幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbp21及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將（a）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的由其衍生的蛋白質(zhì)；（c）將（a）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性，可用于純化或輔助鑒定幾丁質(zhì)，且該蛋白質(zhì)具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶的催化活性的作用，可以協(xié)助幾丁質(zhì)酶高效降解幾丁質(zhì)。綜上所述，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值，將產(chǎn)生具有的工業(yè)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]幾丁質(zhì)又名甲殼素、幾丁聚糖，是N-乙酰_β-D-葡萄糖胺(Ν-Acetyl-β-D-Glucosamine,簡(jiǎn)稱GlcNAc)以β-1, 4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物,是一種類似于植物纖維的六碳糖聚合體。其廣泛存在于低等植物、菌類、藻類、節(jié)肢動(dòng)物(蝦、蟹)及昆蟲的外殼和軟骨、高等植物的細(xì)胞壁等，是自然界中僅次于纖維素的第二大天然生物有機(jī)資源，年生物合成量達(dá)100億噸。
[0003]幾丁質(zhì)酶(EC.3.2.14)能將幾丁質(zhì)β -1, 4糖苷鍵水解，最終分解為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)。根據(jù)作用方式和酶解產(chǎn)物，將其分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和幾丁二糖酶。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)鏈的任一部位切割，產(chǎn)生幾丁質(zhì)寡聚糖，如(GlcNAc)2,(GlcNAc) 3等。外切 幾丁質(zhì)酶又稱N-乙酰-β -D-葡萄糖胺酶，此酶從幾丁質(zhì)寡糖或幾丁質(zhì)鏈的非還原末端依次切下N-乙酰-β -葡萄糖單體。幾丁二糖酶則是專一性地將幾丁二糖降解為幾丁單糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21及其編碼基因和應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為CBP21蛋白，獲自粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，為如下(a)或(b)或(C): (a)由序列表的序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的由其衍生的蛋白質(zhì)；(C)將(a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明還保護(hù)具有所述CBP21蛋白的融合蛋白。所述融合蛋白為如下(d)或(e)或(f):(d)由序列表的序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)將(d)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的由其衍生的蛋白質(zhì)；(f)將(d)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0007]編碼所述CBP21蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼所述CBP21蛋白的基因可為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)所述的DNA分子:(I)序列表的序列2自5’末端第I至519位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子；(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子；(5)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子；(6)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在 6XSSC，0.5%SDS 的溶液中，在 65°C下雜交，然后用 2XSSC,0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0008]編碼所述融合蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼所述融合蛋白的基因可為如下(7)或(8)或(9)或(10)或(11)或(12)所述的DNA分子:(7)序列表的序列4自5’末端第I至660位核苷酸所示的DNA分子；(8)序列表的序列4所示的DNA分子；(9)在嚴(yán)格條件下與(7)或(8)限定的DNA序列雜交且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子；(10)與(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子；(11)在嚴(yán)格條件下與(7)或(8)限定的DNA序列雜交且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子；(12)與(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在 6XSSC，0.5%SDS 的溶液中，在 65°C下雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0009]含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]本發(fā)明還保護(hù)所述CBP21蛋白或所述融合蛋白的應(yīng)用，為如下(I )或(II)或(III)或(VI):( I )制備具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的功能的產(chǎn)品；(II)制備具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活的功能產(chǎn)品；(III)檢測(cè)或純化幾丁質(zhì)；(VI)促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活。所述幾丁質(zhì)酶可為ChiCD3蛋白或Chi92蛋白。
[0011]本發(fā)明還保護(hù)一種具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活的功能的產(chǎn)品和/或具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的功能的產(chǎn)品，包括所述CBP21蛋白或所述融合蛋白。所述幾丁質(zhì)酶可為ChiCD3蛋白或Chi92蛋白。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)一種用于降解幾丁質(zhì)的產(chǎn)品，包括幾丁質(zhì)酶和促進(jìn)劑；所述促進(jìn)劑為所述CBP21蛋白或所述融合蛋白。所述幾丁質(zhì)酶可為ChiCD3蛋白或Chi92蛋白。
[0013]所述Chi⑶3蛋白為如下(i)或(ii)或(iii):( i)序列表中序列7自N末端第34至1019位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(ii)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(iii)將(i )或(?)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質(zhì)酶功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0014]所述Chi92蛋白為如下(iv)或(v):(iv)由序列表中序列9所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(V )將序列表中序列9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質(zhì)酶活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0015]以上任一所述的幾丁質(zhì)具體可為蝦殼粉。
[0016]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性，可用于純化或輔助鑒定幾丁質(zhì)，且該蛋白質(zhì)具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶的催化活性的作用，可以協(xié)助幾丁質(zhì)酶高效降解幾丁質(zhì)。綜上所述，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值，將產(chǎn)生具有的工業(yè)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0018]圖2為CBP21蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE圖譜。
[0019]圖3為實(shí)施例3的結(jié)果。[0020]圖4為實(shí)施例4的步驟三的結(jié)果。
[0021]圖5為實(shí)施例4的步驟四的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0023]粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens):廣東省菌株保藏中心。質(zhì)粒pPET_28a(+):Novagen, Madison, USA。大腸桿菌BL21 (DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國。
[0024]氣單胞菌(Aeromonas sp.),菌株名稱為B565,已于2010年12月03日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.4403。氣單胞菌(Aeromonas sp.) B565CGMCC N0.4403 簡(jiǎn)稱氣單胞菌 B565。
[0025]畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115、pPIC9 載體均購自 Invitrogen 公司。DNA 回收試劑盒為TakaRa公司產(chǎn)品。
[0026]BMGY培養(yǎng)基:酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、酵母氮源(YNB) 13.4g/L、生物素4X10_4g/L、甘油10mL/L，其余為水。
[0027]BMMY培養(yǎng)基:酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、酵母氮源(YNB) 13.4g/L、生物素4X 10_4g/L、甲醇0.5% (體積百分含量),其余為水。
[0028]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法:用pH7.0,0.lmol/L的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液將N-乙酰氨基葡萄糖配成不同濃度的溶液，將0.5mL各個(gè)溶液(N-乙酰氨基葡萄糖的含量分別為
5.5 μ mol、7.1 μ mo I >8.3 μ mol、10.0 μ mol、12.5 μ mo I 或 16.7 μ mol)分別與 ImL DNS 溶液混合后沸水浴5min顯色,然后用蒸懼水補(bǔ)齊至2.5mL,冷卻至室溫后在540nm測(cè)定OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見圖1。
[0029]蝦殼粉的制備方法:(I)取鮮活的南美白對(duì)蝦，剝離蝦殼，將蝦殼洗凈、過夜干燥、打?yàn)榉勰┎⑦^篩，收集粒度為30目篩至100目篩之間的粉末；(2)用5%HC1水溶液浸泡步驟(I)得到的粉末a (去除Ca2+)，水洗至中性，過夜干燥；(3)用10%Na0H水溶液浸泡步驟
(2)得到的粉末，沸水浴2h (去除蛋白)，水洗至中性，過夜干燥，得到的粉末即為蝦殼粉(又稱蝦殼幾丁質(zhì))。
[0030]實(shí)施例1、CBP21蛋白溶液的制備
[0031]一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0032]1、重組質(zhì)粒CBP21_pPET28a的構(gòu)建
[0033](I)合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子(編碼序列表的序列I所示的蛋白質(zhì))。
[0034](2)以步驟(I)合成的雙鏈DNA分子為模板，用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0035]Fl:5’ -GGAGAATTC GCGAATGCTCACGGTTATGTCG-3’ ；
[0036]Rl:5’ -GGAGCGGCCGC TTTACTCAGGTTGACGTCGATC-3’。[0037](3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0038](4)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切質(zhì)粒pPET_28a(+)，回收約5300bp的載體骨架。
[0039](5)將步驟(3)的酶切產(chǎn)物和步驟(4)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒CBP21-pPET28a。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒CBP21_pPET28a進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在質(zhì)粒pPET-28a(+)的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒CBP21-pPET28a中，外源片段與載體骨架上的部分片段融合，形成序列表的序列4所不的融合基因，表達(dá)序列表的序列3所不的融合蛋白。
[0040]2、對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建
[0041](I)合成序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子(編碼序列表的序列5所示的蛋白質(zhì))。
[0042](2)以步驟(I)合成的雙鏈DNA分子為模板，用F2和R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0043]F2:5’ -GGAGAATTCGCGAATGCCCACGGTTATGTCG-3’ ；
[0044]R2:5， -GGAGCGGCCGCTTTGCTCAGGTTGACGTCGATCG-3，。
[0045](3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0046](4)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切質(zhì)粒pPET_28a(+)，回收約5300bp的載體骨架。
[0047](5)將步驟(3)的酶切產(chǎn)物和步驟(4)的載體骨架連接，得到對(duì)照質(zhì)粒。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在質(zhì)粒pPET-28a(+)的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。
[0048]二、CBP21蛋白溶液的制備
[0049]1、將重組質(zhì)粒CBP21_pPET28a導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌。
[0050]2、將步驟I得到的重組菌接種于20mL含100 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，得到種子液。
[0051]3、將4mL種子液轉(zhuǎn)接至200mL含100 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm=0.6時(shí)加入IPTG并使其濃度為lmol/L，20°C、180rpm振蕩培養(yǎng)12h (從加入IPTG開始計(jì)時(shí))。
[0052]4、取步驟3得到的培養(yǎng)體系，IOOOOrpm離心IOmin,收集細(xì)胞沉淀。
[0053]5、將步驟4得到的細(xì)胞沉淀用pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液重懸，超聲破碎(超聲頻率為250w ；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)工作3s停6s),然后IOOOOrpm離心IOmin,收集上清液。
[0054]6、將步驟5得到的上清液親和層析。
[0055]親和層析的填充物為N1-NTA樹脂，購自上海生工生物工程公司(產(chǎn)品目錄號(hào)BSP033)，裝柱量為lmL。
[0056]洗脫過程中的各個(gè)緩沖液如下(pH均為7.6):
[0057]NTA-O:含 20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油，其它為水；
[0058]NTA-20:含 20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油，其它為水；
[0059]NTA-40:含 20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油，其它為水；
[0060]NTA-60:20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其它為水；
[0061]NTA-80:20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其它為水；
[0062]NTA-100:20mmol/L Tris-HCl，lOOmmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其它為水；
[0063]NTA-200:20mmol/L Tris-HCl，200mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其它為水；
[0064]NTA-300:20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其它為水。
[0065]洗脫過程(每次加5mL，完全流出柱子后再加5mL):
[0066](I)柱子用水平衡20mL ；
[0067](2 )用NTA-O平衡20mL，上樣5mL步驟5得到的上清液；
[0068](3)用 NTA-O 洗脫 25mL (去雜蛋白)，然后依次用 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA_80、NTA-100、NTA-200、NTA-300各5mL進(jìn)行洗脫，收集NTA-40至NTA-80洗脫的過柱后溶液，即為CBP21蛋白溶液。
[0069]三、對(duì)照蛋白溶液的制備
[0070]用對(duì)照質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒CBP21_pPET28a進(jìn)行步驟二，得到對(duì)照蛋白溶液。
[0071]四、CBP21蛋白溶液和對(duì)照蛋白溶液的蛋白濃度比較
[0072]將CBP21蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，得到預(yù)期分子量大小的條帶，見圖2。切取目標(biāo)條帶，送天津生物芯片技術(shù)有限公司進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果表明該目標(biāo)條帶為序列表的序列3所不的融合蛋白。
[0073]采用考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定CBP21蛋白溶液和對(duì)照蛋白溶液中的蛋白質(zhì)濃度。CBP21蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度為2.028mg/ml。對(duì)照蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度為0.238mg/ml。
[0074]五、對(duì)照溶液的制備
[0075]用質(zhì)粒pPET_28a (+)代替重組質(zhì)粒CBP21_pPET28a進(jìn)行步驟二，得到對(duì)照溶液。
[0076]實(shí)施例2、CBP21蛋白的幾丁質(zhì)酶酶活
[0077]1%膠體幾丁質(zhì)的制備:在4°C下，取IOg幾丁質(zhì)放入研缽中，加丙酮40mL研磨IOmin,邊研磨邊緩緩加入冷濃HC1400mL，充分研磨，使呈糊狀；4°C放置24h后用玻璃棉過濾，將濾液緩緩加入到盛有2000ml50% (體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液的燒杯中,邊加邊劇烈攪拌，然后靜置，待膠態(tài)幾丁質(zhì)析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)；用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾丁質(zhì)至pH7.0,以蒸懼水定容至1000ml,冷藏備用。
[0078]酶活測(cè)定(采用DNS比色法測(cè)還原糖含量):取4支試管，每支加入0.25mL實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液和0.25mLl%膠體幾丁質(zhì)，其中三支試管于50°C水浴lh(樣品管)，另外一支于4°C放置(對(duì)照管);水浴Ih后，在樣品管和對(duì)照管中各加入2mLDNS溶液，沸水浴5min,離心(12000rpm,3min)取上清液,在540nm測(cè)定其OD值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算酶活。[0079]CBP21蛋白本身不具有幾丁質(zhì)酶酶活。
[0080]實(shí)施例3、CBP21蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力
[0081]CBP21蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力的測(cè)定:將蝦殼粉加至EP管(蝦殼粉設(shè)置0.0lg、
0.025g和0.05g三種加入量，每種加入量設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理)，每個(gè)EP管加入500 μ I實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液，渦旋混勻，27°C靜置lh，12000rpm離心lOmin，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)上清液中的蛋白濃度(Cl);采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液的蛋白濃度(C2) ；CBP21蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合活性=(C2-C1) +C2X100%。
[0082]結(jié)合活性的結(jié)果見圖3。
[0083]用實(shí)施例1制備的對(duì)照溶液代替實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液進(jìn)行上述步驟，對(duì)于不同量的蝦殼粉，結(jié)合活性均為O。
[0084]實(shí)施例4、CBP21蛋白對(duì)幾丁質(zhì)酶的酶活的促進(jìn)作用
[0085]一、Chi⑶3蛋白的制備及純化
[0086]1、采用北京天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取氣單胞菌B565的基因組DNA。
[0087]2、以步驟I提取的基 因組DNA為模板，用F3和R3組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0088]F4:5，-GTGTACGTACAGGCCGCTTATCCCGCCTATAAATC-3> ；
[0089]R4:5’ -GGAGCGGCCGCATAGCTACAGGCAGACTTCCAGCTG-3’。
[0090]3、用限制性內(nèi)切酶SnaBI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0091]4、用限制性內(nèi)切酶SnaBI和NotI雙酶切pPIC9載體，回收載體骨架(約9000bp)。
[0092]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒chi⑶3-pPIC9。根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)重組質(zhì)粒chi⑶3-pPIC9進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pPIC9載體的SnaBI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列8自5’末端第100至3057位核苷酸所示的DNA得到的重組質(zhì)粒。序列表的序列8所不的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列7所不的蛋白質(zhì)(ChiCD3蛋白，自N末端第I至33位氨基酸殘基為信號(hào)肽)。
[0093]6、將重組質(zhì)粒chi⑶3-pPIC9轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，得到重組畢赤酵母。
[0094]7、將步驟6得到的重組畢赤酵母接種于裝有200mL BMGY培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶，搖床培養(yǎng)48h (30°C、220Xg)，得到培養(yǎng)液(0D600約為2.0)。
[0095]8、取步驟7的培養(yǎng)液，5000 Xg離心5min，取沉淀(盡量將上清除盡)。
[0096]9、在步驟8的沉淀中加入IOOmL BMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h (30°C、220X g);為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，菌液中每隔12h補(bǔ)加甲醇，使菌液中的甲醇的體積百分含量保持在
0.5%) ο
[0097]10、取步驟9的培養(yǎng)液，13400Xg離心lOmin，取上清。
[0098]11、將步驟10得到的上清(TC下進(jìn)行硫酸銨沉淀:先進(jìn)行50%硫酸銨沉淀(即采用50%溶解度的硫酸銨)，棄去沉淀，收集上清液；上清液進(jìn)行80%硫酸銨沉淀(即采用80%溶解度的硫酸銨)，收集沉淀；沉淀重懸于0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH5.0)中(沉淀:緩沖液=1: 10 ;體積比)，即為粗蛋白液。
[0099]12、將粗蛋白液進(jìn)行分子篩層析[0100]柱長60cm,內(nèi)徑 1.6cm,填充介質(zhì)為 Sephacryl S-100HR ；
[0101]洗脫液為含有0.3mol/L NaCl的0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸(pH5.0)緩沖液，連續(xù)收集20管(每管1.5毫升)，將第5管至第9管合并，即為純化后的蛋白液(Chi⑶3蛋白液)。
[0102]將Chi⑶3蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明，電泳顯示單一條帶，分子量約為IlOkDa,與預(yù)測(cè)分子量相近。切取目標(biāo)條帶，送天津生物芯片技術(shù)有限公司進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果表明該目標(biāo)條帶為去除信號(hào)肽后的ChiCD3蛋白。
[0103]二、Chi92蛋白的制備及純化
[0104]1、提取氣單胞菌B565的基因組DNA。
[0105]2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，用F4和R4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0106]F4:5，-GGAGA ATTCGCGGCGCCCGGCAAGCC-3，
[0107]R4:5’ -GGAGCGGCCGCTTATTTACAACTGGCGGCTCCCACATCCTG-3’
[0108]3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0109]4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切pPIC9載體，回收約9.3kb的載體骨架。
[0110]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在PPIC9載體的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列10自5’末端第70-2595位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。序列10自5’末端第70-2595位核苷酸所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列9所示的蛋白質(zhì)(Chi92蛋白)。
[0111]5、將步驟4構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115的感受態(tài)細(xì)胞，得到重組畢赤酵母。
[0112]6、將步驟5得到的重組畢赤酵母接種于裝有200mL BMGY液體培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶，30°C、250-280rpm振蕩培養(yǎng)2天，4500rpm離心5min，取沉淀(盡量將上清除盡)；向沉淀中加入IOOmL BMMY液體培養(yǎng)基，30°C、250-280rpm振蕩培養(yǎng)48h，每12h補(bǔ)加甲醇，使培養(yǎng)體系中的甲醇濃度達(dá)到0.5% (體積比)，離心收集上清液。
[0113]7、在0°C下，將步驟6得到的上清液采用IOkDa膜包進(jìn)行濃縮，然后以去離子水作為透析液進(jìn)行透析，最后冷凍干燥，得到干粉。
[0114]8、取步驟7得到的干粉，溶于去離子水后進(jìn)行SDS-PAGE，顯示分子量約為92kDa的單一條帶，與預(yù)測(cè)分子量相近。切取目標(biāo)條帶，送天津生物芯片技術(shù)有限公司進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果表明該目標(biāo)條帶為Chi92蛋白。
[0115]三、CBP21蛋白對(duì)Chi⑶3蛋白的酶活的促進(jìn)作用
[0116]試驗(yàn)組:取3支試管，每支加入0.25mL Chi⑶3蛋白溶液(蛋白濃度為0.0195mg/ml),0.25mL實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液(蛋白濃度為2.028mg/ml)和0.1g蝦殼粉，40°C水浴Ih后每管加入2mL DNS溶液,沸水浴5min,離心(12000rpm, 3min)取上清液,在540nm測(cè)定其OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計(jì)算酶活。
[0117]對(duì)照組:取3支試管，每支加入0.25mL Chi⑶3蛋白溶液(蛋白濃度為0.0195mg/ml),0.25mL NTA-200和0.1g蝦殼粉，40°C水浴Ih后每管加入2mL DNS溶液，沸水浴5min，離心(12000rpm,3min)取上清液,在540nm測(cè)定其OD值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計(jì)算酶活。
[0118]將實(shí)驗(yàn)組的酶活作為100%，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的相對(duì)酶活。[0119]結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，CBP21蛋白對(duì)Chi⑶3蛋白作為幾丁質(zhì)酶的酶活具有極顯著的促進(jìn)作用。
[0120]用實(shí)施例1制備的對(duì)照溶液等體積代替實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液進(jìn)行上述步驟，對(duì)照溶液對(duì)ChiCD3蛋白作為幾丁質(zhì)酶的酶活不具有任何促進(jìn)作用。
[0121]四、CBP21蛋白對(duì)Chi92蛋白的酶活的促進(jìn)作用
[0122]用蛋白濃度為0.0529mg/ml的Chi92蛋白溶液代替ChiCD3蛋白溶液，其它同步驟
三
[0123]結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，CBP21蛋白對(duì)Chi92蛋白作為幾丁質(zhì)酶的酶活具有及其顯著的促進(jìn)作用。
[0124]用實(shí)施例1制備的對(duì)照溶液等體積代替實(shí)施例1制備的CBP21蛋白溶液進(jìn)行上述步驟，對(duì)照溶液對(duì)ChiCD3蛋白作 為幾丁質(zhì)酶的酶活不具有任何促進(jìn)作用。
【權(quán)利要求】
1.CBP21蛋白或具有所述CBP21蛋白的融合蛋白；所述CBP21蛋白為如下(a)或(b)或(C): Ca)由序列表的序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將(a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的由其衍生的蛋白質(zhì)； (c)將(a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白為如下(d)或(e)或(f): (d)由序列表的序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Ce)將(d)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的由其 衍生的蛋白質(zhì)； Cf)將(d)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
3.編碼權(quán)利要求1所述CBP21蛋白的基因或編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:編碼權(quán)利要求1所述CBP21蛋白的基因?yàn)槿缦?I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)所述的DNA分子: (1)序列表的序列2自5’末端第I至519位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表的序列2所不的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子； (5)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子； (6)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子。
5.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因?yàn)槿缦?7)或(8)或(9)或(10)或(11)或(12)所述的DNA分子: (7)序列表的序列4自5’末端第I至660位核苷酸所示的DNA分子； (8)序列表的序列4所不的DNA分子； (9)在嚴(yán)格條件下與(7)或(8)限定的DNA序列雜交且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子； (10)與(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的特性的蛋白的DNA分子； (11)在嚴(yán)格條件下與(7)或(8 )限定的DNA序列雜交且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子； (12)與(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活功能的蛋白的DNA分子。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.權(quán)利要求1所述CBP21蛋白或權(quán)利要求1所述融合蛋白的應(yīng)用，為如下(I)或(II)或(ΠΙ)或(VI): (I )制備具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的功能的產(chǎn)品；(II)制備具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活的功能產(chǎn)品；(III)檢測(cè)或純化幾丁質(zhì)；(VI)促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活。
8.一種具有促進(jìn)幾丁質(zhì)酶酶活的功能的產(chǎn)品和/或具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的功能的產(chǎn)品，包括權(quán)利要求1所述CBP21蛋白或權(quán)利要求1所述融合蛋白。
9.一種用于降解幾丁質(zhì)的產(chǎn)品，包括幾丁質(zhì)酶和促進(jìn)劑；所述促進(jìn)劑為權(quán)利要求1所述CBP21蛋白或權(quán)利要求 1所述融合蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103450352SQ201310388723
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】周志剛, 霍鳳敏, 楊雅麟, 徐俐, 何夙旭, 余強(qiáng), 張美超, 李歡琴 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所