物是非水溶性的。
82.權利要求78所述的電紡絲纖維，其中所述聚合物是聚酯。
83.權利要求82所述的電紡絲纖維，其中所述聚酯是聚(ε-己內酯)、聚(羥乙酸酯)或聚(乳酸酯)。
84.權利要求78所述的電紡絲纖維，其中所述聚合物是聚酰胺。
85.權利要求84所述的電紡絲纖維，其中所述聚酰胺是尼龍。
86.權利要求75所述的電紡絲纖維，還包含納米級無機填料。
87.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維直徑約50nm至1000nm。
88.權利要求87所述的電紡絲纖維，其中所述纖維直徑約300nm。
89權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維還包含一種或多種生物活性分子。
90.權利要求89所述的電紡絲纖維，其中至少一種生物活性分子是脂質、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其雜交分子。
91.權利要求90所述的電紡絲纖維，其中所述脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、膽固醇，或其混合。
92.權利要求90所述的電紡絲纖維，其中所述多醣是纖維素、淀粉、糖原、褐藻酸、殼聚糖，或透明質酸。
93.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維還包含促進細胞粘附纖維的生物學化合物。
94.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維還包含一種或多種醛基、醇基、氨基、巰基，或光敏官能團。
95.權利要求94所述的電紡絲纖維，其中所述光敏官能團是卡賓或氮賓。
96.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維包含一種或多種生長因子。
97.權利要求96所述的電紡絲纖維，其中至少一種生長因子是血管內皮生長因子、骨形成因子β、表皮生長因子、內皮生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素生長因子或轉化生長因子。
98.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維包含一種或多種分化因子。
99.權利要求98所述的電紡絲纖維，其中至少一種分化因子是神經營養(yǎng)蛋白、集落刺激因子或轉化生長因子。
100.權利要求75所述的電紡絲纖維，其中所述纖維包含一種或多種粘附分子。
101.權利要求100所述的電紡絲纖維，其中至少一種粘附分子是纖維連接蛋白或層粘蛋白或衍生于這些大分子的粘附肽。
102.一種制造權利要求75所述的電紡絲纖維的方法，包括電紡親脂性分子和聚合物。
103.一種制造多種納米纖維的方法，包括對含有聚合物和影響聚合物包裝的添加劑組分的溶液進行電紡，其中與從不含添加劑組分的聚合物溶液產生的多種納米纖維相比，通過該方法生產的多種納米纖維具有更高百分率的細纖維。
104.權利要求103所述的方法，其中所述細纖維直徑約5納米至約1000納米。
105.權利要求104所述的方法，其中所述細纖維直徑約50納米至約400納米。
106.權利要求104所述的方法，其中所述細纖維直徑約5納米至約50納米。
107.權利要求103所述的方法，其中所述添加劑組分包含脂質。
108.權利要求107所述的方法，其中所述脂質是膽固醇。
109.一種通過改變彈性生產納米纖維的方法，包括電紡含有聚合物和添加劑組分的溶液。
110.權利要求109所述的方法，其中所述添加劑組分包含交聯劑。
111.權利要求109所述的方法，其中所述添加劑組分包含脂質。
112.權利要求111所述的方法，其中所述脂質是膽固醇。
113.一種包含納米纖維基質的細胞培養(yǎng)基，其中所述基質包含直徑約50至1000微米的纖維，至少約2微米的平均纖維間間隔，約30％的基質硬度，并且所述基質具有帶外壁的頂部和底部，其中所述外壁高度約10微米至約100mm，頂部和底部面積分別為約5mm2到約4×105mm2。
114.一種權利要求113所述的培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基。
115.一種權利要求113所述的培養(yǎng)孔和培養(yǎng)基，其中外壁高度和頂部及底部的面積適于培養(yǎng)孔的尺寸。
116.一種包含納米纖維網絡的細胞培養(yǎng)基。
117.權利要求116所述的培養(yǎng)基，適于插入培養(yǎng)容器。
118.一種包含熒光標記物的電加工纖維。
119.權利要求118所述的電加工纖維，還包含脂質。
120.權利要求119所述的電加工纖維，其中所述脂質是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、膽固醇，或者其混合。
121.權利要求118所述的纖維，其中所述熒光標記物是非光可漂白的。
122.權利要求121所述的纖維，其中所述熒光標記物是納米晶體。
123.權利要求122所述的纖維，其中所述納米晶體是量子點。
124.權利要求118所述的纖維，其中所述熒光標記物是熒光團。
125.權利要求118所述的纖維，其中所述熒光標記物是pH不敏感的。
126.權利要求118所述的纖維，其中所述熒光標記物是離子敏感的。
127.權利要求118所述的納米纖維，其中所述熒光標記物對與其它分子絡合敏感。
128.權利要求118所述的納米纖維，還包含誘導納米纖維自身熒光的光學添加劑。
129.一種識別納米纖維的方法，包括用熒光標記物標記納米纖維。
130.一種識別納米纖維化學性質或物理性質的方法，該方法包括a)分配熒光標記物給納米纖維化學性質或物理性質；和b)用熒光標記物標記納米纖維。
131.權利要求130所述的方法，其中所述物理性質是直徑。
132.權利要求130所述的方法，其中所述化學性質是生物活性分子。
133.權利要求132所述的方法，其中所述生物活性分子是生長因子、分化因子、纖維蛋白、粘附蛋白，或其混合。
134.一種多層納米纖絲組合，包括權利要求1所述的兩種或多種納米纖絲結構分層以形成多層組合。
135.權利要求134所述的多層納米纖絲組合，還包含具有厚度和第一和第二表面的隔片，其中所述隔片的第一表面接觸第一納米纖絲結構表面，所述隔片的第二表面接觸第二納米纖絲結構表面，致使第一和第二納米纖絲結構被隔片的厚度隔開。
全文摘要
公開了用于細胞培養(yǎng)和組織工程的納米纖絲結構。納米纖絲結構可用于各種應用，包括用于增殖和/或分化細胞以及制備組織的方法。還公開了改良納米纖維，包含脂質、親脂性分子或化學修飾表面。納米纖維可用于各種應用，包括形成用于細胞培養(yǎng)和組織工程的納米纖絲結構。
文檔編號D01F9/00GK1973029SQ200480032454
公開日2007年5月30日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權日2003年11月5日
發(fā)明者梅爾文S·辛德勒, 侯Y·鐘 申請人:密執(zhí)安州大學