專利名稱：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的固液兩步培養(yǎng)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利是一種植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的新方法，適用于各種植物細(xì)胞培養(yǎng)，特別對(duì)于具有抑制細(xì)胞分裂功能的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)更有效。
背景技術(shù)：
在植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的技術(shù)領(lǐng)域，長(zhǎng)期以來困擾或阻礙其產(chǎn)業(yè)化的最大障礙是因植物細(xì)胞增殖速度緩慢、代謝產(chǎn)物合成時(shí)間長(zhǎng)以及有效成分含量低等因素造成的生產(chǎn)成本過高?？偨Y(jié)以往的研究結(jié)果會(huì)發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞在固體培養(yǎng)基中的增殖量可以達(dá)到5～20倍/30天，而在液體培養(yǎng)基中的增殖量一般為2～4倍/30天。雖然在固體培養(yǎng)中細(xì)胞的增殖速度較快，但是由于其培養(yǎng)基傳質(zhì)不良而又不利于其次生代謝產(chǎn)物的合成。在很多植物細(xì)胞培養(yǎng)中，由于其次生代謝產(chǎn)物在細(xì)胞中積累以后會(huì)抑制DNA的合成或細(xì)胞分裂，所以其細(xì)胞增殖與代謝產(chǎn)物合成相互矛盾。以往的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法主要與微生物細(xì)胞培養(yǎng)法一樣，采取細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)，也就是在培養(yǎng)前期促進(jìn)細(xì)胞增殖，在后期改變培養(yǎng)條件促進(jìn)產(chǎn)物合成，這樣做由于細(xì)胞的增殖量較少，所以對(duì)于后期的產(chǎn)物合成量也有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物技術(shù)中，植物細(xì)胞生長(zhǎng)與其代謝產(chǎn)物合成具有相互抑制作用的矛盾，促進(jìn)細(xì)胞快速增殖，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于該方法包括如下步驟1)在植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg生長(zhǎng)素、0.1～4mg細(xì)胞分裂素，以及20～60g蔗糖或葡萄糖，調(diào)pH值在5.5～7，作為基本培養(yǎng)基；2)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液加入7～10g瓊脂或2g高效凝固劑制成固體培養(yǎng)基；將篩選出的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下培養(yǎng)，獲得植物愈傷組織；3)取所述基本培養(yǎng)基，向其中添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子，將培養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.5～7，經(jīng)滅菌消毒后配成液體培養(yǎng)基；4)將步驟2)中獲得的植物愈傷組織用一定孔徑的不銹鋼網(wǎng)進(jìn)行篩分(不同種植物的愈傷組織對(duì)孔徑的要求不同)，然后將篩分后的一定大小的植物愈傷組織顆粒接種在所述液體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下，催化合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物；5)收取細(xì)胞團(tuán)和培養(yǎng)液，并通過分離純化獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明所述植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基為Murashige & Skoog培養(yǎng)基、Miller培養(yǎng)基、Gamborg培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、Heller培養(yǎng)基、Linsmaier & Skoog培養(yǎng)基或sss培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述生長(zhǎng)素優(yōu)選為吲哚乙酸、α-萘乙酸或2，4二氯苯氧乙酸。
本發(fā)明所述細(xì)胞分裂素優(yōu)選為6-芐氨基嘌呤或激動(dòng)素。
本發(fā)明所述促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子為苯丙氨酸、酪氨酸、甲基茉莉酮酸或咖啡酸。
在步驟2)中，將篩選出的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下培養(yǎng)15～25天獲得植物愈傷組織。
所述植物愈傷組織接種在裝有所述液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置或生物反應(yīng)器中，在20～25℃避光或照光條件下，培養(yǎng)2-10天合成目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明的一種改進(jìn)為利用兩種不同的植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基，按照步驟1)中所述方法配制出兩種基本培養(yǎng)基，在步驟2)和步驟3)中各選取一種基本培養(yǎng)基，用來配制固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。
采取固液兩步培養(yǎng)法可以在固體培養(yǎng)步驟將植物細(xì)胞的生物量在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)增長(zhǎng)到5～20倍(4周)，在液體培養(yǎng)步驟在2～10天內(nèi)將目標(biāo)代謝產(chǎn)物的含量提高到種子細(xì)胞的數(shù)倍～數(shù)十倍。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1(1)在Murashige & Skoog(MS)改良培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg的α-萘乙酸(NAA)，0.1～4mg的激動(dòng)素(kinetin)，以及30～50g蔗糖；用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7，作為基本培養(yǎng)基。
(2)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液加入2g高效凝固劑(Gellan gum)，經(jīng)過加溫溶解后，分裝在培養(yǎng)器皿中，經(jīng)過125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻為固體培養(yǎng)基；將篩選出的肉蓯蓉愈傷組織高產(chǎn)株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在25℃避光條件下培養(yǎng)20～25天，獲得植物愈傷組織。
(3)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)苯丙氨酸50～500mg和酪氨酸50～400mg，將培養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.5～7，然后分裝到培養(yǎng)器或生物反應(yīng)器中，經(jīng)125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后進(jìn)行冷卻處理，配成液體培養(yǎng)基。
(4)將在步驟(2)中獲得的愈傷組織，用孔徑為0.5～1mm的不銹鋼網(wǎng)將愈傷組織篩分，然后接種在步驟(3)配制的液體培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置或生物反應(yīng)器中于25℃，避光或照光條件下催化合成目標(biāo)產(chǎn)物，5～10天后完成合成反應(yīng)過程；(5)收獲細(xì)胞和培養(yǎng)液提取和分離其有效成分，獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
實(shí)施例2(1)在Gamborg(B5)改良培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg的2，4二氯苯氧乙酸，0.1～4mg的6-芐氨基嘌呤(BA)，以及30～50g蔗糖；用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7，作為基本培養(yǎng)基。
(2)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液加入7～10g瓊脂，經(jīng)過加溫溶解后，分裝在培養(yǎng)器皿中，經(jīng)過125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻為固體培養(yǎng)基；將篩選出的紫杉愈傷組織高產(chǎn)株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在25℃避光條件下培養(yǎng)20～25天，獲得植物愈傷組織。
(3)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)苯丙氨酸50～500mg以及誘導(dǎo)子甲基茉莉酮酸100mg，將培養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.5～7，然后分裝到培養(yǎng)器或生物反應(yīng)器中，經(jīng)125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后進(jìn)行冷卻處理，配成液體培養(yǎng)基。
(4)將在步驟(2)中獲得的愈傷組織，用孔徑為0.5～1mm的不銹鋼網(wǎng)將愈傷組織篩分，然后接種在步驟(3)配制的液體培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置或生物反應(yīng)器中于25℃，避光或照光條件下催化合成目標(biāo)產(chǎn)物，2～7天后完成合成反應(yīng)過程；(5)收獲細(xì)胞和培養(yǎng)液提取和分離其有效成分，獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
實(shí)施例3(1)在Murashige & Skoog(MS)改良培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg的吲哚乙酸(IAA)，0.1～4mg的6-芐氨基嘌呤(BA)，以及30～50g蔗糖；用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7，作為第一種基本培養(yǎng)基。
在Miller改良培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg的吲哚乙酸(IAA)，0.1～4mg的6-芐氨基嘌呤(BA)，以及20～50g蔗糖；用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7，作為第二種基本培養(yǎng)基。
(2)取所述第一種基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液加入7～10g瓊脂，經(jīng)過加溫溶解后，分裝在培養(yǎng)器皿中，經(jīng)過125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻為固體培養(yǎng)基；將篩選出的肉蓯蓉愈傷組織高產(chǎn)株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在25℃避光條件下培養(yǎng)20～25天，獲得植物愈傷組織。
(3)取所述第二種基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)咖啡酸，將培養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.5～7，然后分裝到培養(yǎng)器或生物反應(yīng)器中，經(jīng)125℃高溫，0.1Mpa壓力下消毒后進(jìn)行冷卻處理，配成液體培養(yǎng)基。
(4)將在步驟(2)中獲得的愈傷組織，用孔徑為0.5～1mm的不銹鋼網(wǎng)將愈傷組織篩分，然后接種在步驟(3)配制的液體培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置或生物反應(yīng)器中于25℃，避光或照光條件下催化合成目標(biāo)產(chǎn)物，5～10天后完成合成反應(yīng)過程；(5)收獲細(xì)胞和培養(yǎng)液提取和分離其有效成分，獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于該方法包括如下步驟1)在植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液加入0.1～4mg生長(zhǎng)素、0.1～4mg細(xì)胞分裂素，以及20～60g蔗糖或葡萄糖，調(diào)pH值在5.5～7，作為基本培養(yǎng)基；2)取所述基本培養(yǎng)基，向其中按每升培養(yǎng)液加入7～10g瓊脂或2g高效凝固劑制成固體培養(yǎng)基；將篩選出的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下培養(yǎng)，獲得植物愈傷組織；3)取所述基本培養(yǎng)基，向其中添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子，將培養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.5～7，經(jīng)滅菌消毒后配成液體培養(yǎng)基；4)將步驟2)中獲得的植物愈傷組織經(jīng)過不銹鋼網(wǎng)篩分后，接種在所述液體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下，催化合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物；5)收取細(xì)胞團(tuán)和培養(yǎng)液，并通過分離純化獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于所述植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基為Murashige & Skoog培養(yǎng)基、Miller培養(yǎng)基、Gamborg培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、Heller培養(yǎng)基、Linsmaier & Skoog培養(yǎng)基或sss培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于利用兩種不同的植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)基，按照步驟1)中所述方法配制出兩種基本培養(yǎng)基，在步驟2)和步驟3)中各選取一種基本培養(yǎng)基，用來配制固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于所述生長(zhǎng)素優(yōu)選為吲哚乙酸、α-萘乙酸或2，4二氯苯氧乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于所述細(xì)胞分裂素優(yōu)選為6-芐氨基嘌呤或激動(dòng)素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于所述促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子為苯丙氨酸、酪氨酸、甲基茉莉酮酸或咖啡酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于在步驟2)中，將篩選出的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下培養(yǎng)15～25天獲得植物愈傷組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液兩步培養(yǎng)法，其特征在于所述植物愈傷組織接種在裝有所述液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置或生物反應(yīng)器中，在20～25℃避光或照光條件下，培養(yǎng)2-10天合成目標(biāo)產(chǎn)物。
全文摘要
植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的固液兩步培養(yǎng)法，屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的技術(shù)領(lǐng)域。為了解決植物細(xì)胞生長(zhǎng)與其代謝產(chǎn)物合成具有相互抑制作用的矛盾，本發(fā)明將細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成分為兩步培養(yǎng)，包括以下步驟1)配制基本培養(yǎng)基；2)配制固體培養(yǎng)基，將篩選出的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞株系接種在所述固體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下培養(yǎng)，獲得植物愈傷組織；3)取所述基本培養(yǎng)基，向其中添加促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子，調(diào)整pH值，配成液體培養(yǎng)基；4)將植物愈傷組織接種在液體培養(yǎng)基上，在20～25℃避光或照光條件下，催化合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物；5)收取細(xì)胞團(tuán)和培養(yǎng)液，并通過分離純化獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1556201SQ20041000034
公開日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月9日
發(fā)明者郭志剛 申請(qǐng)人:清華大學(xué)