專利名稱：海南粗榧細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿方法，具體講是以植物細胞培養(yǎng)技術為手 段，通過在細胞生物反應器內(nèi)進行的海南粗榧大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿如脫氧三尖杉 酉旨喊(deoxyharringtonine)、異三尖杉酉旨喊(isoharringtonine)、三尖杉酉旨減(harringtonine) 和高三尖杉酯堿(homoharringtonine)等多種生物堿的方法。
背景技術：
海南粗榧(Ce;^a/otoxws/w!'mmera&Li)為三尖杉科植物，別名紅殼松、薄葉蓖子杉，為 多年生高大常綠喬木。是我國特有的珍稀樹種，其分布范圍極為狹窄，僅見于海南及廣東、 云南等局部地區(qū)。研究表明，海南粗榧不僅抗癌有效生物堿(如脫氧三尖杉酯堿 (deoxyharringtonine)、異三尖杉酉旨減(isoharringtonine)、三尖杉酉旨喊(harringtonine)和高三 尖杉酯堿(homoharringtonine)等多種生物堿)含量為三尖杉科中最高，而且療效最顯著， 是目前公認的最好抗癌樹種之一。不過，目前還不能通過人工方法合成脫氧三尖杉酯堿、異 三尖杉酯堿、三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等生物堿，只有依靠從海南粗榧植物材料天然提取， 所以海南粗榧原料保障就成為該藥市場的關鍵所在。但是，由于該樹種為雌雄異株、種子產(chǎn) 量和萌發(fā)率很低，再加之該樹種因材質(zhì)優(yōu)良而屢遭砍伐，加之種群數(shù)量少，是我國最重要的 珍稀瀕危植物之一，自然資源十分有限，受生態(tài)和人為破壞等因素而導致瀕臨滅絕，很難滿 足日益增長的需求。
另外，海南粗榧地上部分，特別是樹皮為提取脫氧三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖杉 酯堿和高三尖杉酯堿等生物堿的主要原料。要滿足治療一個患者，約需要2 g左右脫氧三尖 杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等生物堿；而提取1g以上生物堿約需 100-1000 kg樹干或10-100 kg樹皮，即約10-50棵約50齡海南粗榧。現(xiàn)今國際市場對脫氧 三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等生物堿年需求量為1000 kg，并且 這一需求正日益增加。依靠天然海南粗榧的有限資源已不可能滿足需求。但是直到目前為止， 雖然人們還不能全人工合成以上有效生物堿；但是人們可以以從海南粗榧提取的中間物通過 半人工合成的方法合成以上有效生物堿，但是其合成效率低下，而且由于手性特征，其生物 活性難以保證，而且成本高昂。因此，人們不得不放棄使用此類有效生物堿治療相關疾病， 轉而利用療效相對較差或具有一定毒副作用的其它藥物。所以，本發(fā)明提供了一種系統(tǒng)的從 高產(chǎn)生物堿材料選擇、外植體誘導、高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立和懸浮細胞培養(yǎng)到生物堿分離、純化等過程，實現(xiàn)了一個培養(yǎng)周期可收獲脫氧三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖 杉酯堿和高三尖杉酯堿等有效生物堿約50mg'U1的結果，為下一步通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)脫氧三 尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等有效生物堿產(chǎn)業(yè)化提供了可能與保 障；從而可以不用以天然海南粗榧為原材料提取分離有效生物堿。這對海南粗榧自然資源的 保護和開發(fā)利用具有十分重要的理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的關鍵技術問題是通過篩選海南粗榧高產(chǎn)脫氧三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、 三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等有效生物堿植株，外植體誘導，高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的 建立和懸浮細胞培養(yǎng)到生物堿分離、純化等過程，為通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)脫氧三尖杉酯堿、異 三尖杉酯堿、三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等有效生物堿產(chǎn)業(yè)化提供技術保障。這對海南粗榧 自然資源的保護和開發(fā)利用具有十分重要的理論和實踐意義。 本發(fā)明解決上述問題的技術方案包括如下步驟
(1) 高產(chǎn)有效生物堿海南粗榧植株篩選采集不同來源的海南粗榧成年植株，進行有效 生物堿含量分析，選擇含量最高植株作為外植體來源；
(2) 外植體誘導取有效生物堿含量最高植株樹皮作為外植體，用蒸餾水清洗干凈，濾 紙吸干后放入約0.5-2.0M次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌約3-8min ，然后無菌水反復沖洗3-6 次；將外植體切成約0.5 cm x0.5 cm方塊，接種于如下愈傷組織誘導培養(yǎng)基上0.5-1 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.01-0.1 mg.U1 6-BA (6-節(jié)基嘌呤)+ 0.5-1 mg-L" NAA (萘乙酸)+ 0.05-0.5 mg.L"KT (激動素)+ 0-100 mg.L"肌醇+ 0.2-0.6%瓊脂+1-5% 蔗糖十l-5c/。椰子乳,pH值5.0-6.0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期161rd—1、光照強度 2000-3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2 °C中繼續(xù)培養(yǎng)3個月(每月繼代一次，繼代時 用無菌解剖刀和無菌鑷子挑、切取帶生長旺盛愈傷組織的外植體接種到新培養(yǎng)基)，便獲得所 需愈傷組織。
(3) 高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立取愈傷組織接種到如下培養(yǎng)基里進行震蕩培養(yǎng) 0.5-1 MS + 0.01-0.1 mg.L-1 6-BA+ 0.5-1 mg'L" NAA + 0.05-0.5 mg.L-1KT + 0-100 mg.l/肌醇 + 1-5%蔗糖+1-5%椰子乳^11值5.0-6.0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期161vcT1、光照強度 2000-3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2。C，搖床轉速為60-200 rpm;繼續(xù)培養(yǎng)25-35 d后繼代1次；繼代5-10次后分別測定懸浮細胞系產(chǎn)有效生物堿效率；選擇產(chǎn)有效生物堿效 率高者為高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系。
(4) 懸浮細胞培養(yǎng)采用二段法進行懸浮細胞培養(yǎng)，即細胞株系先在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間以累積生物量，再轉入生產(chǎn)培養(yǎng)基促使細胞大量合成有效生物堿。將高產(chǎn)生物堿懸 浮細胞培養(yǎng)系經(jīng)無菌操作轉入以下生長培養(yǎng)基中pH值5.0-6.5,含碳源濃度為2-6。/。(W/V)、 無機氮源離子濃度為40-80 mM、磷酸鹽濃度為2-6mM，激素水平是2， 4-D (2, 4-二氯苯 氧乙酸)為0.5-2 mg-L-1、 6-BA為0.5-2 mg-I/1、 NAA為0.5-3 mg'L4、 KT為0.5-2 mg.lA GA (赤霉素)為0.5-2 mg丄"、ZT(反玉米素)為0.5-2.5 mg'L/1及0.5-1MS營養(yǎng)源的液體生長 培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，光照強度2000-3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2 °C，搖床及 攪拌式反應器轉速為60-250卬m，反應器的通氣量0.1-0.5 wm，培養(yǎng)25-35天后，換生產(chǎn)培 養(yǎng)基繼續(xù)懸浮培養(yǎng)；生產(chǎn)培養(yǎng)基是pH為5.0-6.0，含碳源濃度為2-4% (W/V)、無機氮源離 子濃度為30-60 mM、磷酸鹽濃度為l-3mM，激素種類及水平范圍不變，及0.5-1 MS營養(yǎng)源 的液體培養(yǎng)基，在如上所述的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)25-35天；
(5)生物堿分離與純化收獲細胞上述培養(yǎng)的細胞，研碎，氨水濕潤，加氯仿浸沒，密 閉，置搖床上振蕩24 h，濾取清液，減壓濃縮至干，甲醇溶解殘渣，進一步對細胞培養(yǎng)物中的 有效生物堿采用半制備型HPLC法進行分離純化(流動相為甲醇-乙睛-水(29 : 27 : 44 )，并 用氨水調(diào)節(jié)pH為8.5左右，流速lml/min，檢測波長290nm,柱溫:35 'C,進樣量:100uL。 用本發(fā)明的方法，可得到產(chǎn)量較高的有效生物堿，采用2L有效體積的攪拌式反應器在適宜 條件下進行兩步法培養(yǎng)50-70天，細胞生物量增至約4倍，細胞培養(yǎng)物中有效生物堿含量達 細胞干重0.08 %。最好情況可達到細胞干重的0.12%,這一結果比天然植物中含量高出約一 個數(shù)量級。
3、有益效果
本發(fā)明的有益效果是用本發(fā)明的方法，可得到產(chǎn)量較高的有效生物堿，采用2L有效
體積的攪拌式反應器在適宜條件下進行兩步法培養(yǎng)50-70天，細胞生物量增至約4倍，細胞 培養(yǎng)物中有效生物堿含量達細胞干重0.08 %。最好情況可達到細胞干重的0.12%,這一結果 比天然植物中含量高出約一個數(shù)量級。從而為解決珍稀瀕危植物海南粗榧保護與資源開發(fā)利 用提供技術保障；也為進一步探索海南粗榧的基因工程等莫定了基礎。具體實施例方式
本發(fā)明具體實施方式
下面結合實例予以闡明培養(yǎng)基中所需各種藥品試劑均可市售獲得， 按商品說明書所示常規(guī)方法配用，為行業(yè)所通用。 實施例1:
(1)高產(chǎn)有效生物堿海南粗榧植株篩選采集不同種群來源的海南粗榧成年植株約60 株，進行有效生物堿含量分析，選擇含量最高植株作為外植體來源；(2) 外植體誘導取有效生物堿含量最高植株樹皮作為外植體，用蒸餾水清洗干凈，濾 紙吸干后放入0.5^次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌8min ，然后無菌水反復沖洗3次；將外植 體切成約0.5 cm x0.5 cm方塊，接種于如下愈傷組織誘導培養(yǎng)基上0.5 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.01 mgL-1 6-BA(6-節(jié)基嘌呤H 0.5 mg'!/1 NAA(萘乙酸)+ 0.05 mg'U1 KT(激動素)+0.2Q/。瓊脂+1%蔗糖+1%椰子乳^11值5,0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16 h-d—1、光照強度2000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2'C中繼續(xù)培養(yǎng)3個月(每月繼代一 次)，便獲得所需愈傷組織；
(3) 高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立:取愈傷組織接種到如下培養(yǎng)基里進行震蕩培養(yǎng): 0.5 MS + 0.01 rng'U1 6-BA + 0.5 mg七-1 NAA + 0.05 mg'l/1 KT + 1%蔗糖+ 1%椰子乳，pH值 5.0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h'cT1、光照強度2000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 士2'C，搖床轉速為60ipm;繼續(xù)培養(yǎng)約25d后繼代l次；繼代5次后分別測定懸浮細胞 系產(chǎn)有效生物堿效率；選擇產(chǎn)有效生物堿效率高者為高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系；
(4) 懸浮細胞培養(yǎng)將高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系經(jīng)無菌操作轉入以下培養(yǎng)基中pH 值5.0,含碳源濃度為2% (W/V)、無機氮源離子濃度為40mM、磷酸鹽濃度為2mM,激素 水平是2， 4-D(2， 4-二氯苯氧乙酸)為0.5 mgi;1、 6-BA為0.5 mg'L'1、 NAA為0.5 mg'I/1、 KT為0.5 mg'i;1、 GA(赤霉素)為0.5 mg丄-1、 ZT(反玉米素)為0.5 tng'I/1及0.5 MS營養(yǎng)源的液 體生長培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，光照強度2000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2。C，搖床及 攪拌式反應器轉速為60rpm，反應器的通氣量O.l wm，培養(yǎng)25d后，換生產(chǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)懸 浮培養(yǎng)；生產(chǎn)培養(yǎng)基是pH為5.0,含碳源濃度為2% (W/V)、無機氮源離子濃度為30mM、 磷酸鹽濃度為lmM，激素種類及水平范圍不變，同時還含有0.5MS營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基， 在如上所述的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)25 d;
(5) 生物堿分離與純化收獲細胞上述培養(yǎng)的細胞，研碎，氨水濕潤，加氯仿浸沒，密 閉，置搖床上振蕩24 h,濾取清液，減壓濃縮至干，甲醇溶解殘渣，進一步對細胞培養(yǎng)物中的 有效生物堿采用半制備型HPLC法進行分離純化(流動相為甲醇-乙睛-水(29:27:44)，并 用氨水調(diào)節(jié)pH為8.5左右，流速lmWmin，檢測波長290 nm ,柱溫:35 °C,進樣量:100y L,細胞培養(yǎng)物中有效生物堿含量達細胞干重0.07% 。
實施例2:
(1) 高產(chǎn)有效生物堿海南粗榧植株篩選采集不同種群來源的海南粗榧成年植株約60 株，進行有效生物堿含量分析，選擇含量最高植株作為外植體來源；
(2) 外植體誘導取有效生物堿含量最高植株樹皮作為外植體，用蒸餾水清洗干凈，濾
6紙吸干后放入2.0X次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌3min ，然后無菌水反復沖洗6次；將外植 體切成約0.5 cm x0.5 cm方塊，接種于如下愈傷組織誘導培養(yǎng)基上1 MS(Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基)+ 0.1 mg'L-1 6-BA (6-節(jié)基嘌呤)十1 mg-U1 NAA (萘乙酸)+ 0.5 mg-L" KT (激 動素)+10011^丄-1肌醇+0.6%瓊月旨+5%蔗糖+5%椰子乳,？11值6.0;暗培養(yǎng)2d后再置 于光照周期16 h《1、光照強度3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2'C中繼續(xù)培養(yǎng)3個 月(每月繼代一次)，便獲得所需愈傷組織；
(3) 高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立取愈傷組織接種到如下培養(yǎng)基里進行震蕩培養(yǎng)
1 MS + 0.1 mg.L" 6-BA + 1 mg-L1 NAA + 0.5 mg-I/1 KT + 100 mg.L-1肌醇+ 5%蔗糖+ 5%椰 子乳,pH值6.0;暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h'd人光照強度3000 Lux的冷光燈下、 環(huán)境溫度25士2-C，搖床轉速為200rpm;繼續(xù)培養(yǎng)約35d后繼代l次；繼代10次后分別 測定懸浮細胞系產(chǎn)有效生物堿效率；選擇產(chǎn)有效生物堿效率高者為高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng) 系；
(4) 懸浮細胞培養(yǎng)將高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系經(jīng)無菌操作轉入以下培養(yǎng)基中pH 值6.5，含碳源濃度為6% (W/V)、無機氮源離子濃度為80mM、磷酸鹽濃度為6mM，激素 水平是2， 4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸)為2mg'I/1、 6-BA為2 mg'U1 、 NAA為3 mg.lA KT為
2 mg丄—1、 GA(赤霉素)為2 ing'U1、 ZT(反玉米素)為2.5 mg七—1及1 MS營養(yǎng)源的液體生長培養(yǎng) 基進行懸浮培養(yǎng)，光照強度3000 Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25士2'C，搖床及攪拌式反應 器轉速為250rpm,反應器的通氣量0.5 wm,培養(yǎng)35d后，換生產(chǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)懸浮培養(yǎng)；生 產(chǎn)培養(yǎng)基是pH為6.0，含碳源濃度為4% (W/V)、無機氮源離子濃度為60mM、磷酸鹽濃 度為3mM，激素種類及水平范圍不變，同時還含有1MS營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基，在如上所述 的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)35d;
(5) 生物堿分離與純化生物堿分離與純化收獲細胞上述培養(yǎng)的細胞，研碎，氨水濕 潤，加氯仿浸沒，密閉，置搖床上振蕩24h,濾取清液，減壓濃縮至干，甲醇溶解殘渣，進一步 對細胞培養(yǎng)物中的有效生物堿采用半制備型HPLC法進行分離純化(流動相為甲醇-乙睛-水
(29:27:44)，并用氨水調(diào)節(jié)pH為8.5左右，流速lml/min，檢測波長290 nm ,柱溫:35 'C,進樣量:100PL,細胞培養(yǎng)物中有效生物堿含量達細胞干重0.10%。
按本發(fā)明的技術方法實施，培養(yǎng)基中成分相對比例差異會導致有效生物堿生產(chǎn)效率的差 異，總的說，數(shù)值越接近最佳值，實施結果越理想。
權利要求
1、海南粗榧細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿的方法，其特征在于按照下述步驟進行(1)高產(chǎn)有效生物堿海南粗榧植株篩選采集不同來源的海南粗榧成年植株，進行有效生物堿含量分析，選擇含量最高植株作為外植體來源；(2)外植體誘導取有效生物堿含量最高植株樹皮作為外植體，用蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干后放入0.5-2.0％次氯酸鈉溶液中真空抽濾滅菌3-8min，然后無菌水反復沖洗3-6次；將外植體切成約0.5cm×0.5cm方塊，接種于如下愈傷組織誘導培養(yǎng)基上0.5-1 Murashige andSkoog Stock培養(yǎng)基+0.01-0.1mg·L-1 6-芐基嘌呤+0.5-1mg·L-1萘乙酸+0.05-0.5mg·L-1激動素+0-100mg·L-1肌醇+0.2-0.6％瓊脂+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h·d-1、光照強度2000-3000Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25±2℃中繼續(xù)培養(yǎng)3個月，每月繼代一次，繼代時用無菌解剖刀和無菌鑷子挑、切取帶生長旺盛愈傷組織的外植體接種到新培養(yǎng)基，便獲得所需愈傷組織；(3)高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立取愈傷組織接種到如下培養(yǎng)基里進行震蕩培養(yǎng)0.5-1 Murashige and Skoog Stock培養(yǎng)基+0.01-0.1mg·L-1 6-芐基嘌呤+0.5-1mg·L-1萘乙酸+0.05-0.5mg·L-1激動素+0-100 mg·L-1肌醇+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h·d-1、光照強度2000-3000Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25±2℃，搖床轉速為60-200rpm；繼續(xù)培養(yǎng)25-35d后繼代1次；繼代5-10次后分別測定懸浮細胞系產(chǎn)有效生物堿效率；選擇產(chǎn)有效生物堿效率高者為高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系；(4)懸浮細胞培養(yǎng)采用二段法進行懸浮細胞培養(yǎng)，即細胞株系先在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間以累積生物量，再轉入生產(chǎn)培養(yǎng)基促使細胞大量合成有效生物堿，將高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系經(jīng)無菌操作轉入以下生長培養(yǎng)基中pH值5.0-6.5，含碳源濃度以質(zhì)量與體積計為2-6％、無機氮源離子濃度為40-80mM、磷酸鹽濃度為2-6mM，激素水平是2，4-二氯苯氧乙酸為0.5-2mg·L-1、6-芐基嘌呤為0.5-2mg·L-1、萘乙酸為0.5-3mg·L-1、激動素為0.5-2mg·L-1、赤霉素為0.5-2mg·L-1、反玉米素為0.5-2.5mg·L-1及0.5-1 Murashige and Skoog Stock營養(yǎng)源的液體生長培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，光照強度2000-3000Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25±2℃，搖床及攪拌式反應器轉速為60-250rpm，反應器的通氣量0.1-0.5vvm，培養(yǎng)25-35天后，換生產(chǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)懸浮培養(yǎng)；生產(chǎn)培養(yǎng)基是pH為5.0-6.0，含碳源濃度為以質(zhì)量與體積計2-4％、無機氮源離子濃度為30-60mM、磷酸鹽濃度為1-3mM，激素種類及水平范圍不變，及0.5-1 Murashige and Skoog Stock營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基，在如上所述的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)25-35天；(5)生物堿分離與純化收獲細胞上述培養(yǎng)的細胞，研碎，氨水濕潤，加氯仿浸沒，密閉，置搖床上振蕩24h，濾取清液，減壓濃縮至干，甲醇溶解殘渣，進一步對細胞培養(yǎng)物中的有效生物堿采用半制備型HPLC法進行分離純化(流動相為甲醇-乙睛-水(29∶27∶44)，并用氨水調(diào)節(jié)pH為8.5左右，流速1ml/min，檢測波長290nm，柱溫35℃，進樣量100μL。
全文摘要
海南粗榧細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿的方法，涉及一種植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿方法。按照下述步驟進行(1)高產(chǎn)有效生物堿海南粗榧植株篩選；(2)外植體誘導；(3)高產(chǎn)生物堿懸浮細胞培養(yǎng)系的建立；(4)二段法進行懸浮細胞培養(yǎng)；(5)生物堿分離與純化。本發(fā)明可得到產(chǎn)量較高的有效生物堿，采用2L有效體積的攪拌式反應器在適宜條件下進行兩步法培養(yǎng)50-70天，細胞生物量增至約4倍，細胞培養(yǎng)物中有效生物堿含量達細胞干重0.08％。最好情況可達到細胞干重的0.12％，這一結果比天然植物中含量高出約一個數(shù)量級。從而為解決珍稀瀕危植物海南粗榧保護與資源開發(fā)利用提供技術保障；也為進一步探索海南粗榧的基因工程等莫定了基礎。
文檔編號C12P17/18GK101629193SQ200910184210
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權日2009年8月14日
發(fā)明者宋經(jīng)元, 戴志聰, 杜道林, 王有生, 祁珊珊, 符文英, 魏建和 申請人:江蘇大學